毛楊柳，常振宇，丁麗華，劉婕，葉棋濃

1.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京100850；2.解放軍總醫(yī)院 肝膽外二科，北京100853

腫瘤血管系統(tǒng)的形成對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移有著十分重要的作用[1-3]。血管形成的很大一部分原因是由于血管內(nèi)皮細胞的生成與增殖，沒有血管內(nèi)皮細胞生成和增殖，就很難形成腫瘤，也無法轉(zhuǎn)移[4-5]。傳統(tǒng)觀念認為腫瘤新生血管的內(nèi)皮細胞是由骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞分化形成的[6-9]，但最近的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞也具有向血管內(nèi)皮細胞分化的能力[10-13]。因此，內(nèi)皮細胞的發(fā)生及鑒定是研究腫瘤細胞發(fā)生、分化與轉(zhuǎn)移的重要手段之一。

目前，鑒定內(nèi)皮細胞的方法主要是通過內(nèi)皮細胞的特異性標志物和內(nèi)皮細胞的功能進行檢測。已知的內(nèi)皮細胞特異性標志物有CD31、CD105、VEGFR2 等，通過Q-PCR、流式細胞技術(shù)、Western 印跡、免疫熒光等技術(shù)檢測內(nèi)皮細胞特異性標志物的表達情況；另外可以通過成管實驗檢測內(nèi)皮細胞的功能。血小板內(nèi)皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule- 1，

PECAM-1/CD31）是黏附分子免疫球蛋白超家族成員，可能參與腫瘤細胞黏附于內(nèi)皮細胞并促進腫瘤血管形成的過程[14]。我們將在內(nèi)皮細胞中特異性表達的CD31 的啟動子插入融合表達綠色熒光蛋白和螢光素酶的載體，轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，由此為內(nèi)皮細胞的鑒定提供新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC、BEND3、MCF7細胞，大腸桿菌DH5α，載體pGL4和pCDH-coGFP由本實驗室保存；KpnⅠ與XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR試劑、DNA聚合酶、高保真Pfu酶購自TaKaRa公司；DMEM為本實驗室自配；新生牛血清由浙江天杭生物有限公司生產(chǎn)；高效真核轉(zhuǎn)染試劑盒Lipo2000購自Invitrogen公司；PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 從基因組釣取CD31啟動子

根據(jù)人CD31啟動子序列設計上游引物（5′-GGGGTACCGCCCAGCCGTTAATTCTATTCT-3′）和下游引物（5′-CCGCTCGAGAAGCTTCGATGCTCA TGGAG-3′），并在上、下游引物的5′端分別添加KpnⅠ與XhoⅠ酶切位點，以cDNA為模板進行擴增（反應條件：94℃1min，以94℃ 70 s、65℃40s、70℃ 1 min進行35個循環(huán)，72℃ 5 min）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，條帶位置特異后，膠回收得到CD31 啟動子片段。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ與XhoⅠ將PCR 產(chǎn)物、pGL4 載體和pCDH-coGFP 載體進行酶切，酶切后的產(chǎn)物分別與pGL4 和pCDH-copGFP 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)并克隆擴大培養(yǎng)，挑取單克隆提取質(zhì)粒，用KpnⅠ與XhoⅠ雙酶切鑒定并測序。

1.4 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞

用含1%雙抗及10%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將BEND3、HUVEC、MCF7 細胞分別接種于24孔板中，接種量為轉(zhuǎn)染時70%～80%最佳，轉(zhuǎn)染前1h更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基。將0.5 μL/孔VigoFect與250μL/孔NaCl 混合，靜置5 min，在此期間將1.5 μg/孔的pGL4-CD31promotor-Lucif?erase 質(zhì)粒與250 μL/孔的NaCl混合，然后再將2種溶液混勻，室溫靜置15 min 后逐滴加入24 孔板中；以相同方法轉(zhuǎn)染pGL4.0 載體作為對照。37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h 后換新鮮的DMEM培養(yǎng)基，24 h 后收取細胞。

1.5 雙螢光素酶檢測

分別將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染BEND3、HUVEC、MCF7細胞系，24 h 后棄DMEM，用PBS 清洗2 次后加入1×ULB 裂解細胞，于搖床上裂解30 min。將裂解液同細胞碎片一同吸進EP 管中，振蕩5～10 min，12 000 r/min 離心1 min，取上清做發(fā)光檢測。

1.6 慢病毒的包裝

將293T 細胞接種于10 cm 皿中，當細胞密度達到70%～80%時，將慢病毒包裝系統(tǒng)中的pAX2、pLP-VSVG 和pCDH-CD31promotor-copGFP 質(zhì) 粒 按照一定的比例混合，用無血清無雙抗的DMEM 稀釋，加入一定比例的Megatran 混勻，振蕩10 s，靜置10 min，然后將以上混合液逐滴加入293T 細胞中混勻，48 h 后收集含有病毒粒子的上清液，離心、過濾后置4℃或-80℃保存。

1.7 穩(wěn)定表達GFP的HUVEC細胞株的構(gòu)建

將HUVEC 細胞與MCF7 細胞接種于6 cm 皿中，待細胞密度達70%～80%時即可感染，加入包裝好的病毒液，同時加入8 μg/mL 的聚凝胺促進病毒轉(zhuǎn)染。感染8 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)后于熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS19.0 進行統(tǒng)計學處理分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，3 組間比較采用方差分析，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以實驗室保存的基因組DNA 為模板擴增CD31 啟動子序列，即CD31 核酸序列的-710～+116部分，獲得887 bp 片段，與預期一致（圖1）。將載體pGL4 和pCDH-copGFP 用KpnⅠ、XhoⅠ雙 酶切后與PCR 產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選單克隆經(jīng)菌液PCR 鑒定，或得與目的條帶887 bp 接近的單克隆。陽性克隆經(jīng)由提取質(zhì)粒、酶切鑒定，可切出約800 bp 的目的條帶，對照空載體經(jīng)雙酶切后僅見載體大片段，符合預期結(jié)果（圖2）。測序結(jié)果表明，插入片段的DNA 序列與CD31 啟動子序列完全一致（圖3）。

圖1 CD31 啟動子的PCR 擴增

圖2 重組質(zhì)粒pGL4-CD31promoter（A）和pCDH-copGFPCD31promoter（B）的KpnⅠ與XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 pGL4-CD31promoter（A）和pCDH-copGFP-CD31promoter（B）的測序結(jié)果

2.2 啟動子活性測定

將構(gòu)建的pGL4-CD31promotor-Luciferase 質(zhì)粒和TK 質(zhì)粒與空載體pGL4.0 和TK 質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染BEND3、HUVEC、MCF7 細胞，24～48 h 后裂解細胞，與特異性底物反應后獲得熒光比值（圖4）。結(jié)果表明，與空載體相比，CD31 啟動子特異性在內(nèi)皮細胞中促進熒光酶表達。CD31 啟動子在乳腺上皮細胞MCF-7 中沒有活性，而在內(nèi)皮細胞HUVEC 和BEND3 中，CD31 啟動子的活性升高了約7 倍（P＜0.01）。

2.3 GFP穩(wěn)定表達的MCF7細胞株構(gòu)建

用包裝好的pCDH-CD31promotor-copGFP 慢病毒分別感染HUVEC 與MCF7 細胞，8 h 后更換培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)后，將被病毒感染過的MCF-7細胞系與被病毒感染過且有熒光的HUVEC 細胞系種于腔室載玻片中，通過免疫熒光可觀察到HUVEC 細胞中有綠色熒光，陰性對照MCF7 細胞中無熒光（圖5），說明CD31 啟動子特異性在內(nèi)皮細胞中表達。

圖4 pGL4-CD31promotor 啟動子活性

圖5 CD31 啟動子在HUVEC 細胞系與陰性對照MCF-7 細胞系中的表達

3 討論

目前，對于血管內(nèi)皮細胞的鑒定大部分是通過鑒定其特異性標志物來實現(xiàn)的，由此衍生出許多方法，如Q-PCR、流式分選、Western 印跡、免疫熒光；也有根據(jù)內(nèi)皮細胞的功能進行鑒定，例如成管實驗。但這些方法大部分步驟較為繁瑣，實驗周期較長，且結(jié)果往往不具有確定性，須幾種方法結(jié)合共同證明內(nèi)皮細胞的發(fā)生。

本實驗通過將內(nèi)皮細胞標志物CD31 的啟動子構(gòu)建在帶有GFP 和螢光素酶的表達載體中，將載體轉(zhuǎn)染目的細胞，通過熒光和螢光素酶的有無來鑒別目的細胞是否具有內(nèi)皮細胞的特征性標志物，從而起到分選鑒別內(nèi)皮細胞的作用。利用這種方法可極大地提高實驗效率，只須構(gòu)建含有內(nèi)皮細胞標志物啟動子的熒光和螢光素酶表達載體，再轉(zhuǎn)染目的細胞，即可初步篩選出內(nèi)皮細胞。此研究為鑒定血管內(nèi)細胞提供了新的思路。