張晶晶，肖紅劍，龍瓊，浦滔，李智華，寸韡

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650118

過(guò)敏性疾病被世界衛(wèi)生組織列為21 世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一，同時(shí)又被認(rèn)定為當(dāng)今世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題。過(guò)敏性疾病臨床癥狀包括過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性休克、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性皮炎等。流行病學(xué)調(diào)查顯示，世界人口的5%～16%患有過(guò)敏性哮喘，過(guò)敏性疾病的發(fā)病率逐年上升，每年可導(dǎo)致18 萬(wàn)人死亡。但是，過(guò)敏性疾病作為一個(gè)復(fù)雜的疾病，迄今沒(méi)有一種滿意的治療方案。研究表明，IgE 及其高親和力受體α亞基（FcεRIα）在過(guò)敏反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。IgE FcεRI 由胞外α、β及γ-γ鏈組成，其中α亞基結(jié)合IgE 引起嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞釋放大量過(guò)敏介質(zhì)，從而引起炎癥[1-2]。隨著樹(shù)鼩基因組數(shù)據(jù)的解析，發(fā)現(xiàn)樹(shù)鼩免疫系統(tǒng)與靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有較高的同源性[3-4]。目前研究過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物模型局限于嚙齒類動(dòng)物，對(duì)樹(shù)鼩的相關(guān)研究較少。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中制備了樹(shù)鼩IgE FcεRIα單克隆抗體并進(jìn)行了檢測(cè)，為今后研究樹(shù)鼩過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型提供檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠（4～6 周齡）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動(dòng)物中心提供；Sp2/0 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、HAT 培養(yǎng)基、HT 培養(yǎng)基等均購(gòu)于Gibco 公司；免疫原樹(shù)鼩IgE FcεRIα蛋白由本實(shí)驗(yàn)室純化制備；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)于Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)于Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG、驢抗兔IgG（Alexa fluor 594）購(gòu)于Proteintech 公司。

1.2 免疫

用樹(shù)鼩IgE FcεRIα背部皮下免疫雌性BALB/c 小鼠。第一次免疫劑量為50 μg/只，用PBS 緩沖液稀釋蛋白至適量體積，加入等體積的弗氏完全佐劑，用10 mL 注射器推拉至油包水狀態(tài)，將乳化好的抗原背部皮下多點(diǎn)免疫；2 周后進(jìn)行二次免疫，免疫劑量為25 μg/只，將IgE FcεRIα與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后加強(qiáng)免疫，第4周、第6 周采用相同方法進(jìn)行免疫。每次免疫1周后取小鼠血清檢測(cè)效價(jià)，以待測(cè)孔D450nm值（P）與陰性孔D450nm值（N）的比值≥2.1，效價(jià)達(dá)到1∶4000 后，取效價(jià)最高小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 進(jìn)行融合。

1.3 細(xì)胞融合

細(xì)胞融合前將RPMI-1640 培養(yǎng)基及PEG-1500 在37℃預(yù)熱，取效價(jià)最高小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按8∶1 的比例混合，1000 r/min 離心5 min，棄上清，將細(xì)胞吹散，37℃下緩慢加入PEG溶液，邊加邊晃動(dòng)離心管，37℃水浴鍋中靜置1 min，加入RPMI-1640 培養(yǎng)基以終止PEG 作用，加入培養(yǎng)基速度逐漸加快，邊加邊晃動(dòng)離心管；細(xì)胞融合終止后，1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入HAT 培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞至均勻，步驟參考文獻(xiàn)[5-6]。

1.4 雜交瘤細(xì)胞的篩選

細(xì)胞融合7 d 后通過(guò)ELISA 法檢測(cè)抗體，選擇分泌抗體陽(yáng)性孔，用HT 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用有限稀釋法經(jīng)過(guò)3 輪亞克隆篩選出持續(xù)分泌抗體的穩(wěn)定細(xì)胞系并擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存；取雜交瘤細(xì)胞上清，采用Sigma 公司的抗體亞類試劑盒測(cè)定單抗亞型。

1.5 樹(shù)鼩IgE FcεRIα單抗特性檢測(cè)

1.5.1 Western 印跡檢測(cè)單克隆抗體特異性 利用原核表達(dá)IgE FcεRIα的菌液及樹(shù)鼩組織進(jìn)行檢測(cè)單克隆抗體的特異性，SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶200 稀釋后室溫孵育1 h，PBST洗滌4次，每次10 min；二抗羊抗鼠1∶5000 稀釋后室溫孵育45 min，PBST 洗滌4 次，每次10 min；ELC 顯色，曝光。

1.5.2 間接細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)真核細(xì)胞表達(dá)的IgE FcεRIα 將質(zhì)粒pAAV-CMV-tFcεRIα（本室提供）轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，48 h 后吸出細(xì)胞上清，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗滌；1% BSA 室溫封閉30 min，PBS 洗滌；孵育一抗，按1∶2000 室溫孵育30 min，PBS 洗滌；孵育熒光二抗（驢抗兔IgG，Alexa fluor 594），按1∶2000 室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌；滴加DAPI 復(fù)染核并封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5.3 免疫組化檢測(cè)單克隆抗體生物學(xué)活性 將制備的石蠟切片（氣管組織、肺組織）進(jìn)行脫蠟、水化、0.01 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液抗原修復(fù)、3%H2O2-PBS 溶液滅活內(nèi)源性酶、4% BSA 封閉、孵育一抗和二抗、DAB 顯色、復(fù)染、脫水等步驟，檢驗(yàn)單克隆抗體是否能檢測(cè)組織中的IgE FcεRIα。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞篩選

細(xì)胞融合后，通過(guò)間接ELISA 法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清抗IgE FcεRIα抗體效價(jià)，經(jīng)3～4 次克隆化培養(yǎng)篩選出5 株可持續(xù)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為HC020、HC021、HC022、HC023 和HC024。結(jié)果如圖1。

2.2 雜交瘤細(xì)胞亞型鑒定

采用Sigma 公司的抗體亞類試劑盒測(cè)定單抗抗體亞型。按照操作說(shuō)明包被、封閉，腹水按1∶500 稀釋后作為一抗，100 μL/孔加入96 孔酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，PBST 洗滌3 次，將HRP 標(biāo)記的羊抗鼠各抗體亞類的二抗按1∶500 稀釋，按照抗鼠IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 的順序加入，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST 洗滌3 次，加入現(xiàn)配的顯色液，100 μL/孔，室溫顯色10～20 min，每孔加入50 μL 終止液，酶標(biāo)儀上讀取D450nm值。5株單克隆抗體的亞型見(jiàn)表1。

2.3 單克隆抗體特異性及間接免疫熒光檢測(cè)

圖1 單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)

圖2 單克隆抗體特異性檢測(cè)

表1 5株單克隆抗體亞型分類

利用樹(shù)鼩IgE FcεRIα原核表達(dá)IPTG 誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的菌液檢測(cè)5 株單克隆抗體的特異性。Western 印跡表明5 株單克隆抗體均能檢測(cè)出IPTG 誘導(dǎo)后的菌液，檢測(cè)條帶大小與預(yù)期相同且特異性較強(qiáng)（圖2）。質(zhì)粒pAAV-CMV-tFcεRIα轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，間接免疫熒光均能檢測(cè)到真核細(xì)胞表達(dá)的樹(shù)鼩IgE FcεRIα蛋白，且該蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜上，證明5 株單克隆抗體均能用于間接免疫熒光檢測(cè)（圖3）。

2.4 免疫組化檢測(cè)單克隆抗體生物學(xué)活性 免疫組化檢測(cè)樹(shù)鼩肺、氣管組織石蠟切片中的IgE FcεRIα，以肥大細(xì)胞Chymase抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明，單克隆抗體HC020、HC022、HC024能夠檢測(cè)組織中的IgE FcεRIα（圖4）。

3 討論

IgE 與其受體的特異性結(jié)合是過(guò)敏性疾病發(fā)生的特異性途徑[7]。目前，IgE 及FcεRI 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)已闡明。FcεRI 由α、β、γ亞基組成，其中α亞基包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)主要負(fù)責(zé)與IgE 結(jié)合，在過(guò)敏反應(yīng)信號(hào)通路傳導(dǎo)過(guò)程中至關(guān)重要[2]。研究發(fā)現(xiàn)，IgE-Fc∶FcεRI 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)表明抗體和受體形成1∶1 復(fù)合物的機(jī)理是受體結(jié)合抗體Fc 段二聚體的每一條鏈[8]。因此，過(guò)敏反應(yīng)治療不應(yīng)局限于抗IgE 治療，其結(jié)合受體也可作為治療過(guò)敏性疾病的靶點(diǎn)之一。2003年在美國(guó)上市的Omalizumab 針對(duì)IgE 而進(jìn)行抗IgE 治療[9]；Jardieu 制備 的 抗IgE 抗體E25（結(jié)合位點(diǎn)即IgE 和FcεRIα正常作用位點(diǎn)）能起到緩解過(guò)敏性疾病的效果[10]。雖然越來(lái)越多的藥物有治療和緩解過(guò)敏性疾病的效果，但過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制還未闡明，并且缺乏合適的動(dòng)物模型。隨著樹(shù)鼩基因組的闡明，證實(shí)了樹(shù)鼩與人類具有更近的親緣關(guān)系，因此在多種疾病的模型研究中可發(fā)揮重要作用[4,11]，但迄今樹(shù)鼩作為過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型的研究尚少。我們制備出鼠抗樹(shù)鼩IgE FcεRIα的單克隆抗體，并通過(guò)間接細(xì)胞免疫熒光及免疫組化證明制備的單克隆抗體可用于研究樹(shù)鼩過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型的檢測(cè)工具，同時(shí)，該抗體今后也可用于篩選樹(shù)鼩肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞，為樹(shù)鼩過(guò)敏反應(yīng)疾病動(dòng)物模型的建立奠定了基礎(chǔ)。

圖3 間接細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)單克隆抗體生物學(xué)活性

圖4 免疫組化檢測(cè)樹(shù)鼩組織單克隆抗體生物學(xué)活性