張小歡 ，毛彥穩(wěn) ，彭偉 ，王圓圓 ，劉麗榮 ，劉玲伶 ，石明雋，肖瑛，湯磊，郭兵

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 重大疾病發(fā)病機(jī)制及藥物防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一，DN晚期的主要病理特征包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。而氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）在DN的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[1]。在正常生理狀態(tài)下，適量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）能迅速被腎組織內(nèi)抗氧化物質(zhì)（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等）清除；在糖尿病或高血糖環(huán)境時(shí)，ROS產(chǎn)生增多而清除減少，體內(nèi)聚集大量的ROS便可誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量過氧化代謝產(chǎn)物（如丙二醛等）；并且可以誘導(dǎo)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的激活，經(jīng)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)促纖維化生長因子（如轉(zhuǎn)化生長因子、結(jié)締組織生長因子等）基因轉(zhuǎn)錄和高表達(dá)，最終出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積而形成腎臟纖維化[2-3]。而轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor β1，TGF-β1）信號(hào)通路是目前公認(rèn)的與糖尿病腎臟纖維化密切相關(guān)的信號(hào)通路，主要通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchy-mal transition，EMT），促使ECM合成增加并抑制其降解而過度沉積，從而造成廣泛的腎臟纖維化[4]。而核轉(zhuǎn)錄共抑制因子（Skirelated novel protein，SnoN）是 TGF-β1信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控因子，可以通過抑制TGF-β1信號(hào)通路來延緩腎臟纖維化進(jìn)程。研究表明[5]，α-硫辛酸（alpha lipoic acid，ALA）是一種含硫的抗氧化劑，可以清除活性氧和自由基，對(duì)氧化應(yīng)激引起的組織損傷有治療作用。因此，本研究旨在觀察抗氧化劑ALA對(duì)DM大鼠腎臟的保護(hù)作用，并探討其是否通過調(diào)節(jié)SnoN表達(dá)和TGF-β1信號(hào)通路來發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用，以進(jìn)一步了解ALA的作用機(jī)制，為DN的防治提理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，體重（180±20）g，共24只；由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，批號(hào)為SCXK（京）2009-0004。

1.1.2主要試劑ALA（中國奧立寶公司），鏈脲菌素（Streptozotocin，STZ；美國Sigma公司），總抗氧化物酶活性（total antioxidant capacity，T-AOC）、總超氧化物歧化酶活性（total superoxide dismutase，T-SOD）、過氧化氫酶活性（Catalase，CAT）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成公司），SnoN、TGF-β1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），Collagen I和Collagen IV單克隆抗體（美國Sigma公司），β-actin抗體（中國Boster公司），兩步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole，AEC）（中杉金橋生物技術(shù)有限公司），I抗稀釋液，超敏顯色液（enhanced chemiluminescent，ECL）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），Western blot用PVDF膜和3 mm Whatman濾紙（美國Millipore公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.1.3主要器材穩(wěn)步倍加型血糖儀（美國強(qiáng)生公司），超低溫冰箱（日本Sanyo公司），高速低溫離心機(jī)（美國Beckman公司），Bayer1650全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckman公司），電泳系統(tǒng)及電轉(zhuǎn)移裝置（瑞典Amersham公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2　方法

1.2.1動(dòng)物模型復(fù)制及分組SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，尾靜脈注射溶于0.01 mol/L（pH=4.5）無菌檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液的STZ（55 mg/kg）復(fù)制DM大鼠模型，72 h后測大鼠空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖陽性認(rèn)為復(fù)制成功，隨后隨機(jī)分成糖尿病組（DM組，n =8）、硫辛酸治療組（ALA 組，n =8）。成模 2周后，采取灌胃方式給予硫辛酸治療，硫辛酸溶于5%的羧甲基纖維素鈉（car-boxy methylated cellulose，CMC）中，灌胃劑量為150 mg/（kg·d），每周給藥6 d，3 d配一次藥（4℃保存）；并設(shè)鼠齡相同的正常對(duì)照組（NC組，n =8），灌胃同等濃度同等劑量的CMC；6周后處死所有SD大鼠，期間所有大鼠予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，每周監(jiān)測1次血糖和體重。

1.2.2標(biāo)本收集大鼠處死前1 d用代謝籠收集24 h尿，記錄尿量，取部分尿液離心后-20℃保存；處死前禁食6～8 h，乙醚麻醉后稱重，股動(dòng)脈穿刺采血，分離血清-20℃保存；開腹取雙側(cè)腎臟，去掉包膜及周圍脂肪組織，稱重記錄腎重/體重（kidney weight/body weight，KW/BW），分別用4%多聚甲醛固定及-80℃保存。

1.2.3生化指標(biāo)測定葡萄糖氧化酶法測血清葡萄糖（blood glucose，BG），酶分析法檢測血總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（Triglyceride，TG），鄰苯三酚紅比色法測尿蛋白（urine protein，UP），均按試劑盒說明書操作，尿蛋白濃度與尿量乘積為24 h UP。

1.2.4氧化應(yīng)激水平檢測每個(gè)腎組織標(biāo)本均稱取0.2 g按1∶9的比例與0.9%的生理鹽水混合，置于勻漿器中冰上勻漿組織制成10%的組織勻漿，再用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定組織勻漿的蛋白濃度。最后參照試劑盒說明書進(jìn)行T-AOC、MDA、CAT和T-SOD的檢測。其中，檢測T-AOC和MDA時(shí)直接使用10%的組織勻漿；而檢測CAT時(shí)將樣本在10%的組織勻漿的基礎(chǔ)上用生理鹽水作40倍稀釋，檢測T-SOD時(shí)將樣本作100倍稀釋。4項(xiàng)指標(biāo)的檢測均采用比色法。

1.2.5腎組織病理檢查多聚甲醛固定腎組織，制成3μm厚的石蠟切片，行HE及Masson染色，光鏡觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色采用SP兩步法檢測Collagen I在各組大鼠腎組織的分布和表達(dá)，石蠟切片脫蠟水化，經(jīng)3%的過氧化氫去離子水孵育及胰酶修復(fù)后，Collagen I（1∶100），4℃孵育過夜加入生物素化二抗，室溫下孵育30 min，AEC顯色，陽性染色為紅色，蘇木素復(fù)染，PBS代替一抗，作為陰性對(duì)照。

1.2.7Western blot檢測取-80℃保存的各組大鼠腎皮質(zhì)，每只樣本取200 mg，分別加入組織蛋白提取液后勻漿離心取上清，用BCA試劑盒測定各組蛋白質(zhì)濃度，按所測得濃度計(jì)算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min，經(jīng)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入 β-actin、SnoN、TGF-β1、Collagen Ⅳ一抗，工作濃度分別為1∶4 000、1∶300、1∶300、1∶1 000，4℃孵育12～24 h；次日，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（濃度均為1∶4 000）室溫孵育1 h，加ECL熒光顯色液，凝膠成像儀曝光，Image Lab軟件分析各條帶調(diào)整體積值，每個(gè)樣本重復(fù)操作3次，以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參，結(jié)果用目標(biāo)蛋白與β-actin的比值來表示。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，通過方差齊性檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　生化指標(biāo)檢測結(jié)果

大鼠在注射STZ 72 h后，BG升高并持續(xù)在高水平，且尿糖陽性。實(shí)驗(yàn)6周后，3組KW/BW、BG、24 h UP、TC和TG比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），DM組的KW/BW、BG、24 h UP、TC和TG與NC組相比均升高（P ＜0.05）；與DM組相比，ALA組KW/BW、24 h UP、TC和TG均降低（P ＜0.05），而BG增高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表 1。

2.2　氧化應(yīng)激水平檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)6周后，3組大鼠腎組織中T-AOC、MDA、T-SOD和CAT比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；DM組T-AOC、T-SOD和CAT與NC組相比降低，使用ALA治療后，ALA組T-AOC、T-SOD和CAT活性較DM組增高（P ＜0.05）；而DM組MDA含量較NC組升高（P ＜0.05），ALA能降低DM大鼠腎組織MDA含量。見表2。

2.3　腎組織病理改變

HE及Masson染色可見正常大鼠腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤；DM組大鼠腎小管腔擴(kuò)張明顯，腎小管基底膜不規(guī)則增厚，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀改變，間質(zhì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管間質(zhì)Masson染色陽性物質(zhì)增多；ALA組大鼠腎臟病變有不同程度的改善，腎小管間質(zhì)Masson染色陽性物質(zhì)減少，炎癥細(xì)胞浸潤減輕，空泡狀改變不明顯（見圖1、2）。

2.4　免疫組織化學(xué)結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色檢測Collagen I的表達(dá)，NC組大鼠腎組織Collagen I陽性染色主要存在血管周圍和細(xì)胞間質(zhì)，而DM組大鼠陽性染色增多，可見腎小管基底膜強(qiáng)陽性染色，ALA治療后 Collagen I的表達(dá)減少。見圖3。

表1　各組大鼠KW/BW、BG、24 h UP、TC、TG的變化 （n =8，±s）

表1　各組大鼠KW/BW、BG、24 h UP、TC、TG的變化 （n =8，±s）

注：1）與NC組相比，P ＜0.05；2）與DM組相比，P ＜0.05

組別　KW/BW/（mg/g）　BG/（mmol/L）　24 h UP/mg　TC/（mmol/L）　TG/（mmol/L）NC 組　7.28±0.65　5.88±1.05　3.13±0.54　1.41±0.22　1.42±0.38 DM組　12.15±1.571）　25.92±1.861）　20.65±1.051）　2.34±0.301）　2.41±0.591）ALA 組　10.58±0.581）2）　26.60±1.691）　16.12±0.711）2）　1.56±0.332）　1.37±0.452）F值　66.573　119.112　27.566　25.716　13.731 P值　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000

表2　各組大鼠氧化應(yīng)激水平的比較 （n =8，±s）

表2　各組大鼠氧化應(yīng)激水平的比較 （n =8，±s）

注：1）與NC組相比，P ＜0.05；2）與DM組相比，P ＜0.05

NC 組　0.67±0.02　2.06±0.09　688.53±49.76　44.60±4.50 DM組　0.32±0.011）　2.62±0.091）　433.41±37.111）　24.36±2.491）ALA 組　0.56±0.061）2）　2.19±0.081）2）　640.99±27.522）　44.30±3.572）F值　131.181　72.075　68.405　70.539

2.5　Western blot結(jié)果

Western blot檢測各組SnoN、TGF-β1和CollagenⅣ蛋白表達(dá)的水平，NC組中，SnoN條帶較粗較強(qiáng)，而TGF-β1和CollagenⅣ條帶較細(xì)較弱。與NC組相比，DM組中SnoN條帶灰度值較少，TGF-β1和CollagenⅣ條帶灰度值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與DM組相比，ALA組SnoN條帶變粗變強(qiáng)，TGF-β1和Collagen Ⅳ條帶變細(xì)變?nèi)?，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖 4。

圖2　各組大鼠腎組織形態(tài) （Masson染色）

圖3　各組大鼠腎組織Collagen I蛋白表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色）

圖4　各組大鼠腎組織中SnoN、TGF-β1和Collagen Ⅳ蛋白表達(dá)水平比較

3　討論

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是造成糖尿病及其并發(fā)癥的重要原因之一[6-7]。ROS產(chǎn)生和清除之間的平衡決定了機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，ROS產(chǎn)生過多和/或抗氧化系統(tǒng)酶活性的降低可導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加。OS可以誘導(dǎo)腎臟發(fā)生損傷，主要表現(xiàn)為腎小球和腎小管固有細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上的改變[3]。有研究表明[8-9]，腎臟中過多的OS可以破壞足細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使腎小球足細(xì)胞足突肥大；過多的ROS持續(xù)刺激還將誘導(dǎo)腎小管炎癥反應(yīng)和腎間質(zhì)纖維化的形成。本研究復(fù)制DM大鼠模型6周后發(fā)現(xiàn)，DM大鼠腎組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高而抗氧化物質(zhì)T-AOC、T-SOD及CAT活性水平降低，且伴有明顯的腎臟病理學(xué)改變，表明糖尿病時(shí)其氧化程度加重，抗氧化能力下降。而ALA作為一種抗氧化劑，可與其他抗氧化劑共同作用，抑制脂質(zhì)過氧化[5，10]。本實(shí)驗(yàn)在DM大鼠模型復(fù)制2周后給予ALA治療發(fā)現(xiàn)，ALA組血糖雖然沒有明顯變化，但病理學(xué)及生物化學(xué)檢查顯示ALA組腎臟病變程度減輕，同時(shí)在給予ALA治療后大鼠腎臟脂質(zhì)過氧化程度減輕，抗氧化能力增強(qiáng)。表明ALA可以降低DM大鼠腎臟的氧化應(yīng)激水平，改善DM大鼠腎功能和代謝。

有研究表明[11]，在糖尿病或高血糖狀態(tài)下，腎臟內(nèi)過多的ROS可激活胞內(nèi)多條信號(hào)通路，包括MAPK通路、ERK通路等。還有研究表明[12]，腎小管/間質(zhì)內(nèi)過多產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)TGF-β1等致纖維化因子大量釋放和表達(dá)，促使腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。說明腎臟內(nèi)過多的ROS可能也誘導(dǎo)了TGF-β1信號(hào)通路的激活，從而加重其對(duì)腎臟的損害。而腎纖維化是DN終末期病理特征之一，有許多細(xì)胞因子參與這個(gè)過程，TGF-β1是目前公認(rèn)最重要的致纖維化因子之一，主要通過介導(dǎo)TGF-β1信號(hào)通路來發(fā)揮其致纖維化效應(yīng)[13-14]。SnoN作為TGF-β1信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，在腎臟纖維化過程發(fā)揮重要作用，它可以抑制TGF-β1信號(hào)通路的激活，并能抑制ECM沉積，從而達(dá)到延緩腎纖維化進(jìn)程的目的[15-16]。本研究提示，DM組SnoN蛋白表達(dá)較NC組減少，TGF-β1水平與NC組比增高，并且伴隨著Collagen I、Collagen Ⅳ的大量沉積；而用ALA治療干預(yù)后，SnoN蛋白表達(dá)增多，TGF-β1蛋白表達(dá)和膠原沉積水平均下降。實(shí)驗(yàn)6周后，大鼠腎組織ROS產(chǎn)生增多，脂質(zhì)過氧化程度加深，抗氧化能力減弱，促進(jìn)TGF-β1高表達(dá)而抑制SnoN蛋白表達(dá)，導(dǎo)致SnoN調(diào)控TGF-β1信號(hào)通路的平衡被破壞，TGF-β1通過其下游胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)目的基因Collagen I、Collagen Ⅳ的轉(zhuǎn)錄和翻譯增多，致使Collagen I、Collagen Ⅳ在腎間質(zhì)的沉積增多，DN發(fā)生纖維化病變；而用抗氧化劑ALA干預(yù)后DM大鼠腎臟脂質(zhì)過氧化程度減輕，抗氧化能力增強(qiáng)，恢復(fù)SnoN蛋白水平并抑制TGF-β1表達(dá)，使兩者之間的關(guān)系重新得到平衡，進(jìn)而發(fā)揮延緩和治療DN的作用。

綜上所述，ALA減少了DM大鼠腎臟ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)損傷，進(jìn)而上調(diào)SnoN蛋白的表達(dá)、阻止TGF-β1信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮其延緩或阻斷腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的作用，對(duì)DM大鼠腎臟起到保護(hù)作用。

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