周香艷　 楊江偉,2　 唐　勛,2　 文義凱　 張　寧,*　 司懷軍,2

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 甘肅蘭州 730070; 2甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 甘肅蘭州 730070

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid, BR)是 20世紀(jì) 70年代末新發(fā)現(xiàn)的一類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì), 被稱為第六大類植物激素[1]。在植物生長發(fā)育中起重要作用,包括細(xì)胞伸長與分裂、維管束分化、光形態(tài)建成、葉和根的發(fā)育、衰老、育性以及對逆境脅迫的響應(yīng)等[2]。CPD基因編碼C-3氧化酶, 為BRs合成的限速酶[3-4]。BRs生物合成途徑及其遺傳調(diào)節(jié)是當(dāng)今植物生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)取得了重要進(jìn)展, 但主要集中在擬南芥、水稻等模式植物。近年來對BRs應(yīng)用報(bào)道很多, 但對植物抵抗環(huán)境脅迫的能力, 特別是通過轉(zhuǎn)基因手段提高植物抗逆性的研究報(bào)道較少。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)是指將與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA (double strand RNA, dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后, 能特異性地降解該 mRNA, 最終導(dǎo)致目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄后沉默的現(xiàn)象[5]。RNAi可以高效、特異性地使目的基因轉(zhuǎn)錄后沉默或剔除目標(biāo)基因的表達(dá), 獲得功能喪失性突變個(gè)體, 用于基因功能研究, 已成為重要方法[6]。但RNAi經(jīng)常會出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象[7-8]。

人工 microRNA技術(shù)是利用植物體內(nèi)固有的通過 microRNA進(jìn)行基因沉默的系統(tǒng), 以擬南芥miR319a的前體序列作為amiRNA 的基本骨架序列,通過人工設(shè)計(jì)特異的miRNA, 經(jīng)重疊PCR擴(kuò)增將天然miR319a 的成熟序列替換成amiRNA的成熟序列來沉默目的基因的方法[9]。利用人工合成的microRNA技術(shù)進(jìn)行植物基因沉默的研究最先是由Alvarez 等[10]、Niu 等[11]、Schwab 等[12]開創(chuàng)的。由于人工microRNA技術(shù)克服了以往的RNA干擾技術(shù)易脫靶的弱點(diǎn), amiRNA不僅可以高效沉默基因, 同時(shí)具有很高的特異性[13], 其靶標(biāo)基因易于預(yù)測, 已被用于擬南芥、煙草、水稻、小立碗蘚等物種[14]的研究中。

本研究以 pRS300載體為基礎(chǔ), 通過設(shè)計(jì)用于沉默馬鈴薯 BR合成限速酶基因CPD(StCPD)的amiRNA, 并構(gòu)建表達(dá)載體pCPB121-amiRcpd, 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將其導(dǎo)入馬鈴薯栽培品種“紫花白”,得到StCPD基因干擾表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株, PEG模擬干旱脅迫處理StCPD基因干擾表達(dá)的馬鈴薯試管苗,用qRT-PCR法測定不同處理時(shí)間StCPD基因的相對表達(dá)量, 同時(shí)分析其 MDA和脯氨酸等指標(biāo)及其表型變化, 明確StCPD基因干擾表達(dá)對馬鈴薯抗旱能力的響應(yīng), 為進(jìn)一步研究 BR合成相關(guān)基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

植物表達(dá)載體 pBCPD(CaMV 35S啟動子)抗性標(biāo)記為卡那霉素(Kan), 用于遺傳轉(zhuǎn)化的馬鈴薯栽培品種“紫花白”的試管苗由本實(shí)驗(yàn)室保存。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404選擇標(biāo)記為利福平(Rif), 由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供; 大腸桿菌(Escherichia coli)菌株為DH5α和載體pMT18-T購自寶生物工程(大連)有限公司; 模板載體 pRS300[15]; 輔助載體 pC121以pMT18-T為基礎(chǔ)構(gòu)建, 含有源自 pBI121[16-17]的d35S-TL啟動子區(qū)和終止子序列, 在 d35S-TL和終止子序列之間重新設(shè)計(jì)了與 pRS300銜接的多克隆位點(diǎn)。

卡那霉素(Kan)、吲哚乙酸(IAA)、羧芐青霉素(Carb)、利福平(Rif)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA3)、反式玉米素(ZT)和特美汀均購自中科瑞泰(北京)生物科技公司; 酵母提取物、胰蛋白胨和TaqDNA 聚合酶、Total RNA Kit、T4 DNA Ligase、RNase和SacI、KpnI限制性核酸內(nèi)切酶、5×PrimeScript RT Master Mix試劑盒、DL2000 Marker和 Spin柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工(上海)生物工程有限公司; 由生工(上海)生物工程有限公司完成 PCR引物合成和DNA測序。其他各種試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2　人工microRNA的分子設(shè)計(jì)及克隆

利用在線軟件 WMD (http：//wmd2.weigelworld.org/)設(shè)計(jì)針對StCPD基因的 amiRNA, 其序列為5′-TATTATGTTAGCGATTCGCAC-3′, 以 amiRNA 序列設(shè)計(jì)用于 over-lapping PCR 的引物 I、II、III、IV (表1)。通用引物 A (5′-CTGCAAGGCGATTAAGTTGG GTAAC-3′)和 B (5′-GCGGATAACAATTTCACACA GGAAACAG-3′)分別與 pRS300質(zhì)粒中 MIR319a外圍序列配對。

以質(zhì)粒pRS300為模板[15], 通過重疊PCR把質(zhì)粒pRS300中內(nèi)源miR319a的20個(gè)核苷酸替換為我們設(shè)計(jì)選擇的21個(gè)核苷酸的amiRNA序列。在第一輪 PCR 中, 首先擴(kuò)增出 amiRNA 前體的 5′臂(片段 a)、中心環(huán)(片段 b)和 3′臂(片段 c)[15]。PCR 體系：含模板 DNA 20 ng、正反向引物(表2)各0.5 pmoL、dNTP 1 mmol L-1、TaqDNA聚合酶 2.5 U和10×buffer 1 μL, 用滅菌雙蒸水補(bǔ)足 10 μL。PCR 條件為 95°C預(yù)變性 2 min; 95°C變性30 s, 52°C復(fù)性30 s, 72°C延伸40 s, 進(jìn)行40個(gè)循環(huán); 72°C延伸7 min。利用2%瓊脂糖凝膠電泳純化產(chǎn)物a、b、c。

表1　重疊PCR引物Table 1　List of over-lapping PCR primers

以a、b、c這3個(gè)片段的純化DNA混合物為模板, 以A和B為引物擴(kuò)增覆蓋整個(gè)前體d[12]。PCR體系： 含模板 DNA 20 ng、正反向引物(表2)各 0.5 pmoL、dNTP 1 mmol L-1、TaqDNA 聚合酶 2.5 U 和10×buffer 1 μL, 用滅菌雙蒸水補(bǔ)足 10 μL。PCR 條件為95°C預(yù)變性2 min; 95°C變性30 s, 55°C復(fù)性30 s, 72°C延伸90 s, 進(jìn)行40個(gè)循環(huán); 72°C延伸7 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化片段d, 連接到克隆載體 pMT18-T中, 轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α, 挑取陽性克隆, 以菌落 PCR和酶切驗(yàn)證鑒定并測序, 測序正確的質(zhì)粒被命名為pT-amiRcpd。

表2　產(chǎn)生amiRNA前體的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系Table 2　Standard reaction system for producing amiRNA precursor

1.3　植物表達(dá)載體構(gòu)建

對測序正確的質(zhì)粒pT-amiRcpd用限制性內(nèi)切酶KpnI和SacI雙酶切, 回收長度約512 bp的小片段;同時(shí)將pCPB121質(zhì)粒用KpnI和SacI雙酶切, 回收大片段; 將小片段分別與回收的載體大片段按DNA摩爾比3∶1混合, 加入T4 DNA連接酶1 μL, 2×T4 DNA ligase buffer 1 μL, 無菌重蒸水補(bǔ)充體積到10 μL, 將樣品混勻后瞬時(shí)離心, 置16℃連接過夜。取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 并涂布在Kan抗性平板上進(jìn)行陽性篩選。酶切、測序驗(yàn)證正確后命名為pCPB121-amiRcpd。然后將pCPB121-amiRcpd質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

1.4　根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯莖段和薯片遺傳轉(zhuǎn)化

接種馬鈴薯莖段于含有3%蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上, 置培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)30 d左右, 將試管苗作為轉(zhuǎn)化的受體材料。接種莖段于含有8%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基上, 待試管苗長至瓶口時(shí), 轉(zhuǎn)入黑暗條件下培養(yǎng)約35 d后開始結(jié)薯, 薯塊長至大約1 cm時(shí),適宜作為轉(zhuǎn)化的受體材料。參照Zhou等[18]的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進(jìn)行馬鈴薯試管苗莖段的遺傳轉(zhuǎn)化[19]。

1.5　轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

從轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株中提取基因組總DNA[20], 以未轉(zhuǎn)化NT植株作為陰性對照進(jìn)行PCR檢測。根據(jù)pCPB121上的NTPII序列設(shè)計(jì)引物, 上、下游引物分別是NTPII-1 5'-GCTATGACTGGGCACAACA G-3'和NTPII-2 5'-ATACCGTAAAGCACGAGGA A-3', 預(yù)期擴(kuò)增片段大小為676 bp。

反應(yīng)體系含模板DNA 20 ng、正反向引物各0.5 pmoL、dNTP 1 mmol L-1、TaqDNA聚合酶2.5 U和10×buffer 1 μL, 用滅菌雙蒸水補(bǔ)足 10 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性45 s, 57℃復(fù)性45 s,72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6　轉(zhuǎn)基因植株qRT-PCR表達(dá)分析

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測StCPD基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯整個(gè)植株及其不同組織、不同處理時(shí)間的表達(dá)情況。以18S RNA作為內(nèi)參基因, 參照One Step PrimeScript1 miRNA cDNA synthesis kit說明書設(shè)計(jì) amiRcpd的特異引物, 試劑盒提供的通用引物見表3。

表3　馬鈴薯qRT-PCR分析相關(guān)基因引物Table 3　Gene-specific primers sequences for qRT-PCR analysis of potato

參照One Step PrimeScript1 miRNA cDNA synthesis kit說明書, PCR體系含2×SYBR Premix ExTaqII (2×) 10 μL、10 μmol L-1引物各 1 μL, cDNA 模板2μL, 加 RNase-free ddH2O 至終體積 20 μL。PCR 條件為95℃預(yù)變性10 s; 95℃ 5 s, 60℃ 25 s, 40個(gè)循環(huán)。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 染色劑為GoodView II。利用 SYBR熒光染料法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測與分析, 根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量[21]。重復(fù)3次試驗(yàn), 取平均值。

1.7　馬鈴薯植株的表型分析

將基因表達(dá)量較低的株系(Ci1、Ci3和 Ci4)在MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng), 每個(gè)品系6瓶, 每瓶接4個(gè)莖段, 光照溫度為(24±1)℃, 30 d后比較和觀察其形態(tài)特征, 包括轉(zhuǎn)基因與野生型試管苗的株高(根原基以上部分長度)、根長(根系長度平均值)、莖粗(距離莖基部 2 cm處測定縱橫二項(xiàng)直徑的平均值)、植株鮮重(從培養(yǎng)基中取出整個(gè)植株, 用蒸餾水洗凈, 濾紙吸干水分后的重量)等指標(biāo)。每個(gè)株系取長勢均勻的10株, 用螺旋測微儀測量株高、根長、莖粗, 用電子天平稱量植株鮮重。試驗(yàn)重復(fù)3次, 取平均值。

1.8　模擬干旱脅迫處理

試管苗生長15 d時(shí), 在超凈工作臺上, 將培養(yǎng)瓶中液體培養(yǎng)基替換為含有 20% PEG-8000的 50 mL MS培養(yǎng)基[22], 以不加PEG的MS培養(yǎng)基作為對照, 分別進(jìn)行干旱脅迫處理0、2、4和6 d。每次處理后, 在超凈工作臺上取馬鈴薯葉片, 迅速用液氮冷凍, 放于-80℃冰箱保存, 用于基因表達(dá)量分析。脅迫處理15 d的植株, 一部分用于表型分析, 即從3個(gè)株系Ci1、Ci3和Ci4中, 分別取長勢均勻的5株,用于株高、根長、莖粗、植株鮮重等形態(tài)指標(biāo)分析。另一部分更換為MS液體培養(yǎng)基(含8%蔗糖)誘導(dǎo)試管薯, 在(24±1)℃全黑暗條件下, 40 d收獲, 從3個(gè)株系Ci1、Ci3和Ci4中分別選取大小均勻的10個(gè)微型薯, 測定薯鮮重(從培養(yǎng)基中取出微型薯, 用蒸餾水洗凈, 濾紙吸干水分后的重量)和直徑(從培養(yǎng)基中取出微型薯, 用蒸餾水洗凈, 濾紙吸干水分后的直徑)。重復(fù)3次試驗(yàn), 取平均值。

1.9　馬鈴薯植株的生理生化指標(biāo)測定

PEG-8000脅迫處理15 d后, 取植株所有葉片參考 Bates等[23]的比色法測定脯氨酸(Pro)含量, 參考Ding等[24]的硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量?；旌厦科?株植株所有葉片為1個(gè)處理。重復(fù)3次, 取平均值。

1.10　數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007整理與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù), 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析, 用Duncan’s法進(jìn)行顯著性差異分析(P＜0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1　馬鈴薯pCPB121-amiRcpd表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pRS300為模板, 通過重疊 PCR在第 1輪的PCR中擴(kuò)增出了5'臂(片段a)、中心環(huán)(片段b)和3'臂(片段c), 其長度分別為272、171和298 bp。利用2%瓊脂糖凝膠電泳純化片段a、b、c (圖1)。

圖1　合成amiRNA前體a、b和c片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1　PCR products of recombinant plasmid amiRNAs of a, b,and cM： DL2000 marker; 1： 片段 a; 2： 片段 b; 3： 片段 c。M： DL2000 marker; 1： fragment a; 2： fragment b; 3： fragment c.

以3個(gè)DNA片段a、b和c的混合物作模板, 以A和 B為引物擴(kuò)增產(chǎn)物 d, 其長度為 701 bp (圖2-a)。通過測序確認(rèn)產(chǎn)物 d為目的片段, 分別用KpnI和SacI雙酶切載體 pCPB121和 amiRNAs前體, 回收酶切后的目的片段, 并進(jìn)行連接構(gòu)建pCPB121-amiRcpd表達(dá)載體。表達(dá)載體pCPB121-amiRcpd的酶切鑒定, 表達(dá)載體雙酶切結(jié)果在512 bp處有條帶(圖 2-b), 說明 pCPB121-amiRcpd的amiRNAs表達(dá)載體構(gòu)建成功。如圖3進(jìn)一步測序結(jié)果, 質(zhì)粒 pRS300中內(nèi)源 miR319a的20個(gè)核苷酸替換為我們設(shè)計(jì)選擇的21個(gè)核苷酸的amiRNAs序列。

2.2　根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯莖段和薯片遺傳轉(zhuǎn)化

試管苗莖段在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d左右再生出綠色小芽試管薯薄片在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)35 d后再生出綠色小芽, 當(dāng)綠芽長到1 cm左右時(shí), 轉(zhuǎn)接到含100 mg L-1Kan和200 mg L-1Carb的選擇性生根培養(yǎng)基中, 大約10 d左右部分生根。將生根植株轉(zhuǎn)接入含有3%蔗糖的普通MS培養(yǎng)基中擴(kuò)繁。

2.3　轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系PCR檢測

用nptII特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng), 共有5株轉(zhuǎn)化株系獲得與預(yù)期676 bp相符的目標(biāo)條帶, 而NT植株中無該條帶, 說明其為轉(zhuǎn)amiRcpd基因陽性植株(圖 4)。

圖2　合成amiRNAs前體d片段檢測Fig. 2　Test of recombinant plasmid amiRNAs of fragment da： d 片段菌落 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物; b： 雙酶切驗(yàn)證。M： DL2000 marker;1： 片段 d。a： PCR products of fragment d; b： Kpn I/Sac I double enzyme digestion products of fragment d; M： DL2000 marker; 1： fragment d.

圖3　合成amiRNA前體d片段的測序結(jié)果Fig. 3　Sequencing results of recombinant plasmid amiRNA of fragment d上面藍(lán)色部分代表原pRS300載體上miR319a的成熟序列和其反向序列; 下面紅色部分代表經(jīng)PCR擴(kuò)增后替換的StCPD成熟序列和其反向序列。The blue section represents the mature sequence of miR319a on the original pRS300 vector and its reverse sequence, the red part represents the mature sequence of potato miR167 and its reverse sequence after PCR amplification.

圖4　以PCR法檢測轉(zhuǎn)基因植株Fig. 4　Verification of transgenic plants by PCR assay of nptII gene M： DL2000 marker (TaKaRa); 1： pBI121 質(zhì)粒陽性對照; 2： 非轉(zhuǎn)基因植株陰性對照; 3～7： 轉(zhuǎn)基因植株。M： DL2000 marker (TaKaRa); 1： plasmid pBI121 as a positive control; 2： untransformed potato plant as a negative control;3-7： transgenic potato plants.

2.4　轉(zhuǎn)基因試管苗的qRT-PCR檢測

StCPD基因在轉(zhuǎn)基因植株(Ci1～Ci5)中的表達(dá)量較 NT植株都顯著降低, 沒有檢測到假陽性轉(zhuǎn)基因株系。從相對表達(dá)量來看, Ci1、Ci3的干擾程度最大,其StCPD基因的干擾程度分別高達(dá)78%和90% (圖5)。

圖5　轉(zhuǎn)基因植株StCPD基因表達(dá)的qRT-PCR檢測Fig. 5 StCPD gene expression level in the transgenic plants tested by qRT-PCRNT： 非轉(zhuǎn)基因植株; Ci1～Ci5： 5個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系。NT： non-transgenic plant; Ci1-Ci5： five different transgenic plant lines.

2.5 StCPD基因在馬鈴薯中的組織表達(dá)特異性分析

分別提取StCPD基因表達(dá)量較低的3個(gè)馬鈴薯株系(Ci1、Ci3和 Ci4)的葉、莖和根的總 RNA, 以18SRNA為內(nèi)參, qRT-PCR結(jié)果表明,StCPD在馬鈴薯試管苗不同組織(根、莖和葉)中均有表達(dá), 其相對表達(dá)量為葉＞莖＞根, 葉中StCPD基因表達(dá)量是莖和根中表達(dá)量的3.05倍和1.65倍(圖6)。

2.6　轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株表型分析

由表4可知, 轉(zhuǎn)基因植株Ci1、Ci3和Ci4的株高、莖粗、根長、植株鮮重等指標(biāo)均較NT下降, 且差異顯著, 說明StCPD基因干擾表達(dá)后, 植株的長勢明顯受到抑制。

圖6　qRT-PCR分析StCPD 基因組織表達(dá)特異性Fig. 6　Tissue-specific expression level of StCPD gene in transgenic and NT potato plants tested by qRT-PCRNT： 未轉(zhuǎn)基因植株; Ci1, Ci3, Ci4： 轉(zhuǎn)基因植株; NT： 非轉(zhuǎn)基因植株; Ci1、Ci3和Ci4： 3個(gè)不同轉(zhuǎn)基因株系; 顯著性分析采用鄧肯氏新復(fù)極差法, 同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著性。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(n = 9, 即3個(gè)生物學(xué)重復(fù)×3次技術(shù)重復(fù))。NT is untransformed potato plants; Ci1, Ci3, and Ci4 are three different transgenic plant lines. Significant differences among means over the different tissues were determined according to Duncan’s test at P＜0.05. The line bars are standard errors (n = 9,i.e., three replicates × three runs of the experiment).

2.7　不同處理時(shí)間下試管苗 StCPD基因的qRT-PCR檢測

不同干旱脅迫處理的StCPD基因干擾表達(dá)和NT馬鈴薯植株的基因相對表達(dá)量差異顯著, 干旱處理的轉(zhuǎn)基因和 NT植株基因表達(dá)量均較對照增加,且隨著脅迫時(shí)間的延長基因表達(dá)量呈持續(xù)增強(qiáng)趨勢。轉(zhuǎn)基因植株的StCPD基因相對表達(dá)水平明顯低于NT植株, 尤其是干旱處理6 d時(shí),StCPD基因表達(dá)量是NT的0.68倍(圖7-A～B)。

2.8　馬鈴薯植株生理生化指標(biāo)分析

2.8.1MDA 含量變化干旱脅迫下, 轉(zhuǎn)基因和NT馬鈴薯植株的MDA含量均顯著高于其對照植株,隨著脅迫時(shí)間的延長, MDA的含量呈逐漸增加趨勢(圖8)。無論干旱處理還是對照,StCPD基因干擾表達(dá)馬鈴薯植株較NT植株的MDA含量顯著升高, 干旱脅迫下, 前者是后者的1.07～1.17倍, 而對照處理前者是后者的1.02～1.29倍(圖8)。

2.8.2游離脯氨酸含量變化在對照和干旱條件下,StCPD基因干擾表達(dá)的馬鈴薯脯氨酸含量分別是 NT植株的0.55～0.90倍和 0.57～0.84倍。干旱處理后, 轉(zhuǎn)干擾StCPD基因和 NT馬鈴薯脯氨酸含量都顯著高于對照, 隨著脅迫處理時(shí)間的延長, 脯氨酸含量呈增加趨勢(圖9)。

表4 StCPD干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型分析Table 4　Phenotypic analysis of StCPD amiRNA expressed transgenic potato plants

圖7　干旱脅迫對未轉(zhuǎn)基因(NT, A)和轉(zhuǎn)基因(B)馬鈴薯StCPD基因相對表達(dá)量的影響Fig. 7　Effects of drought stress treatments on relative expression levels of the StCPD gene in non-transgenic (NT, A) andtransgenic (B) potato plants不同處理時(shí)間(d)的顯著性差異采用鄧肯氏新復(fù)極差法分析, 柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(n = 9, 即3個(gè)生物學(xué)重復(fù)×3次技術(shù)重復(fù))。Significant differences among means over the period (d) of drought-stress treatments were determined according to Duncan’s test at P＜0.05. The line bars are standard errors (n = 9, i.e., three replicates × three runs of the experiment).

2.9　干旱脅迫對 StCPD基因干擾表達(dá)馬鈴薯植株表型的影響

在干旱處理15 d后, 轉(zhuǎn)基因植株的株高、莖粗、根長、鮮重及薯的大小和鮮重等指標(biāo)都明顯低于NT植株(圖10和表5)。NT植株的平均株高為轉(zhuǎn)基因系Ci的2.08倍, 平均莖粗為1.92倍, 平均根長為1.21倍, 平均薯鮮重為1.81倍, 平均薯直徑為1.70倍。說明StCPD基因干擾表達(dá)后, 植株的長勢明顯受到抑制, 對干旱脅迫的抵抗能力下降。

圖8　轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和未轉(zhuǎn)基因(NT)馬鈴薯丙二醛含量Fig. 8　MDA contents in transgenic and non-transgenic (NT)potato plantsMS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后, 未轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因株系各自分為兩組,其中一組用新的MS培養(yǎng)基進(jìn)行對照培養(yǎng), 另一組用含有20%PEG-8000的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)0～6 d。不同處理時(shí)間(d)的顯著性差異采用鄧肯氏新復(fù)極差法分析, 柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(n = 9, 即3個(gè)生物學(xué)重復(fù)×3次技術(shù)重復(fù))。The NT and transgenic plant lines were divided into two groups, a control group under normal conditions and another group soaked in 20% PEG-8000 for 0-6 d after growing in MS medium for 4 weeks.Significant differences among means over the period (d) of drought-stress treatments were determined according to Duncan’s test at P＜0.05. The line bars are standard errors (n = 9, i.e., 3 replicates × 3 runs of the experiment).

3　討論

RNA干擾技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮了極其重要的作用。與其他 RNAi基因沉默技術(shù)比較,amiRNA具有獨(dú)特之處, 因?yàn)?amiRNA前體會形成一個(gè)長度合適的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu), 最終生成一個(gè)amiRNA, 對靶基因具有很強(qiáng)的特異性, 脫靶率顯著降低。此外, 由于 amiRNA與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)處常會有幾個(gè)堿基的錯(cuò)配, 因而可以同時(shí)對多個(gè)序列相似的基因(如基因家族的一個(gè)成員)進(jìn)行沉默[25]。因此, 利用 amiRNA技術(shù)可以專一、高效地沉默目的基因, 更易獲得具有新表型的轉(zhuǎn)基因植物, 已被普遍用于多種植物的研究[26]。鑒于amiRNA的精準(zhǔn)性、高效性及應(yīng)用的廣泛性, amiRNA介導(dǎo)的基因沉默已經(jīng)越來越普遍地應(yīng)用于基因功能的研究或?qū)?jīng)濟(jì)植物遺傳改良[27]。

圖9　轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和未轉(zhuǎn)基因(NT)馬鈴薯脯氨酸含量Fig. 9　Proline contents in transgenic and non-transgenic (NT)potato plantsMS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后, 未轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因株系各自分為兩組,其中一組用新的MS培養(yǎng)基進(jìn)行對照培養(yǎng), 另一組用含有20%PEG-8000的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)0～6 d。不同處理時(shí)間(d)的顯著性差異采用鄧肯氏新復(fù)極差法分析, 柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(n = 9, 即3個(gè)生物學(xué)重復(fù)×3次技術(shù)重復(fù))。The NT and transgenic plant lines were divided into two groups, a control group under normal conditions and another group soaked in 20% PEG-8000 for 0-6 d after growing in MS medium for 4 weeks.Significant differences among means over the period (d) of drought-stress treatments were determined according to Duncan’s test at P＜0.05. The line bars are standard errors (n = 9, i.e., 3 replicates × 3 runs of the experiment).

圖10　轉(zhuǎn)基因植株試管苗在模擬干旱脅迫處理前后表型Fig. 10　Phenotypic difference between the transgenic test-tube plants under drought stress and control treatmentCi1和 Ci3： 對照處理的轉(zhuǎn)基因株系; Ci1’和 Ci3’： 干旱脅迫下的轉(zhuǎn)基因株系。圖中的標(biāo)尺為1 cm。Ci1, Ci3： transgenic plants of control; Ci1’, Ci3’： transgenic plants under drought stress. The scale bar is 1 cm.

表5　干旱脅迫對StCPD基因干擾表達(dá)植株表型影響Table 5　Effects of drought stress on the phenotype of StCPD interference-expressing potato plants

根據(jù)Schwab等[12]提出的amiRNA設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn), 本研究設(shè)計(jì)了針對馬鈴薯油菜素內(nèi)酯合成限速酶編碼基因StCPD的人工miRNA (amicpd), 以包含擬南芥miR319a前體序列的載體 pRS300為模板, 經(jīng)重疊PCR, 合成 amicpd前體序列, 然后將其與表達(dá)載體pCPB121連接, 構(gòu)建了StCPD基因干擾表達(dá)載體pCPB121-amiRcpd, 并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法, 分別以莖段和薯片兩種受體外植體, 將StCPD基因RNA 干擾載體轉(zhuǎn)入馬鈴薯栽培品種“紫花白”中, 獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株, 對生理生化指標(biāo)進(jìn)行分析。

qRT-PCR分析表明,StCPD基因在馬鈴薯根、莖和葉中均有表達(dá), 且葉中的表達(dá)量高于莖和根中,這可能與StCPD基因參與光合作用有關(guān)[28]。StCPD基因干擾表達(dá)使植株的長勢明顯受到抑制, 由于BRs可以促進(jìn)細(xì)胞的生長和分裂, 當(dāng)BR合成途徑中的限速酶基因干擾表達(dá)時(shí), 促使BR合成受限, 使植株的長勢明顯受到抑制。通過StCPD基因的干擾表達(dá), 進(jìn)一步分析該基因?qū)︸R鈴薯抗旱性的影響, 將為研究農(nóng)作物的抗旱功能提供科學(xué)依據(jù)。

通過PEG處理馬鈴薯試管苗, 研究干旱脅迫下StCPD基因的表達(dá)情況, 測定MDA和脯氨酸含量。結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)StCPD基因植株的基因相對表達(dá)水平明顯低于NT植株, 隨著脅迫時(shí)間的延長,StCPD基因表達(dá)量呈持續(xù)增強(qiáng)趨勢, 說明干旱處理時(shí)可以誘導(dǎo)StCPD基因的表達(dá)。干旱脅迫和對照處理下, 轉(zhuǎn)StCPD基因馬鈴薯植株較NT植株MDA含量增加;脯氨酸降低。轉(zhuǎn)基因植株的株高、莖粗, 根長, 鮮重及薯的大小和鮮重等指標(biāo)都明顯低于NT植株。

在干旱、鹽堿等非生物脅迫下, 植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量超氧自由基(ROS), 造成植物細(xì)胞膜的過氧化損傷, MDA作為膜脂過氧化的產(chǎn)物之一, 是衡量氧化脅迫的重要標(biāo)志, 用來評估氧化脅迫對膜的損傷程度[29-30]。本研究中轉(zhuǎn)基因株系葉片中 MDA含量高于NT植株, 說明干擾表達(dá)StCPD基因可以增強(qiáng)膜脂過氧化作用, 增強(qiáng)對膜系統(tǒng)的損傷, 降低馬鈴薯植株對PEG脅迫的抗性。

4　結(jié)論

StCPD基因在轉(zhuǎn)基因植株(Ci1～Ci5)中的表達(dá)量較NT植株顯著降低, 且該基因在馬鈴薯根、莖、葉中均有表達(dá), 葉中表達(dá)量最高。StCPD基因干擾表達(dá)后, 植株的長勢明顯受到抑制。干旱脅迫下,StCPD基因的表達(dá)情況影響馬鈴薯的生長發(fā)育和MDA與Pro含量, 調(diào)控馬鈴薯對干旱脅迫的抵抗能力, 研究結(jié)果為進(jìn)一步研究 BRs對馬鈴薯生長發(fā)育和對干旱脅迫的響應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

[1] Andrzej B. Metabolism of brassinosteroids in plants.Plant Physiol Biochem, 2007, 45： 95-107

[2] Sasse J. Physiological actions of brassinosteroids： an update.J Plant Growth Regul, 2003, 22： 276-288

[3] Nomura T, Bishop G J. Cytochrome P450s in plant steroid hormone synthesis and metabolism.Phytochem Rev, 2006, 5：421-432

[4] Bancos S, Szatma A M, Castle J, Kozma-Bognár L, Shibata K,Tyokota T, Bishop G J, Nagy F, Szekeres M. Diurnal regulation of the brassinosteroid biosyntheticCPDgene inArabidopsis.Plant Physiol, 2006, 141： 299-309

[5] Hammond S M, Bernstein E, Beach D, Hannon, G. J.RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.Nature, 2000, 404： 293-296

[6] Zhang J, Wang Y, Zhu P, Wang X, Lv M, Feng H.SiRNA-mediated silence of protease-activated receptor-1 minimizes ischemic injury of cerebral cortex through HSP70 and MAP2.J neurol, 2012, 320： 6-11

[7] Warthmann N, Chen H, Ossowski S, Weigel D, Hervé P.Highly specific gene silencing by artificial mirnas in rice.Plant J, 2009, 18： 1121-1133

[8] Molnar A, Bassett A, Thuenemann E, Schwach F, Karkare S,Ossowski S, Weigel D, Baulcombe D. Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in the unicellular algaChlamydomonas reinhardtii.Plant J, 2009, 58： 165-174

[9] Zhao L Q, Li H L, Li R, Li W, Hua J P, Guo Y D. Cloning of cotton delta-12 oleate desaturase geneFAD2-1and construction of its ihpRNA and amiRNA interference vectors.Agric Sci Technol, 2012, 13： 2281-2283

[10] Alvarez J P, Pekker I, Goldshmidt A, Blum E, Amsellem Z,Esheda Y. Endogenous and synthetic micrornas stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species.Plant Cell, 2006, 18： 1134-1151

[11] Niu Q W, Lin S S, Reyes J L, Chen K C, Wu H W, Yeh S D,Chua N H. Expression of artificial microRNAs in transgenicArabidopsis thalianaconfers virus resistance.Nat Biotechnol,2006, 24： 1420-1428

[12] Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D.Highly specific gene silencing by artificial microRNAs inArabidopsis.Plant Cell, 2006, 18： 1121-1133

[13] 張獻(xiàn)賀, 孔穩(wěn)穩(wěn), 李勇, 李晶. 人工miRNA沉默基因的研究. 生物技術(shù)通報(bào), 2014, (4)： 50-56 Zhang X H, Kong W W, Li Y, Li J. Study of gene silencing by artificial miRNA.Biotechnol Bull, 2014, (4)： 50-56 (in Chinese with English abstract)

[14] 張曉輝, 鄒哲, 張余洋, 李漢霞, 葉志彪. 從反義 RNA到人工 miRNA的植物基因沉默技術(shù)革新. 自然科學(xué)進(jìn)展,2009, 19： 1029-1037 Zhang X H, Zou Z, Zhang Y Y, Li H X, Ye Z B. Technology innovation of plant gene silencing from antisense RNA to artificial miRNA.Prog Nat Sci, 2009, 19： 1029-1037 (in Chinese with English abstract)

[15] Ossowski S, Schwab R, Weigel D. Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs.Plant J,2008, 53： 674-690

[16] Tzfira T, Tian G W, Lacroix B, Vyas S, Li J, Leitner-Dagan Y,Krichevsky A, Taylor T, Vainstein A, Citovsky V. pSAT vectors： a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.Plant Mol Biol, 2005, 57： 503-516

[17] Choi K, Park C, Lee J, Oh M, Noh B, Lee I.Arabidopsishomologs of components of the SWR1 complex regulate flowering and plant development. Development, 2007, 134：1931-1941

[18] Zhou X Y, Zhang N, Yang J W, Si H J. Functional analysis of potato gene： a rate-limiting enzyme in brassinosteroid biosynthesis under polyethylene glycol-induced osmotic stress.Crop Sci,2016, 56： 2675-2687

[19] 司懷軍, 謝叢華, 柳俊. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯試管薯遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及反義class I patatin基因的導(dǎo)入. 作物學(xué)報(bào), 2003,29： 801-805 Si H J, Xie C H, Liu J. An efficient protocol forAgrobacterium-mediated transformation with microtuber and the introduction of an antisenseclass I patatingene into potato.Acta Agron Sin, 2003, 29： 801-805 (in Chinese with English abstract)

[20] Edwards K, Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.Nucl Acids Res, 1991, 19： 1349

[21] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-delta delta C(T)) method.Methods, 2001, 25： 402-408

[22] 武亮亮, 姚磊, 馬瑞, 朱熙, 楊江偉, 張寧, 司懷軍. 馬鈴薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鑒定. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42： 1112-1121 Wu L L, Yao L, Ma R, Zhu X, Yang J W, Zhang N, Si H J.Cloning and functional identification ofATHB12gene of HD-Zip I Family in potato (Solanum tuberosumL.).Acta Agron Sin, 2016, 42： 1112-1121 (in Chinese with English abstract)

[23] Bates L S, Waldren R P, Teare I D. Rapid determination of free proline for water-stress studies.Plant Soil, 1973, 39：205-207

[24] 丁玉梅, 馬龍海, 周曉罡, 姚春馨, 董祿風(fēng), 孫茂林. 干旱脅迫下馬鈴薯葉片脯氨酸、丙二醛含量變化及與耐旱性的相關(guān)性分析. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 26： 106-110 Ding Y M, Ma L H, Zhou X G, Yao C X, Dong L F, Sun M L.Effects of drought stress on free proline and malonaldedyde contents in potato leaves and correlation analysis of drought-tolerant level among different varieties.Southwest China J Agric Sci,2013, 26： 106-110 (in Chinese with English abstract)

[25] Sestili F, Janni M, Doherty A, Botticella E. D’Ovidio R,Masci S, Jones H D, Lafiandra D. Increasing the amylose content of durum wheat through silencing of theSBEIIagenes.BMC Plant Biol, 2010, 10： 144

[26] 蘇君藝, 陸璇璇, 朱維寧, 張林生. 小麥WZY2基因 RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, 40(11)： 66-72 Su J Y, Lu X X, Zhu W N, Zhang L S. Construction of RNAi expression vector ofWAY2gene from wheat and its genetic transformation.J Northwest Univ(Nat Sci Edn), 2012,40(11)： 66-72 (in Chinese with English abstract)

[27] 王會平, 遇玲, 鄒世慧, 陳璟, 郭余龍, 李名揚(yáng). 利用amiRNA技術(shù)沉默矮牽牛查爾酮合成酶基因. 園藝學(xué)報(bào),2012, 39： 2491-2498 Wang H P, Yu L, Zou S H, Chen J, Guo Y L, Li M Y. Silencing of chalcone synthase genes by artificial microRNA inPetunia.Acta Hortic Sin, 2012, 39： 2491-2498 (in Chinese with English abstract)

[28] 武海軍. 胡楊油菜素內(nèi)酯合成酶基因CPD(PeCPD)的克隆及功能分析. 蘭州大學(xué)博士學(xué)位論文, 甘肅蘭州, 2012 Wu H J. Cloning and Function Analysis ofPopulus euphraticaBrassinosteroids Biosynthase GeneCPD(PeCPD). PhD Dissertation of Lanzhou University, Lanzhou, China, 2012 (in Chinese)

[29] 姜麗麗. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BcBCP1基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯抗旱性研究.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 黑龍江哈爾濱, 2008 Jiang L L.Agrobacterium-Mediated Transformation of Potato with Drought Resistance Gene BcBCP1. MS Thesis of Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang, China, 2008 (in Chinese)

[30] 惠非瓊, 彭兵, 樓兵干, 林福呈, 聶長春, 劉劍. 印度梨形孢通過促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)提高煙草耐鹽性. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2014, 22： 168-176 Hui F Q, Peng B, Lou B G, Lin F C, Nie C C, Liu J.Piriformospora indicaimproves salt tolerance inNicotiana tobacumby promoting the synthesis of osmolyte and inducing the expression of stress resistance genes.J Agric Biotechnol, 2014, 22： 168-176(in Chinese with English abstract)