張宏軍　 宿振起　 柏貴華　 張　旭　 馬鴻翔　 李　騰　 鄧　云買春艷　 于立強　 劉宏偉　 楊　麗　 李洪杰,*　 周　陽,*

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程, 北京 100081; 2 河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所, 河北石家莊050035; 3 Department of Agronomy, Kansas State University, Manhattan, KS 66506, USA; 4 USDA-ARS / Hard Winter Wheat Genetics Research Unit, Manhattan, KS 66506, USA; 5 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 / 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點實驗室, 江蘇南京210014;6 福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 福建建陽354200; 7 新鄉(xiāng)矮敗小麥育種技術(shù)創(chuàng)新中心, 河南新鄉(xiāng)453731; 8 石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院趙縣試驗基地, 河北趙縣051530

小麥赤霉病(Fusariumhead blight, FHB)是由鐮孢屬(Fusariumspp.)引起的一種世界性真菌病害,主要危害麥穗和籽粒, 不僅造成產(chǎn)量損失, 而且其引起的真菌毒素還嚴(yán)重危害人畜健康[1]。受氣候變暖以及秸稈還田、免耕栽培等耕作制度改變的影響,小麥赤霉病發(fā)生區(qū)域由長江中下游麥區(qū)迅速向黃淮冬麥區(qū)擴展, 目前已經(jīng)由次要病害上升為黃淮冬麥區(qū)的一種主要病害[2]。在長江中下游麥區(qū), 利用中感或感病品種間雜交, 從抗性超親分離后代中選育出一批豐產(chǎn)性好、中抗或中感赤霉病的品種[2]。然而,作為我國小麥主產(chǎn)區(qū)的黃淮冬麥區(qū)[3], 由于歷史上赤霉病不是該麥區(qū)小麥的主要病害, 因此抗赤霉病育種沒有受到廣泛關(guān)注, 該麥區(qū)培育和推廣的絕大多數(shù)小麥品種都高感赤霉病。發(fā)現(xiàn)和培育抗赤霉病小麥種質(zhì)資源, 提高小麥生產(chǎn)品種對赤霉病的抗性已經(jīng)成為黃淮冬麥區(qū)主要育種目標(biāo)之一。

研究發(fā)現(xiàn), 抗赤霉病基因/QTL主要有兩類, 分別是抗擴展(Type II)相關(guān)基因, 包括Fhb1[4-5]、Fhb2[6]、Fhb3[7]和Fhb7[8], 以及抗侵入(Type I)相關(guān)基因, 包括Fhb4[9]和Fhb5[10]。其中, 位于3B染色體上的Fhb1是目前發(fā)現(xiàn)效應(yīng)最大的、抗性最穩(wěn)定的抗赤霉病基因[11]。利用Fhb1分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù), 已在美國[12-13]、加拿大[14]、澳大利亞[15]、日本[16]等發(fā)達國家育成一批小麥新品種, 其赤霉病抗性顯著提高。黃淮冬麥區(qū)小麥赤霉病的發(fā)生年度間變化很大,在發(fā)病輕的年份, 難以在田間條件下對育種材料進行準(zhǔn)確的抗病性表型鑒定。穩(wěn)定的表型鑒定也是黃淮冬麥區(qū)小麥抗赤霉病育種遇到的難題, 分子標(biāo)記輔助選擇不僅有助于擺脫表型鑒定難的困境, 而且還可以加速育種進程。本研究利用黃淮冬麥區(qū)高感赤霉病小麥品種周麥 16的矮敗小麥近等基因系(以下簡稱矮敗周麥16)做母本, 與6個攜帶Fhb1基因供體親本雜交和回交, 構(gòu)建了6個回交群體, 目的是分析黃淮冬麥區(qū)小麥品種遺傳背景下Fhb1基因?qū)Τ嗝共】剐缘挠绊? 同時比較同一遺傳背景下來自不同供體的Fhb1基因?qū)Τ嗝共〉目剐? 為分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在黃淮冬麥區(qū)小麥抗赤霉病品種的培育提供實驗依據(jù)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1　回交群體的構(gòu)建

周麥16是黃淮冬麥區(qū)南片的主栽品種之一, 也是近年來該麥區(qū)應(yīng)用最廣泛的骨干親本。利用周麥16與矮敗小麥的不育株雜交, 并用周麥16作為輪回親本與后代中的不育株連續(xù)回交, 培育出矮敗周麥16。矮敗周麥16后代總是有一半數(shù)量的高稈可育株和一半數(shù)量的矮稈雄性不育株?？捎昱c周麥16相似, 不育株除株高較矮和雄性不育以外, 其他性狀與輪回親本周麥16相似。2014年, 利用矮敗周麥16的不育株作母本, 與攜帶Fhb1基因的中抗赤霉病小麥品種(系)寧麥9號、生選6號、建陽798、建陽84、蘇麥 3號和寧麥 13雜交, 產(chǎn)生 6個 F1組合。2015年, 利用周麥16作父本, 分別與6個F1組合中的不育株回交, 獲得BC1F1種子。2016年, 采用Fhb1基因的KASP標(biāo)記檢測6個BC1F1群體, 對攜帶Fhb1基因的不育株繼續(xù)回交, 選擇攜帶Fhb1基因的可育株用于赤霉病抗性鑒定。

淮麥20是黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病鑒定的中感對照,在本研究中作為抗赤霉病人工接種鑒定和田間病圃自然鑒定的中感赤霉病對照。另外, 在人工接種鑒定中, 揚麥158和安農(nóng)8455分別作為中抗赤霉病對照和高感赤霉病對照。

1.2　赤霉病抗性表型評價

2016年 10月, 將來自上述 6個回交群體攜帶Fhb1基因的11個可育株和11個不攜帶Fhb1基因的可育株、輪回親本周麥16、中感赤霉病對照品種淮麥20、中抗赤霉病對照品種揚麥158和高感赤霉病的對照品種安農(nóng)8455種植在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院(南京市)赤霉病鑒定圃, 采用單花滴注法[17]人工接種鑒定。采用完全隨機區(qū)組設(shè)計, 單行區(qū), 行長 2.0 m, 行距0.3 m, 株距5.0 cm, 2次重復(fù)。單花滴注的赤霉菌孢子液10 μL, 孢子濃度為5 × 105mL-1。在始花期, 每個株系接種10穗, 套袋保濕72 h后, 在彌霧保濕條件下繼續(xù)生長, 接種后21 d調(diào)查病小穗數(shù), 作為赤霉病抗性評價指標(biāo)[17]。

2016年11月, 將上述用于人工接種鑒定的所有可育株、輪回親本、中感對照品種淮麥20種植在福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所赤霉病田間鑒定圃進行自然鑒定。采用完全隨機區(qū)組設(shè)計, 單行區(qū), 行長1.0 m, 行距0.3 m, 株距5.0 cm, 3次重復(fù)。揚花后20 d, 每個材料每重復(fù)調(diào)查15穗。采用病情指數(shù)作為田間病圃鑒定的評價指標(biāo)[18]。

利用Microsoft Excel 2007數(shù)據(jù)分析工具對攜帶和不攜帶供體Fhb1基因的回交后代病小穗數(shù)和病情指數(shù)進行t測驗。利用SAS v9.2軟件(SAS Institute)對不同F(xiàn)hb1供體的回交后代間病小穗數(shù)和病情指數(shù)分別進行多重比較分析(LSD法)。

1.3　Fhb1基因的KASP標(biāo)記檢測

利用 DNA快速提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取小麥葉片的基因組 DNA。采用BIO-RAD S1000 Thermal Cycler PCR System(Bio-Rad Biotechnology Laboratory, 美國) PCR擴增儀, 5 μL PCR 體系包括 2.5 μL KASP Master Mix(Laboratory of the Government Chemist, 英國), 正反引物 0.056 μL (100 μmol L-1), Mg2+0.04 μL (50 mmol L-1),DNA 模板(20～50 ng μL-1) 2.2 μL, 0.205 μL 去離子 H2O。

采用降落PCR擴增, 程序為95°C熱啟動15 min,9 個降落循環(huán)(95°C 20 s, 65°C 20 s, 從 65°C 每個循環(huán)降低 1°C), 95°C 變性 10 s, 57°C 退火 60 s, 35個循環(huán), 延伸5 min[19]。反應(yīng)結(jié)束后, 在酶標(biāo)儀SYNERGY H1MF microplate reader (BioTek Instruments, Inc., 美國)上讀取熒光數(shù)據(jù), 并導(dǎo)入 Kluster Caller software version 2.24.0.11 (http：//kbioscience.co.uk/)作基因分型。

2　結(jié)果與分析

2.1　回交后代基因型分析

利用Fhb1基因 KASP標(biāo)記對供體親本寧麥 9號、生選6號、建陽798、建陽84、蘇麥3號、寧麥13和輪回親本周麥16進行基因型檢測, 6個供體親本全部含有Fhb1基因, 而輪回親本周麥16不含有Fhb1基因。同時, 利用該標(biāo)記對6個BC1F1回交群體共650個不育株和349個可育株進行基因型分析, 不育株共檢測出60株攜帶Fhb1基因, 這些不育株用作母本繼續(xù)與輪回親本回交; 可育株共檢測出40株含有Fhb1基因, 從中隨機選取種子量充足的11個可育株用于赤霉病抗性人工接種和自然病圃鑒定。

2.2　同一供體回交后代赤霉病抗性比較

為了比較同一供體Fhb1基因?qū)Τ嗝共】剐缘挠绊? 以及在同一遺傳背景下來自不同供體的Fhb1基因?qū)Τ嗝共】剐缘挠绊? 分別從上述相應(yīng)的 6個回交群體中選取11株攜帶Fhb1基因的可育株和11株不攜帶Fhb1基因的可育株, 按株系種植, 進行赤霉病抗性對比分析, 同時對攜帶Fhb1基因的可育株與輪回親本周麥16、中感赤霉病對照淮麥20、高感赤霉病對照安農(nóng)8455及中抗對照揚麥158的赤霉病抗性進行比較。人工接種鑒定的發(fā)病情況比較充分(圖1), 來自6個供體攜帶Fhb1基因的11個株系的平均病小穗數(shù)和平均病情指數(shù)分別比輪回親本周麥16 小 8.1 (P＜ 0.01)和 28.4 (P＜ 0.01); 與不攜帶Fhb1的11個株系相比, 平均病小穗數(shù)和平均病情指數(shù)分別少 4.8 (P＜ 0.01) 和 4.0 (圖 2)。整體而言, 11個攜帶Fhb1基因株系的赤霉病抗性達到中感對照淮麥20水平。單花滴注接種鑒定結(jié)果表明, 除建陽798外的5個供體回交群體中攜帶Fhb1基因的株系, 病小穗數(shù)均顯著低于不含有Fhb1基因的株系(P＜ 0.05或P＜ 0.01)。5個供體回交群體的田間病圃鑒定結(jié)果與人工接種鑒定結(jié)果趨勢一致, 僅寧麥13表現(xiàn)不一致。其中, 攜帶寧麥9號和生選6號Fhb1基因的回交后代株系病情指數(shù)顯著低于不攜帶Fhb1的回交后代株系(P＜ 0.05)。

2.3　不同供體回交后代赤霉病抗性比較

盡管攜帶來自于6個供體Fhb1基因的回交后代對赤霉病均表現(xiàn)出一定的抗性, 但是不同供體回交后代在抗病性上表現(xiàn)出顯著差異。根據(jù)單花滴注接種法鑒定結(jié)果, 抗病性由強到弱依次為生選 6號、蘇麥3號、建陽84、寧麥9號、寧麥13和建陽798的回交后代(表1), 生選6號回交后代對赤霉病抗性接近中抗水平; 根據(jù)田間病圃自然發(fā)病鑒定結(jié)果,抗病性由強到弱排序為生選 6號、建陽 798、建陽84、蘇麥3號、寧麥9號和寧麥13回交后代。兩種鑒定方法的鑒定結(jié)果均表明, 生選 6號的回交后代抗病性表現(xiàn)最好。

圖1　單花滴注接種鑒定攜帶和不攜帶供體Fhb1基因的回交后代、輪回親本及對照赤霉病抗性表現(xiàn)Fig. 1　Performance of FHB resistance in the backcrossing progenies with or without Fhb1 gene from different donors, recurrent parent and controls using the floret-inoculation method攜帶寧麥9號(A)、生選6號(B)、建陽798 (C)、建陽84 (D)、蘇麥3號(E)和寧麥13 (F) Fhb1基因回交后代的病小穗數(shù)明顯少于不攜帶供體Fhb1基因的回交后代。輪回親本周麥16較中感對照淮麥20 (G)、高感對照安農(nóng)8455較中抗對照揚麥158 (H)具有更多的病小穗數(shù)。+： 攜帶 Fhb1 基因; -： 不攜帶 Fhb1 基因; RP： 輪回親本; MS： 中感; HS： 高感; MR： 中抗。The number of diseased spikelets of backcrossing progenies with Fhb1 gene from donors Ningmai 9 (NM 9, A), Shengxuan 6 (SX 6, B),Jianyang 798 (JY 798, C), Jianyang 84 (JY 84, D), Sumai 3 (SM 3, E), and Ningmai 13 (NM 13, F) were obviously lower than the backcrossing progenies without Fhb1 gene. The recurrent parent Zhoumai 16 (ZM 16) and the highly susceptible control Annong 8455 (AN 8455)had more number of diseased spikelets than Huaimai 20 (HM 20), the moderately susceptible control (G) and Yangmai 158 (YM 158), the moderately resistant control (H). +： Fhb1 genotype; -： non-Fhb1 genotype; RP： recurrent parent; MS： moderately susceptible; HS： highly susceptible; MR： moderately resistant.

表1　攜帶不同供體Fhb1基因的回交后代間病小穗數(shù)和病情指數(shù)比較Table 1　Comparison of number of diseased spikelets and disease index among the backcrossing progenies with Fhb1 gene from different donors

圖2　攜帶不同供體Fhb1基因回交后代與輪回親本、中感對照及不攜帶Fhb1基因回交后代間病小穗數(shù)和病情指數(shù)比較Fig. 2　Comparison of number of diseased spikelets and disease index between backcrossing progenies with Fhb1 gene from different donors and recurrent parent, moderately susceptible control and the backcrossing progenies without Fhb1 gene攜帶Fhb1基因的所有回交后代與輪回親本周麥16 (A)、中感對照淮麥20 (B)和不攜帶Fhb1基因的所有回交后代(C)病小穗數(shù)和病情指數(shù)比較。攜帶寧麥9號Fhb1基因的回交后代(D)、攜帶生選6號Fhb1基因的回交后代(E)、攜帶建陽798 Fhb1基因的回交后代(F)、攜帶建陽84 Fhb1基因的回交后代(G)、攜帶蘇麥3號Fhb1基因的回交后代(H)和攜帶寧麥13 Fhb1基因的回交后代(I)分別與其不攜帶Fhb1基因的回交后代間病小穗數(shù)和病情指數(shù)比較。NDS： 病小穗數(shù)(人工接種); DI： 病情指數(shù)(自然發(fā)病)。++： 攜帶Fhb1基因的所有回交后代; RP： 輪回親本; MS： 中感對照; --： 不攜帶Fhb1基因的所有回交后代; +： 攜帶Fhb1基因的回交后代; -： 不攜帶Fhb1基因的回交后代。誤差線上*和**分別表示在P ＜ 0.05和P ＜ 0.01水平下差異顯著。Comparisons of the number of diseased spikelets and disease index were carried out between all Fhb1 backcrossing progenies and the recurrent parent Zhoumai 16 (A), the moderately susceptible control Huaimai 20 (B) and all non-Fhb1 backcrossing progenies (C), and between non-Fhb1 and Fhb1 backcrossing progenies from the donor cultivars Ningmai 9 (D), Shengxuan 6 (E), Jianyang 798 (F), Jianyang 84 (G),Sumai 3 (H) and Ningmai 13 (I). NDS： number of diseased spikelets (floret-inoculation method); DI： disease index (natural infection nursery);++： all Fhb1 backcrossing progenies; RP： recurrent parent; MS： moderately susceptible control; --： all Fhb1 backcrossing progenies; +：Fhb1 backcrossing progenies; -： non-Fhb1 backcrossing progenies. * and ** above the error bars indicate significant difference at P ＜ 0.05 and P ＜ 0.01, respectively.

3　討論

矮敗小麥具有雄性敗育徹底、不育性穩(wěn)定、異交結(jié)實率高的優(yōu)點, 同時, 由于顯性矮稈基因Rht-D1c與顯性雄性不育基因Ms2緊密連鎖, 矮稈不育株與正常株高的可育株很容易區(qū)別, 簡化了可育株和不育株的人工鑒定和標(biāo)記過程, 是理想的小麥遺傳改良工具[20-21]。我們把矮敗小麥的Rht-D1c和Ms2基因回交轉(zhuǎn)育到黃淮冬麥區(qū)推廣品種和骨干親本, 培育出了這些品種和骨干親本的近等基因系,例如, 矮敗周麥16、矮敗鄭麥9023、矮敗濟麥22、矮敗輪選 987等。本研究利用矮敗周麥16與具有Fhb1基因的品種(系)雜交和回交, 利用 KASP標(biāo)記對后代進行Fhb1基因型分析, 對攜帶Fhb1基因的矮稈不育株, 繼續(xù)與黃淮麥區(qū)的品種(系)回交; 對攜帶Fhb1基因的可育株進行赤霉病抗性鑒定和農(nóng)藝性狀選擇, 培育符合黃淮冬麥區(qū)生態(tài)類型、赤霉病抗性得到顯著改良的新品種。這種策略發(fā)揮了矮敗小麥雜交方便、回交后代群體大的優(yōu)勢, 有利于較快地選擇出既具有輪回親本優(yōu)良的農(nóng)藝性狀、赤霉病抗性又得到改良的新品種。

抗赤霉病基因Fhb1位于3B染色體Xgwm533.1-Xgwm493標(biāo)記區(qū)間內(nèi), 抗性等位變異來自蘇麥3號[4-5]。陸維忠[22]采用4個赤霉病抗病品種與2個感病品種構(gòu)建的6個群體進行抗赤霉病QTL發(fā)掘證實, 抗病品種攜帶的主效 QTL均在 3B染色體Xgwm533.1-Xgwm493之間, 單個標(biāo)記的選擇效率達到70%。在此基礎(chǔ)上, Liu等[23]進一步將Fhb1定位在231 kb區(qū)間, 并開發(fā)了共顯性特異標(biāo)記 UMN10, 其選擇效率明顯高于SSR標(biāo)記。在本研究中, 利用Fhb1的功能KASP標(biāo)記鑒定發(fā)現(xiàn), 含有Fhb1基因的品種一般對赤霉病的抗性較好, 例如, 中抗赤霉病品種(系)生選6號、蘇麥3號、建陽84、寧麥9號、寧麥13和建陽798均含有Fhb1基因; 同時也發(fā)現(xiàn)有些赤霉病抗性較好的品種不含有Fhb1基因(例如揚麥158), 但未發(fā)現(xiàn)既具有該標(biāo)記又高感赤霉病的品種。這一方面說明Fhb1基因?qū)Τ嗝共】剐缘挠行? 另一方面也說明除Fhb1基因外, 有些品種可能攜帶其他抗赤霉病基因。

在抗病基因作圖群體中,Fhb1能夠在不同的遺傳背景下解釋 20%～60%的表型變異[4,24-25], 是公認(rèn)的用于赤霉病改良的優(yōu)異基因。目前, 該基因也是僅有幾個可以用于小麥分子標(biāo)記輔助育種的目標(biāo)基因之一, 并取得一定的效果[12-16]。與輪回親本周麥16相比, 本研究6個回交群體中攜帶供體Fhb1基因的株系平均病小穗數(shù)減少, 平均病情指數(shù)顯著降低,抗性水平達到或者超過中感赤霉病的對照品種淮麥20, 而且所有回交后代平均病小穗數(shù)顯著低于不含有Fhb1的回交后代, 表明利用Fhb1基因分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)能夠有效地提高該麥區(qū)小麥品種赤霉病抗性水平。與赤霉病抗性有關(guān)的基因很多, 育種上要在短時間內(nèi)把多個抗赤霉病基因聚合在一起難度很大, 黃淮麥區(qū)抗赤霉病育種可以采取循序漸進的辦法, 通過大群體回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇,快速把Fhb1基因轉(zhuǎn)育到主栽品種或苗頭品系中, 使育成品種對赤霉病的抗性水平由目前的高感變?yōu)橹懈? 然后再進行多個抗赤霉病基因的聚合, 進一步提高品種對赤霉病的抗性水平。

盡管不同供體攜帶相同的Fhb1基因, 但回交后代的赤霉病抗性存在顯著差異。田間病圃自然發(fā)病和單花滴注兩種鑒定方法的結(jié)果表明, 生選 6號回交后代比其他供體的后代對赤霉病的抗性更強。生選6號是以中感赤霉病的寧麥8號為母本與中抗赤霉病的寧麥 9號為父本雜交選育而成[26], 具有很好的豐產(chǎn)性, 而且在赤霉病抗性上表現(xiàn)超親遺傳, 抗性水平達到高抗, 與蘇麥 3號相當(dāng)。分子標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)生選6號具有更多其雙親不具備但在蘇麥3號和望水白中存在的抗性基因座[27]。本研究中生選 6號回交后代表現(xiàn)中抗的赤霉病抗性是否與其具有其他抗性基因座有關(guān)需要進一步研究。寧麥 9號中抗赤霉病, 它的衍生品種寧麥13具有更多的赤霉病抗性基因座, 而且在赤霉病抗性上優(yōu)于寧麥 9號[28]。與其親本不同, 寧麥9號的回交后代在抗病性上優(yōu)于寧麥13的回交后代, 這可能與遺傳背景效應(yīng)有關(guān)。

4　結(jié)論

6個回交群體中攜帶Fhb1基因的回交后代在平均病小穗數(shù)和平均病情指數(shù)上均顯著低于輪回親本周麥16和不含有Fhb1基因的回交后代, 赤霉病抗性達到中感水平。不同供體回交后代在抗病性上表現(xiàn)出明顯差異, 其中最好的是生選6號。通過Fhb1基因分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良黃淮冬麥區(qū)小麥品種的赤霉病抗性是可行的。

致謝感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所夏先春博士在KASP基因分型方面提供的技術(shù)支持。

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