毛瑞濤，陳偉，鄒嶺，李自慧，葉甲舟，白濤，陳潔，陳健康，王翠，劉寧，楊曉麗，吳飛翔

1.吉林大學(xué) 中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130000；2.廣西醫(yī)科大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，廣西南寧 5300021；3.湘南學(xué)院 附屬醫(yī)院，湖南 郴州 423000；4.中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院 檢驗科，北京 100039

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)生成和鈣離子貯存的主要場所。當(dāng)細(xì)胞的環(huán)境由于生理或病理條件改變時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白增加或鈣離子濃度改變，均可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)或未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）[1]。UPR主要通過IRE1α、PERK、ATF6信號通路，此3條通路的激活可引起炎癥侵襲、轉(zhuǎn)移和基因組不穩(wěn)定性等。同時，高表達(dá)的信號分子如Xbp1、IRE1和ATF4等能引起淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞的聚集，釋放多種細(xì)胞因子包括趨化因子CXCL家族、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等。因此，當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，腫瘤細(xì)胞中各種細(xì)胞因子水平的變化將觸發(fā)不同信號通路的反應(yīng)[2]。我們應(yīng)用熒光定量PCR等方法，檢測了衣霉素（tunicamycin，TM）刺激誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對HepG2肝癌細(xì)胞不同趨化因子表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所鐘輝課題組惠贈，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，于含95%空氣和5%CO2的37℃恒溫箱里培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次，用于實驗的細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期。

人CXCL1 ELISA試劑盒、衣霉素、丙二醇甲醚醋酸酯（TPA）、DMSO購自Sigma-Aldrich公司；焦碳酸二乙脂（DEPC）購自上海生物工程公司；TRNzol-A+總RNA提取試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版（SYBR Green）購自天根生化科技有限公司；TransScript Frist-Strand cDNA Synthesis試劑盒購自全式金生物技術(shù)公司；EP管、無RNase的PCR管、0.2 mL八連排透明PCR薄壁管購自Axygen公司。

1.2 細(xì)胞處理

當(dāng)HepG2細(xì)胞長至70%時，換成新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，再分別用5 mmol/ mL DMSO，0、2.5、5、10 mmol/mL TM處理，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，分別在培養(yǎng)12和24 h后收集細(xì)胞及培養(yǎng)基。

1.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR測定HepG2細(xì)胞中CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8的mRNA表達(dá)。提取HepG2細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃ 30 min逆轉(zhuǎn)錄，85℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）。PCR反應(yīng)體系為10 μL（反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 15 min，變性95℃ 10 s，退火延伸60℃ 30 s）。各樣品均以βactin作為內(nèi)參照，引物序列見表1。

1.4 ELISA檢測培養(yǎng)基中的CXCL1含量

ELISA測定HepG2細(xì)胞中的CXCL1含量。將制備的HepG2細(xì)胞勻漿液于4℃、13 000 r/min離心10 min，提取上清液，采用雙抗體夾心法測定HepG2細(xì)胞中的CXCL1濃度，所有操作均按照ELISA檢測試劑盒說明書執(zhí)行。用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行比較，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下趨化因子mRNA的表達(dá)情況

用不同濃度的TM刺激HepG2細(xì)胞，使其發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，分別在12和24 h收集HepG2細(xì)胞提取總mRNA，通過熒光定量PCR檢測其細(xì)胞內(nèi)趨化因子的mRNA水平。結(jié)果見圖1，TM刺激組CXCL1、CXCL2、CXCL3的mRNA水平比對照組顯著升高（P＜0.05)，其中CXCL1的mRNA水平隨不同濃度梯度的TM刺激依次增高。但CXCL8的mRNA水平降低（P＜0.05)。以上結(jié)果說明HepG2細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，不同趨化因子的表達(dá)趨勢有所不同。

表1 引物及序列

圖1 不同濃度TM刺激下HepG2細(xì)胞內(nèi)趨化因子mRNA的表達(dá)

2.2 趨化因子CXCL1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的分泌水平

用ELISA檢測經(jīng)不同濃度TM刺激后HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基上清中CXCL1的分泌水平，結(jié)果見圖2，TM刺激組的CXCL1水平明顯高于對照組，且CXCL1水平和TM濃度呈正相關(guān)。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件。研究表明[3-5],當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所處的微環(huán)境受到病原微生物、營養(yǎng)底物缺乏、脂肪超載、炎性因子、缺血缺氧等應(yīng)激原嚴(yán)重持續(xù)性刺激后出現(xiàn)過多未折疊或錯誤折疊蛋白,能夠引起多條信號通路反應(yīng)（UPR），應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡主要通過PERK、IRE1α[7-8]、ATF-6信號通路[9]，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境。當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，PERK信號通路可增加CHOP的表達(dá)，減少抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）的表達(dá)，增加促凋亡蛋白（Bid、Bim、Noxa、Puma）的表達(dá)[10-13]，最終激活細(xì)胞線粒體凋亡途徑[14]。同時，PERK磷酸化引起真核起始因子2α（elF2α）發(fā)生磷酸化，elF2α磷酸化后可選擇性地促進(jìn)活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF-4）的翻譯[15]，ATF-4可激活CHOP及GADD34的表達(dá)[16]，而GADD34通過促進(jìn)蛋白合成增加氧自由基的產(chǎn)生而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，活化的IRE1α可與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）相互作用形成IRE1α-TRAF2復(fù)合物，IRE1α-TRAF2復(fù)合物可激活TNFα依賴性的細(xì)胞凋亡信號1（ASK1），ASK1進(jìn)一步激活JNK及P38絲裂素活化蛋白激酶（P38MAPK）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。P38MAPK磷酸化后可激活轉(zhuǎn)錄因子CHOP，通過增加Bim及死亡受體5（DR5）基因表達(dá)、降低Bcl-2基因表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18-19]。另有研究發(fā)現(xiàn)ATF-6的過度表達(dá)可誘導(dǎo)CHOP mRNA表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)ATF-6通過下調(diào)抗凋亡分子蛋白MCL-1而增加細(xì)胞凋亡[20]。

圖2 不同濃度TM刺激下HepG2細(xì)胞內(nèi)CXCL1的表達(dá)

對卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)[21]，通過siRNA下調(diào)卵巢癌細(xì)胞表達(dá)CXCLl可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖；通過基因重組轉(zhuǎn)入CXCL1基因上調(diào)CXCL1表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步的研究表明重組CXCL1能夠激活卵巢癌細(xì)胞的表皮生長因子受體（EGFR）磷酸化過程，提示EGFR旁路在卵巢癌增殖過程中發(fā)揮重要作用，EGFR進(jìn)一步通過活化下游的MAPK通路引起細(xì)胞增殖。在CXCL1與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究中，已經(jīng)證實CXCL1可以直接促進(jìn)人喉鱗狀細(xì)胞癌[22]、乳腺癌細(xì)胞[23]、膀胱癌細(xì)胞[24]、腎腫瘤細(xì)胞[25]、結(jié)腸癌細(xì)胞[26]的侵襲轉(zhuǎn)移；另一方面，CXCL1可以通過促進(jìn)腫瘤血管形成，間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[27-28]。對膀胱癌的研究表明，CXCL1的表達(dá)上調(diào)可以募集更多的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMS）和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF），反過來腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型可以募集更多的CXCL1。多數(shù)研究證實CXCL1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有關(guān)。但CXCL1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為腫瘤微環(huán)境中的一部分，CXCL1是否參與UPR，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑，目前還沒有研究予以證實。本研究通過熒光定量PCR檢測趨化因子CXCL家族在人肝癌HepG2細(xì)胞中表達(dá)量，結(jié)果表明TM組CXCL1、CXCL2、CXCL3的mRNA水平比對照組升高，且CXCL1的mRNA水平與TM濃度具有相關(guān)性，而CXCL8的mRNA水平降低。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一個復(fù)雜的過程，除了已知的IRE1α、PERK及ATF6，還有很多細(xì)胞因子參與其中。本實驗探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對CXCL家族趨化因子的影響，而這些趨化因子對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的進(jìn)一步影響將是值得研究的科學(xué)問題。

[1] HetzC.The unfolded protein response:controlling cellfate decisionsunderER stressand beyond[J]. Nat Rev Mol Cell Bio,2012,13(2):89-102.

[2] Cubillos-Ruiz J R,Silberman P C,Rutkowski M R, et al.ER stress sensor XBP1 controls anti-tumor im?munity by disrupting dendritic cell homeostasis[J]. Cell,2015,161(7):1527-1538.

[3] Messlik A,Schmechel S,Kisling S,et al.Loss of tolllike receptor 2 and 4 leads to differential induction of endoplasmic reticulum stress and proapoptotic re?sponses in the intestinal epithelium under conditions of chronic inflammation[J].J Proteome Res,2009,8(10): 4406-4417.

[4] Hu S,Ciancio M J,Lahav M,et al.Translational inhi?bition ofcolonic epithelialheatshock proteinsby IFN-gamma and TNF-alpha in intestinal inflammation [J].Gastroentero,2007,133(6):1893-904.

[5] McGuckin M A,Eri R D.Intestinal secretory cell ER stress and inflammation[J].Biochem Soc Trans,2011, 39(4):1081-1085.

[6] Hughes A,Oxford A E.Endoplasmic reticulum stress and unfolded protein response in cartilage pathophysi?ology;contributing factors to apoptosis and osteoarthri?tis[J].Int J Mol Sci,2017,18(3):665.

[7] Jiang D,Niwa M,Koong A C.Targeting the IRE1al?pha-XBP1 branch of the unfolded protein response in human diseases[J].Semin Cancer Biol,2015,33:48-56.

[8] Jiang S,Yan C,Shao M L,et al.Fibroblast growth factor 21 is regulated by the IRE1α-XBP1 branch of the unfolded protein response and counteracts endo?plasmic reticulum stress-induced hepatic steatosis[J].J Biol Chem,2014,289(43):29751-29765.

[9] Guo F J,Xiong Z.ATF6 upregulates XBP1S and in?hibits ER stress-mediated apoptosis in osteoarthritis cartilage[J].Cell Signal,2014,26(2):332-342.

[10]Herold M J,O'Reilly L A,Lin A,et al.Evidence against upstream regulation of the unfolded protein re?sponse(UPR)by pro-apoptotic BIM and PUMA[J]. Cell Death Dis,2014,5:e1354.

[11]Kazi A,Sun J,Sung S S,et al.The BH3 alpha-heli?cal mimic BH3-M6 disrupts Bcl-X(L),Bcl-2,and MCL-1 protein-protein interactionswith Bax,Bak, Bad,or Bim and induces apoptosis in a Bax- and Bim-dependent manner[J].J Biol Chem,2011,286(11): 9382-9392.

[12]Kim H,Tu H C,Ren D,et al.Stepwise activation of BAX and BAK by tBID,BIM,and PUMA initiates mi?tochondrial apoptosis[J].Mol Cell,2009,36(3):487-499.

[13]Ren D,Tu H C,Kim H,et al.BID,BIM,and PU? MA are essentialforactivation ofthe BAX- and BAK-dependent cell death program[J].Science,2010, 330(6009):1390-1393.

[14]Han X,Zhou J,Zhang P,et al.IRE1alpha dissociates with BiP and inhibits ER stress-mediated apoptosis in cartilage development[J].Cell Signal,2013,25(11): 2136-2146.

[15]Notte A,Rebucci M,Fransolet M,et al.Taxol-in?duced unfolded protein response activation in breast cancer cells exposed to hypoxia:ATF4 activation regu?lates autophagy and inhibits apoptosis[J].Int J Bio?chem Cell B,2015,62:1-14.

[16]Harding H P,Novoa I,Zhang Y,et al.Regulated translation initiation controls stress-induced gene ex?pression in mammalian cells[J].Mol Cell,2000,6(5): 1099-1108.

[17]Nagelkerke A,Bussink J,Mujcic H,et al.Hypoxia stimulatesmigration ofbreastcancercellsvia the PERK/ATF4/LAMP3-arm of the unfolded protein re?sponse[J].Breast Cancer Res,2013,15(1):R2.

[18]Heath-Engel H M,Chang N C,Shore G C.The endo?plasmic reticulum in apoptosis and autophagy:role of the BCL-2 protein family[J].Oncogene,2008,27(50): 6419-6433.

[19]Chonghaile T N,Gupta S.BCL-2 modulates the un?folded protein response by enhancing splicing of X-box binding protein-1[J].Biochem Biophys Res Com?mun,2015,466(1):40-45.

[20]Moore K,Hollien J.Ire1-mediated decay in mammali?an cellsrelieson mRNA sequence,structure,and translational status[J].Mol Biol Cell,2015,26(16):2873-2884.

[21]Bolitho C,Hahn M A,Baxter R C,et al.The chemo?kine CXCL1 induces proliferation in epithelial ovarian cancer cells by transactivation of the epidermal growth factor receptor[J].Endocr Relat Cancer,2010,17 (4):929-940.

[22]Han L,Liu W,Chen Y,et al.GROalpha expression and its prognostic implications in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Neoplasma,2015,62(1):152-158.

[23]Kronski E,Fiori M E,Barbieri O,et al.miR181b is induced by the chemopreventive polyphenol curcumin and inhibits breast cancer metastasis via down-regula?tion of the inflammatory cytokines CXCL1 and 2[J]. Mol Oncol,2014,8(3):581-595.

[24]Kawanishi H,Matsui Y,Ito M,et al.Secreted CX?CL1 is a potential mediator and marker of the tumor invasion of bladder cancer[J].Clin Cancer Res,2008, 14(9):2579-2587.

[25]AliS,Lazennec G.Chemokines:noveltargetsfor breast cancer metastasis[J].Cancer Metast Rev,2007, 26(3-4):401-420.

[26]Li A,Varney M L,Singh R K.Constitutive expres?sion of growth regulated oncogene(gro)in human co?lon carcinoma cells with different metastatic potential and its role in regulating their metastatic phenotype [J].Clin Exp Metastas,2004,21(7):571-579.

[27]Miyake M,Goodison S.Expression of CXCL1 in hu?man endothelialcells induces angiogenesis through the CXCR2 receptor and the ERK1/2 and EGF path?ways[J].Lab Invest,2013,93(7):768-778.

[28]BelperioJA,KeaneM P,ArenbergD A,et al. CXC chemokinesin angiogenesis[J].JLeukoc Biol, 2000,68(1):1-8.