劉文山，劉立輝，傅榮昭

邦泰生物工程（深圳）有限公司，廣東 深圳 518102

畢赤酵母由于其強大的分泌表達能力，已經成為最常用的真核表達系統(tǒng)，利用畢赤酵母表達各種的蛋白和酶類已廣泛應用于醫(yī)藥、工業(yè)和食品等領域[1]。此外，畢赤酵母已被美國食品藥品管理局（FDA）認定為 GRAS（GenerallyRecog?nized as Safe）微生物，畢赤酵母表達的乳糖酶也在國內被批準用于食品行業(yè)?？梢灶A期，越來越多的食品用酶將可以通過畢赤酵母生產。

對于食品用酶而言，其安全評價至關重要，不僅要求生產菌株的安全性，而且還要求其不能含有非食品級菌種來源的功能性DNA片段[2]。然而，目前所使用的絕大多數畢赤酵母表達載體最終均將大腸桿菌來源的抗性標記和大腸桿菌復制區(qū)整合到了酵母基因組上，這對于食品安全而言是不利的。pAO815和pPink系列載體雖然在酵母中不用抗性篩選，但也含有大腸桿菌的氨芐青霉素或卡那霉素抗性標簽及大腸桿菌復制區(qū)，并最終整合到酵母基因組上。因此，我們嘗試開發(fā)一種產生高拷貝但不會將這些細菌來源的DNA片段整合到酵母基因組上的質粒。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α用于克隆，采用LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)；畢赤酵母菌株GS115用于提取基因組擴增ADE2基因；畢赤酵母GS115Δade2由本公司保存，作為蛋白表達宿主，在YPD培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)；DNA聚合酶為南京諾唯贊生物科技有限公司的Phanta高保真酶；質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均來源于天根公司；蛋白marker為Thermo的PageRuler；DNA marker、限制性內切酶和T4DNA連接酶均來源于TaKaRa公司；引物及序列見表1。

1.2 pMA的構建

pMA構建流程如圖1所示。分別PCR擴增如下片段：①片段1：AOX1啟動子的5'端（BglⅡ和SacⅠ之間的部分，209 bp），以pPIC9k為模板，采用引物1和2擴增（擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次；72℃延伸5 min）；②片段2：Amp抗性標簽和pUC復制區(qū)（1762 bp），以pPIC9K為模板，采用引物3和4擴增（擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min）；③片段3：AOX1啟動子的SacⅠ位點到AOX1終止子（1414 bp），以pPIC9k為模板，采用引物5和6擴增（擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min；④片段4：ADE2篩選標記（1927 bp，3'端加入BglⅡ位點），以GS115基因組為模板，采用引物7和8擴增（擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min）。

表1 PCR引物列表

用凝膠回收試劑盒回收上述片段，各取1 μL混合后作為模板，進行重疊延伸PCR擴增（擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環(huán)30次；72℃延伸5 min）。將擴增得到的片段用BglⅡ酶切，回收后用T4DNA連接酶自連，轉化大腸桿菌DH5α，對AOX1啟動子到AOX1終止子部分測序正確后保存，將該載體命名為pMA。

1.3 表達載體pMA-AOLAC的構建

以pETAOLAC（含有來源于米曲霉的β-半乳糖甘酶表達基因，GenBank登錄號為E12172，兩端分別為EcoRⅠ和NotⅠ位點）為模板，用EcoRⅠ和NotⅠ酶切后插入pMA的EcoRⅠ和NotⅠ位點，利用引物9和10進行PCR驗證。將構建的質粒命名為pMA-AOLAC。

1.4 重組酵母的構建

酵母轉化采用電轉化法[3]，電轉條件為0.2 mm電轉杯，1500 V電壓。電擊完成后涂布MD平板（1.34 g/L YNB，2%葡萄糖，0.4 mg/L生物素，50 mg/L組氨酸），30℃培養(yǎng)2～3 d，挑取白色轉化子接種到新的MD平板上，并用引物9和10進行菌落PCR驗證。

1.5 蛋白表達及檢測

重組酵母接種于BMGY培養(yǎng)基（10 g/L酵母提取物，20 g/L胰蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀溶液，1%甘油，1.34 g/L YNB，0.4 mg/L生物素）中，30℃培養(yǎng)至D600nm為2～6，3000 r/min離心5 min，將菌體重懸到BMMY培養(yǎng)基（將BMGY中的甘油替換為0.5%甲醇）中于30℃培養(yǎng)，每24 h補加一次0.5%甲醇，96 h后取上清進行SDS-PAGE。β-半乳糖甘酶活性測定采用文獻報道的方法[4]，一個單位定義為每分鐘產生1 μmol鄰硝基苯酚所需酶量。

2 結果

2.1 表達載體pMA的構建

載體的構建如圖1，通過重疊延伸PCR將AmpR+ori片段插入AOX1啟動子的SacⅠ位點（片段1和片段2之間），并將ADE2表達框插入AOX1終止子的3'端。各片段PCR回收后瓊脂糖凝膠電泳如圖2A所示。將最終PCR產物用BglⅡ酶切，連接后得到的載體命名為pMA。

2.2 β-半乳糖苷酶重組表達菌株的構建及表達分析

圖1 載體pMA的構建

將來源于米曲霉的β-半乳糖苷酶編碼基因插入pMA的EcoRⅠ和NotⅠ位點，將構建的載體命名為pMA-AOLAC。該載體經SacⅠ酶切后切除AmpR+ori片段，回收AOX1啟動子3'端-α信號肽-AOLAC-AOX1終止子-ADE2表達框-AOX1啟動 子 5'端（圖 2B），用 于 轉 化 畢 赤 酵 母GS115Δade2。挑取白色轉化子進行PCR驗證（圖3A）后保存到甘油管中。挑取2株陽性克隆進行發(fā)酵測試，結果如圖3B，可見明顯的蛋白表達條帶，經測定發(fā)酵液最高酶活為380 U/mL。

3 討論

畢赤酵母常用載體如pPIC系列載體一般采用G418或博來霉素等抗性標記進行高拷貝篩選，有些載體還帶有一個大腸桿菌的氨芐青霉素或卡那霉素的抗性標記。這些抗性標記如氨芐青霉素、卡那霉素、博來霉素、潮霉素等的抗性基因大多來源于大腸桿菌轉座子[5-7]，最終構建的重組菌株均將這些標記基因及大腸桿菌復制區(qū)整合到了酵母基因組上。對于表達食品用酶來說，這些片段通常是不允許的。此外，這些載體包含過多的元件使載體偏大，不利于載體構建和整合。這些基因還可能轉移到環(huán)境中的其他微生物中，從而造成危害。

圖2 pMA各片段的PCR擴增（A）及驗證（B）M：DNA marker；1～5：分別為片段1、2、3、4和1～4重疊PCR產物；6：pMA的雙酶切驗證；7：pMA的SacⅠ線性化

圖3 重組酵母菌株的菌落PCR驗證（A）及發(fā)酵液的SDS-PAGE檢測（B）M1：DNA marker；M2：蛋白 marker；1～5：不同的轉化子；6：GS115Δade2/pMA；7，8：GS115Δade2/pMA-AOLAC的1、2號轉化子

為了使大腸桿菌來源的片段不整合到酵母基因組，我們以pPIC9K為模板，將氨芐青霉素抗性基因AmpR和大腸桿菌復制區(qū)ori插入AOX1啟動子的SacⅠ位點。這樣在進行基因組整合時，用SacⅠ酶切載體即可將該AmpR+ori片段切除，將該片段以外的部分整合到AOX1位點。為了避免使用G418抗性標記篩選而達到高拷貝的整合，我們采取pPINK載體的思路，將G418抗性基因替換為ADE2表達框。ADE2表達框來源于畢赤酵母基因組，包含截短ADE2啟動子的部分序列、ADE2編碼基因及其終止子。其中截短的啟動子僅具有微弱的轉錄活性，從而必須產生多拷貝才能滿足ADE2缺陷菌株對該酶的需求[8]。最終，除了目標基因以外，單次整合到基因組上的片段僅3.6 kb，遠小于pPIC系列載體。除了將AmpR+ori片段插入AOX1中間，還可以將其插入ADE2的中間，最終將目標片段整合到基因組的ADE2位點。我們后續(xù)還會考慮將甲醇誘導的AOX1啟動子替換為GAP等組成型啟動子。為了驗證載體pMA的實用性，我們利用該載體表達來源于米曲霉的β-半乳糖苷酶，結果達到了較高的表達水平。后續(xù)我們將利用該系統(tǒng)嘗試表達不同的食品用酶，以降低一些食品用酶的生產成本。

[1] 朱泰承,李寅.畢赤酵母表達系統(tǒng)發(fā)展概況及趨勢[J].生物工程學報,2015,31(6):929-938.

[2] 路福平,劉逸寒,薄嘉鑫.食品酶工程關鍵技術及其安全性評價[J].中國食品學報,2011,11(9):188-193.

[3] Cregg J M,Tolstorukov I,Kusari A,et al.Expression in the yeast Pichia pastoris[J].Methods Enzymol,2009, 463:169-189.

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[5] Hedges R W,Jacob A E.Transposition of ampicillin resistancefrom RP4 tootherreplicons[J].MolGen Genet,1974,132(1):31-40.

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[8] Du M,Battles M B,Nett J H.A color-based stable multi-copy integrant selection system for Pichia pasto?ris using the attenuated ADE1 and ADE2 genes as auxotrophic markers[J].Bioeng Bugs,2012,3(1):32-37.