陳麗　秦玉寶　鄔劍　唐鷺　林百豐　張學(xué)志

耐藥結(jié)核病是我國(guó)目前結(jié)核病控制工作面臨的主要挑戰(zhàn)之一。2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告結(jié)果顯示，我國(guó)結(jié)核病耐多藥率為6.8%[1]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),2014年全球有48萬(wàn)例耐多藥結(jié)核病患者，中國(guó)是耐多藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)最嚴(yán)重的國(guó)家之一，全球約1/4的耐多藥結(jié)核病患者來(lái)自中國(guó)[2-4]?？焖?、準(zhǔn)確地進(jìn)行耐藥診斷對(duì)于治療耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病、控制耐藥結(jié)核病的傳播極為關(guān)鍵。

線性探針技術(shù)是基于多重PCR原理，并將PCR擴(kuò)增、反向雜交、膜顯色技術(shù)合為一體的快速診斷藥物耐藥性的實(shí)驗(yàn)方法[5]。筆者選取2015年4月至2017年1月本實(shí)驗(yàn)室采用線性探針技術(shù)(GenoType?MTBDRplus)檢測(cè)的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的耐藥性結(jié)果，與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，分析線性探針技術(shù)的檢測(cè)效果，以期為本地區(qū)推廣使用線性探針技術(shù)提供參考依據(jù)。

資料和方法

一、菌株和試劑來(lái)源

1．菌株來(lái)源：2015年4月至2017年1月，黑龍江省結(jié)核病預(yù)防控制中心收到縣(區(qū))結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)報(bào)送的結(jié)核病患者痰標(biāo)本387份，獲取分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物分離株387株。經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)固體培養(yǎng)法(簡(jiǎn)稱(chēng)“固體法”)菌種初篩和線性探針兩種方法一致確認(rèn)為NTM者8株，固體法菌種初篩結(jié)果為NTM而線性探針檢測(cè)結(jié)果為MTB的1株，兩種方法比較藥敏試驗(yàn)結(jié)果時(shí)將此9例NTM去除；最終可供比較的MTB 臨床分離株為378株，其中初治患者臨床分離株334株、復(fù)治患者44株。

2．試劑：線性探針試驗(yàn)采用德國(guó)Hain Lifescience公司的GenoType?MTBDRplus檢測(cè)試劑盒。比例法分枝桿菌藥敏試驗(yàn)和PNB菌種初篩培養(yǎng)基采用珠海貝索生物技術(shù)公司商品化培養(yǎng)基。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.試劑和步驟：線性探針實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑采用德國(guó)Hain Lifescience公司配套設(shè)備和GenoType?MTBDRplus試劑，試驗(yàn)方法按照GenoType?MTBDRplus 耐藥檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果判讀：每個(gè)探針試條共有27個(gè)反應(yīng)條帶，包含3個(gè)對(duì)照條帶和24個(gè)探針條帶，見(jiàn)圖1。每個(gè)有效的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群測(cè)試其試條的對(duì)照條帶均應(yīng)顯色，分別是標(biāo)記物質(zhì)控(CC)、擴(kuò)增質(zhì)控(AC)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。野生型菌株試條模式為野生型探針(WT)均顯色，突變探針(MT)均不顯色。WT包含各自基因最重要的耐藥區(qū)。如果至少有一個(gè)野生型探針信號(hào)缺失(不顯色)，則表示試驗(yàn)菌株對(duì)相應(yīng)的抗生素耐藥。MT檢測(cè)一些能夠引起耐藥最常見(jiàn)的突變，每個(gè)與野生型模式不同的帶型表示試驗(yàn)菌株耐藥。用rpoB探針獲得的帶型可以得出試驗(yàn)菌株對(duì)RFP耐藥結(jié)論；用katG探針獲得的帶型可以得出試驗(yàn)菌株對(duì)INH高水平耐藥的結(jié)論，用inhA探針獲得的帶型可以得出試驗(yàn)菌株對(duì)INH低水平耐藥的結(jié)論。

圖1　線性探針試條的27個(gè)反應(yīng)條帶圖

2.藥敏試驗(yàn)方法：分枝桿菌菌種初篩參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]的規(guī)定選用PNB固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)試驗(yàn)法。比例法分枝桿菌藥敏試驗(yàn)參照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[7]，使用2～3周菌齡的新鮮菌株，研磨比濁，倍比稀釋為10-2和10-4濃度，分別接種在比例法藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基上，4周后報(bào)告結(jié)果。

3.質(zhì)量控制：經(jīng)國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌藥敏試驗(yàn)熟練度測(cè)試和分子生物學(xué)藥敏試驗(yàn)診斷并進(jìn)行質(zhì)量控制，本實(shí)驗(yàn)室每年均達(dá)到質(zhì)量控制要求。

4.相關(guān)定義：(1)敏感度指真耐藥率，即試驗(yàn)對(duì)象被判斷為耐藥的概率，計(jì)算公式為：真耐藥株數(shù)/(真耐藥株數(shù)+假敏感株數(shù))×100%。(2)特異度指真敏感率，即試驗(yàn)對(duì)象被判斷為敏感的概率，計(jì)算公式為：真敏感株數(shù)/(真敏感株數(shù)+假耐藥株數(shù))×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；一致性比較采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa≥0.75表示兩者一致性較好。

結(jié)　　果

從獲得分枝桿菌分離株至報(bào)告耐藥性結(jié)果，比例法藥敏試驗(yàn)所用的時(shí)間為32～60 d(包括重復(fù)試驗(yàn)的時(shí)間)，平均報(bào)告時(shí)間為42 d；GenoType?MTBDRplus 線性探針試驗(yàn)所用的時(shí)間為6～36 h(包括重復(fù)試驗(yàn)的時(shí)間)，平均報(bào)告時(shí)間為18 h。

一、兩種方法檢測(cè)378株MTB臨床分離株對(duì)RFP和INH的耐藥結(jié)果比較(表1)。

線性探針?lè)ㄅc比例法檢測(cè)RFP的耐藥率分別為12.2%(46/378)和10.6%(40/378)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.60,P>0.05)，兩種方法檢測(cè)的總體一致率為97.4%(368/378)，具有很高的一致性(Kappa=0.87)。以比例法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，線性探針檢測(cè)對(duì) RFP耐藥的敏感度和特異度分別是95.0%(38/40)和97.6%(330/338)。

比例法檢測(cè)對(duì)RFP敏感而線性探針?lè)z測(cè)耐藥的8株菌株,均存在野生型探針缺失(發(fā)生缺失的野生型探針?lè)謩e是WT7缺失2株、WT8缺失4株、WT4并WT5缺失2株)，其中有2株為野生型探針缺失并rpoB基因突變，6株為單純野生型探針缺陷而無(wú)rpoB基因突變。此8株菌株經(jīng)過(guò)線性探針?lè)ㄖ貜?fù)試驗(yàn)，得到的結(jié)果與首次試驗(yàn)結(jié)果完全一致。

線性探針?lè)ㄅc比例法檢測(cè)INH的耐藥率分別為14.3%(54/378)和12.2%(46/378)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.20，P>0.05)，兩種方法檢測(cè)的總體一致率為94.7%(358/378)，一致性較好(Kappa=0.77)。以比例法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，線性探針?lè)z測(cè) INH耐藥的敏感度和特異度分別是87.0%(40/46)和95.8%(318/332)。比例法檢測(cè)對(duì)INH結(jié)果敏感而線性探針?lè)z測(cè)耐藥的14株菌株，均為低水平INH耐藥，且均為WT1缺失并MUT1基因突變。此14株菌株經(jīng)過(guò)線性探針?lè)ㄖ貜?fù)試驗(yàn)，得到的結(jié)果與首次試驗(yàn)結(jié)果完全一致。

二、 兩種方法檢測(cè)378株MTB臨床分離株耐藥的結(jié)果比較(表2)

線性探針?lè)ㄅc比例法檢測(cè)的耐多藥率分別為7.4%(28/378)和7.9%(30/378)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.40，P>0.05)，兩種方法檢測(cè)的總體一致率為97.4%(368/378)，一致性較好(Kappa=0.81)。以比例法藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，線性探針?lè)z測(cè)耐藥的敏感度和特異度分別是80.0%(24/30)和98.9%(344/348)。

比例法檢測(cè)為耐藥而GenoType?MTBDRplus檢測(cè)為非耐藥的6株菌株中，有4株為對(duì)INH的檢測(cè)結(jié)果不符，2株為對(duì)RFP的檢測(cè)結(jié)果不符。線性探針檢測(cè)結(jié)果為耐藥而比例法檢測(cè)結(jié)果為非耐藥的4株菌株，均為對(duì)RFP的檢測(cè)結(jié)果不符。兩種方法結(jié)果不同的菌株經(jīng)線性探針?lè)ㄖ貜?fù)檢測(cè)，得到結(jié)果與初次檢測(cè)結(jié)果完全一致。

表1　兩種方法檢測(cè)378株MTB臨床分離株對(duì)RFP和INH的耐藥結(jié)果比較(株)

表2　兩種方法檢測(cè)378株MTB臨床分離株耐藥結(jié)果比較

注a:括號(hào)內(nèi)分子為線性探針檢測(cè)出的真耐藥株數(shù)，分母為金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)出的耐藥株數(shù)；b:括號(hào)內(nèi)分子為線性探針檢測(cè)出的真非耐藥株數(shù)，分母為金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)出的非耐藥株數(shù)

討　　論

耐藥結(jié)核病的早期診斷意義重大，但作為耐藥結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，容易造成診斷延誤。

線性探針技術(shù)是分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。GenoType?MTBDRplus分子線性探針?lè)?008年推出，可以檢測(cè)MTB是否對(duì)RFP耐藥、對(duì)INH高水平耐藥(katG帶型異于野生型)和低水平耐藥(inhA帶型異于野生型)[8-11]。其基于MTB針對(duì)不同藥物的基因突變位點(diǎn)不同，來(lái)判定MTB是否對(duì)RFP和INH耐藥——通過(guò)檢測(cè)rpoB基因突變確定對(duì)RFP的耐藥性，通過(guò)檢測(cè)katG基因和inhA基因的啟動(dòng)子區(qū)確定對(duì)INH的耐藥性，能在24 h內(nèi)完成對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)[12]，在我國(guó)一些地區(qū)已經(jīng)推廣應(yīng)用[13-14]。

黑龍江省結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室2009年引進(jìn)線性探針技術(shù)，用于結(jié)核病對(duì)RFP和INH的耐藥性檢測(cè)。筆者選取2015年4月至2017年1月間用線性探針技術(shù)對(duì)378株MTB進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，并且與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，評(píng)價(jià)線性探針技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的效果，以期為本地區(qū)推廣使用線性探針技術(shù)提供參考依據(jù)。

一、與傳統(tǒng)比例法對(duì)比線性探針?lè)z測(cè)的敏感度、特異度均較好

線性探針?lè)z測(cè)是否對(duì)RFP耐藥的結(jié)果與傳統(tǒng)比例法檢測(cè)結(jié)果的總體一致率為97.4%，其敏感度、特異度分別為95.0%和97.6%；對(duì)INH的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)比例法檢測(cè)結(jié)果的總體一致率為94.7%， 其敏感度、特異度分別為87.0%和95.8%；對(duì)耐藥的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)比例法的總體一致率為97.4%，敏感度、特異度分別為80.0%和98.9%。文獻(xiàn)報(bào)道，線性探針?lè)?檢測(cè)MTB臨床分離株是否對(duì)RFP耐藥與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一致率為95.7%～100.0%[15]，其敏感度及特異度均接近100.0%[16]；檢測(cè)MTB是否對(duì)INH耐藥與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一致率為86.25%～89.00%[15]，其敏感度為70.00%～90.00%，特異度為100.00%[16]；檢測(cè)MTB是否為耐藥株的敏感度為85.7%～88.9%[17-18]，特異度為100.0%[17]。

二、線性探針?lè)z測(cè)的重復(fù)性較好

本研究對(duì)28株MTB臨床分離株進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，得出了完全一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

三、 線性探針?lè)ǐ@得藥敏試驗(yàn)的結(jié)果更加快速

378例菌株從獲得分枝桿菌分離株至報(bào)告是否耐藥的結(jié)果，比例法藥敏試驗(yàn)平均報(bào)告時(shí)間為42 d；線性探針試驗(yàn)平均報(bào)告時(shí)間為18 h。有資料顯示，從提取核酸到報(bào)告耐藥檢測(cè)結(jié)果，線性探針?lè)ㄗ羁炜梢栽? h內(nèi)完成；而傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)最多需要40～60 d[5]。故而在耐藥結(jié)核病早期診斷方面線性探針?lè)ǜ邇?yōu)勢(shì)。

四、線性探針?lè)z測(cè)結(jié)果便于保存、復(fù)核和分析

傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果是肉眼觀察并記錄培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，計(jì)算耐藥百分比判斷耐藥結(jié)果，結(jié)果判讀后試驗(yàn)用的培養(yǎng)基則采用高壓滅菌銷(xiāo)毀。線性探針?lè)ㄒ蕴结樤嚄l方式顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試條可以粘貼在登記本上，將試條攝片后更可長(zhǎng)期保存，使實(shí)驗(yàn)資料更完整，便于復(fù)核和分析。本實(shí)驗(yàn)室自2009年起的線性探針試驗(yàn)結(jié)果試紙條在室溫避光條件下粘貼在登記本上，至今顯色條帶沒(méi)有明顯褪色。

《“十三五”全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃》要求，我國(guó)所有地市級(jí)定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)該具備開(kāi)展藥敏試驗(yàn)、菌種鑒定和分子生物學(xué)診斷的能力。

而目前我省地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室的耐藥結(jié)核病診斷仍以比例法藥敏試驗(yàn)為主，僅少數(shù)地市級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了快速藥敏試驗(yàn)，多數(shù)地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室未開(kāi)展快速藥敏試驗(yàn)。我省地域遼闊，部分地市與所轄縣區(qū)距離較遠(yuǎn)，目前采用縣區(qū)級(jí)進(jìn)行痰培養(yǎng)、地市級(jí)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)的結(jié)核病診斷模式，往往因菌株運(yùn)輸不及時(shí)，致使到達(dá)地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室的菌株已過(guò)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，需重新傳代才能做比例法藥敏試驗(yàn)，使得結(jié)核病耐藥性診斷的時(shí)間往往超過(guò)4周，甚至達(dá)到8周，影響了耐藥結(jié)核病的及時(shí)診斷和治療。

實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展新的檢測(cè)技術(shù)常需要較多資金投入，高成本問(wèn)題也常是制約新技術(shù)推廣的重要因素。一項(xiàng)關(guān)于線性探針技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)耐藥結(jié)核病的成本比較顯示，線性探針技術(shù)檢測(cè)結(jié)核病患者耐藥性的單位平均成本明顯低于傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)[14]。

綜上所述，筆者認(rèn)為線性探針技術(shù)適用于目前我省地市級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的耐藥結(jié)核病診斷。

作為分子生物學(xué)診斷方法，為了降低污染風(fēng)險(xiǎn)，線性探針?lè)ㄒ髮?shí)驗(yàn)室有合理的基礎(chǔ)設(shè)施、專(zhuān)用的PCR空間及技術(shù)熟練的實(shí)驗(yàn)員[19-20]。對(duì)于污染問(wèn)題必須以預(yù)防為主，筆者按照分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)質(zhì)量保證的要求[21]，做到嚴(yán)格地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范和安全防護(hù)，實(shí)驗(yàn)員技術(shù)培訓(xùn)要求充分達(dá)標(biāo)。建議實(shí)驗(yàn)室完全達(dá)到分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)質(zhì)量保證要求的條件后，再開(kāi)展此項(xiàng)診斷工作。

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