高陽　宋其生　周潔　張冬　王心愿　安東成

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題。耐藥結(jié)核病已經(jīng)成為全球結(jié)核病疫情急劇上升的原因之一。據(jù)WHO 報(bào)道，目前我國(guó)仍為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一[1]。全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料顯示，我國(guó)耐多藥結(jié)核病占6.8%[2]。目前我國(guó)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(簡(jiǎn)稱“結(jié)防機(jī)構(gòu)”)診斷活動(dòng)性肺結(jié)核檢測(cè)技術(shù)主要是痰涂片和痰培養(yǎng)，痰涂片的陽性檢出率較低，而固體培養(yǎng)耗時(shí)過長(zhǎng)，均不能滿足臨床診療的需求。GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“Xpert”)檢測(cè)依據(jù)半巢式實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)原理，針對(duì)MTBrpoB基因81 bp利福平耐藥區(qū)間設(shè)計(jì)引物和探針，檢測(cè)其是否發(fā)生突變。Xpert檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、安全、自動(dòng)，能同時(shí)檢測(cè)MTB及是否對(duì)利福平耐藥[3]，得到廣泛關(guān)注與認(rèn)可[4]。本研究收集大連市結(jié)核病醫(yī)院臨床就診的378例肺部疾病患者，探討Xpert檢測(cè)在新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核特別是涂陰肺結(jié)核的快速診斷及利福平耐藥快速檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

收集2015年6月—11月大連市結(jié)核病醫(yī)院臨床就診的378例肺部疾病患者。臨床按照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 288-2008)》[5]，且經(jīng)過抗結(jié)核藥物治療有效證實(shí)，268例患者診斷為新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核，其中涂陽79例，涂陰189例；男165例，女103例；年齡9～89歲，平均年齡(42±15.32)歲。其余110例患者排除肺結(jié)核，其中8例為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)肺病，不在本次研究之列；其他肺部疾病102例患者中，男60例，女42例，年齡11～81歲，平均年齡(47±16.85)歲；肺炎68例，腫瘤11例，間質(zhì)性肺病4例，支氣管擴(kuò)張15例，慢性阻塞性肺病4例[6]。

二、研究方法

1.標(biāo)本留取：每例入選患者均收集即時(shí)痰、夜間痰及晨痰標(biāo)本3份(每份樣品量在 3～5 ml)。分別進(jìn)行痰涂片、固體培養(yǎng)和Xpert檢測(cè)。

2.檢測(cè)方法：3份痰標(biāo)本均進(jìn)行萋-尼染色；若痰涂片結(jié)果為陽性，取陽性痰1 ml用作 Xpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性；若痰涂片結(jié)果為陰性，取痰標(biāo)本1 ml用作Xpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性。每例患者的3份痰標(biāo)本均進(jìn)行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)。

具體方法如下：(1)痰涂片按照文獻(xiàn)[7]中萋-尼染色法相關(guān)要求進(jìn)行涂片、染色、鏡檢并報(bào)告結(jié)果。(2)固體培養(yǎng)按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[8]中的相關(guān)要求，取適量痰標(biāo)本加入等量的4%氫氧化鈉，振蕩?kù)o置20 min，用無菌吸管吸100 μl接種到酸性羅氏培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。每周觀察結(jié)果并及時(shí)報(bào)告，若滿8周仍未有菌落生長(zhǎng)，則報(bào)告培養(yǎng)陰性。(3)比例法藥敏試驗(yàn)按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[9]中的相關(guān)要求，取培養(yǎng)基上的菌落，制備1 mg/ml菌懸液，并分別稀釋成濃度為10-2mg/ml、10-4mg/ml的菌液；取0.01 ml的10-2mg/ml和10-4mg/ml菌液，接種至含利福平(40 μg/ml)的中性羅氏培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4周后報(bào)告結(jié)果。若耐藥百分比(耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù)×100%)>1%則判定為耐藥。(4)Xpert檢測(cè)按照Xpert操作說明書進(jìn)行操作。①前處理：取1 ml痰入管中，加入痰2倍體積的樣本處理液，振蕩20 s后，靜置15 min。用專用吸管取2 ml處理后的樣液從反應(yīng)盒的加樣孔緩慢加入其內(nèi)。②檢測(cè)：開啟Xpert儀和電腦，待自檢通過后，將反應(yīng)盒放入模塊中，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增，目標(biāo)序列的檢測(cè)和結(jié)果判斷。③結(jié)果判讀：Xpert檢測(cè)對(duì)MTB的結(jié)果分為“MTB檢出”和“MTB未檢出”。Xpert對(duì)利福平耐藥的檢測(cè)結(jié)果分為“利福平耐藥檢出”和“利福平耐藥未檢出”。

三、儀器與試劑

MTB染色液、酸性和中性羅氏培養(yǎng)基、藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基及對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基，均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)公司。Xpert檢測(cè)系統(tǒng)及其配套試劑盒由美國(guó)Cepheid公司生產(chǎn)，原裝進(jìn)口。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。敏感度、特異度等計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致性比較采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75認(rèn)為兩者一致性較好。

結(jié)　　果

一、基本情況

268例臨床確診肺結(jié)核的患者中，涂片陽性79例，固體培養(yǎng)陽性117例，Xpert檢測(cè)陽性149例。189例涂陰肺結(jié)核患者中，固體培養(yǎng)陽性38例，Xpert檢測(cè)陽性70例。102例非肺結(jié)核患者中，固體培養(yǎng)陽性1例，Xpert檢測(cè)陽性2例。

二、檢測(cè)效能比較

1.三種方法對(duì)于活動(dòng)性肺結(jié)核的檢出率：268例臨床確診肺結(jié)核的患者中，涂片陽性79例，固體培養(yǎng)陽性117例，Xpert檢測(cè)陽性149例，陽性檢出率分別為29.5%(79/268)、43.7%(117/268)、55.6%(149/268)。三種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.41，P=0.000)。

2.涂陰肺結(jié)核患者采用固體培養(yǎng)和Xpert檢測(cè)的陽性率比較：189例涂陰肺結(jié)核患者中，固體培養(yǎng)陽性檢出率為20.1%(38/189)；Xpert 陽性檢出率37.0%(70/189)。二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.27，P=0.000)。

3.傳統(tǒng)培養(yǎng)和Xpert檢測(cè)在活動(dòng)性肺結(jié)核中的檢測(cè)效能：以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，固體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)核病的敏感度為43.7%(117/268)，特異度為99.0%(101/102)，陽性預(yù)測(cè)值為99.2%(117/118)，陰性預(yù)測(cè)值為40.1%(101/252)；Xpert 檢測(cè)結(jié)核病的敏感度為55.6%(149/268)，特異度為98.0%(100/102)，陽性預(yù)測(cè)值為98.7%(149/151)，陰性預(yù)測(cè)值為45.7%(100/219)(表1)。固體培養(yǎng)與Xpert檢測(cè)的敏感度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.64，P=0.006)；特異度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.00，P=1.000)。

三、比例法與Xpert檢測(cè)對(duì)利福平是否耐藥的結(jié)果分析

在固體培養(yǎng)和Xpert 檢測(cè)均陽性的113例肺結(jié)核患者中，其中比例法檢測(cè)結(jié)果為耐藥的11例中，Xpert檢測(cè)結(jié)果為耐藥的有10例、敏感的有1例；比例法檢測(cè)結(jié)果為敏感的102例中，Xpert檢測(cè)結(jié)果為敏感的有101例、耐藥的有1例。Xpert與比例法藥敏試驗(yàn)利福平耐藥一致性比較，Kappa值為0.899，說明兩種方法結(jié)果具有很好的一致性。

討　　論

結(jié)核病的早期診斷和耐藥性檢測(cè)對(duì)于結(jié)核病防治工作意義重大。我國(guó)結(jié)核病傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有涂片鏡檢和分枝桿菌培養(yǎng)等。涂片法簡(jiǎn)單、快速，但敏感度不高。培養(yǎng)法是檢測(cè)MTB的“金標(biāo)準(zhǔn)”，耗時(shí)較長(zhǎng)，需要6～8周，敏感度相對(duì)于涂片法有所提高。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核的痰涂片和傳統(tǒng)法培養(yǎng)的陽性檢出率分別為29.5%和43.7%，與既往研究結(jié)果接近[10]。近年來一些新型的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)(如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[11-12]、線性探針技術(shù)[13]、Xpert技術(shù)[3]等)得到認(rèn)可。而Xpert法有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，整個(gè)檢驗(yàn)過程只需2 h，該方法快速、簡(jiǎn)便，能同時(shí)檢測(cè)MTB及是否對(duì)利福平耐藥；封閉的反應(yīng)系統(tǒng)，對(duì)生物安全要求相對(duì)較低，最大程度地減少了操作中污染的可能性。

有報(bào)道Xpert技術(shù)的臨床檢出限為131 CFU(菌落形成單位)/ml[14]，抗酸染色鏡檢檢出限為5×103CFU/ml以上，培養(yǎng)為10～100 CFU/ml[15]。本研究268例肺結(jié)核患者標(biāo)本同時(shí)采用痰涂片、固體培養(yǎng)及Xpert檢測(cè)，以Xpert法檢出率最高，其次為培養(yǎng)法，抗酸染色法的陽性檢出率最低；涂陰標(biāo)本Xpert陽性率高于固體培養(yǎng)陽性率。本研究結(jié)果顯示，Xpert檢測(cè)涂陰肺結(jié)核患者的價(jià)值與陳子芳等[16]的研究結(jié)果相同，優(yōu)于張志學(xué)等[17]的研究，進(jìn)一步證實(shí)Xpert法臨床應(yīng)用價(jià)值高于傳統(tǒng)涂片和固體培養(yǎng)，能夠更好地輔助臨床對(duì)肺結(jié)核患者特別是涂陰肺結(jié)核患者進(jìn)行早期診斷和治療。

2010年，在南美洲、非洲和亞洲結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的多中心評(píng)估結(jié)果表明，相對(duì)于培陽、涂陽標(biāo)本，Xpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為92.2%和98.2%[18]。張治國(guó)等[19]研究以固體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測(cè)MTB的敏感度為95%，特異度為89.6%。李輝等[15]研究以固體培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測(cè)MTB的敏感度為91.93%，特異度為95.55%。以上研究都是以傳統(tǒng)固體培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)Xpert進(jìn)行檢測(cè)效能評(píng)價(jià)，不可避免會(huì)漏診很多經(jīng)氣管鏡或病理活檢等檢查診斷的肺結(jié)核患者。而本研究以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)和Xpert法進(jìn)行診斷價(jià)值評(píng)價(jià)，能夠更加全面客觀反映其對(duì)肺結(jié)核患者診斷的臨床價(jià)值。本研究顯示固體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)核病的敏感度為43.7%、特異度為99.0%，而Xpert檢測(cè)MTB的敏感度為55.6%、特異度為98.0%。結(jié)果表明，Xpert檢測(cè)可大大提高活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷率、縮短診斷時(shí)間。

表1　268例臨床診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核患者采用固體培養(yǎng)和Xpert檢測(cè)結(jié)果的比較

注敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%

利福平作為重要的抗結(jié)核藥物，被世界衛(wèi)生組織推薦為治療結(jié)核病的一線藥物，但耐利福平結(jié)核病危害嚴(yán)重。由于MDR-TB的治療時(shí)間長(zhǎng)、治療費(fèi)用昂貴、治愈率低，已成為結(jié)核病控制的重大難題，快速診斷MDR-TB對(duì)結(jié)核病防控意義重大，所以Xpert法與線性探針技術(shù)[13]等快速檢測(cè)利福平、異煙肼耐藥的技術(shù)受到關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比較，Xpert法具有極好的一致性。該結(jié)果與李妍等[20]、牛海軍等[21]的報(bào)道相近。由于大部分利福平耐藥株同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥[22]，故在利福平耐藥的情況下，一定程度上可以作為MDR-TB的篩查和監(jiān)測(cè)指標(biāo)。世界衛(wèi)生組織建議，如果將Xpert檢測(cè)應(yīng)用于利福平耐藥患病率較低的人群進(jìn)行耐藥診斷，對(duì)利福平耐藥陽性結(jié)果需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)[23]。本研究證實(shí)，進(jìn)行一次Xpert 檢測(cè)對(duì)利福平是否耐藥就可達(dá)到與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的高度一致性。如果不需要對(duì)利福平耐藥陽性結(jié)果需進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將提高M(jìn)DR-TB的診斷速度，降低MDR-TB的檢測(cè)成本。這個(gè)問題值得繼續(xù)探討。

總之，Xpert法簡(jiǎn)便、快速、安全，是敏感度、特異度都較高的分子生物學(xué)方法，并且能夠快速診斷新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核及利福平耐藥，特別是對(duì)快速診斷涂陰肺結(jié)核有較大價(jià)值，應(yīng)該引起足夠重視。其主要不足是：Xpert 需要配套價(jià)格昂貴的儀器及成本較高的試劑才能實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病和對(duì)耐利福平結(jié)核病的檢測(cè)；另外，該方法只能檢測(cè)是否對(duì)利福平耐藥而不能同時(shí)檢測(cè)是否對(duì)異煙肼耐藥[24]。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2017. Geneva: World Health Organization, 2017.

[2] 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室．2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告．中國(guó)防癆雜志，2012，34(8)：485-508．

[3] 趙雁林，歐喜超，李強(qiáng)，等．結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程．北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：174-177．

[4] 路麗蘋，陸斌，劉梅，等. GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在結(jié)核病早診斷中的應(yīng)用. 中國(guó)防癆雜志, 2017,39(1): 71-75.

[5] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 288-2008).北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[6] 牛廣明，蘇秉亮.臨床比較影像學(xué). 北京：科學(xué)出版社，2007：304-411．

[7] 趙雁林，姜廣路.痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè).北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009：5-13.

[8] 趙雁林，王黎霞，成詩(shī)明，等．分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：26-30．

[9] 趙雁林，王黎霞，成詩(shī)明，等．結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：15-26．

[10] 李強(qiáng)，陸其斌.影響痰涂片抗酸桿菌檢出率的因素分析.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8(1)：64-65.

[11] 于霞，梁倩，馬異峰，等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的初步評(píng)價(jià). 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2013,17(5): 846-849.

[12] 丁衛(wèi)忠，陳巍，石蓮，等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)效果的評(píng)估. 中國(guó)防癆雜志, 2016,38(10): 818-822.

[13] 張國(guó)欽，鐘達(dá)，陳盛玉，等.GenoType線性探針技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其藥物敏感性的價(jià)值.結(jié)核病與肺部健康雜志,2016,5(4):267-270.

[14] Helb D,Jones M,Story E,et al.Rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisand rifampin resistance by use of on-demand,near-patient technology.J Clin Microbiol,2010,48(1):229-237.

[15] 李輝，譚耀駒，李洪敏，等.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸檢測(cè)技術(shù)的診斷效果對(duì)比研究.中國(guó)防癆雜志，2014,36(6)：472-476.

[16] 陳子芳，孫本海，魏海冬，等. GeneXpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)菌陰肺結(jié)核患者輔助診斷的價(jià)值. 中國(guó)防癆雜志, 2016,38(10): 827-831.

[17] 張志學(xué)，蒼愛澤，孫靜.應(yīng)用GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)肺泡灌洗液對(duì)菌陰肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值.結(jié)核病與肺部健康雜志,2017,6(2):128-130.

[18] Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D,et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med, 2010,363(11):1005-1015.

[19] 張治國(guó), 歐喜超, 孫倩, 等. 利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究. 中國(guó)防癆雜志,2013,35(1):13-16.

[20] 李妍，張?zhí)烊A，鮮小萍，等.Xpert Mtb/RIF檢測(cè)技術(shù)診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核的價(jià)值.中國(guó)防癆雜志，2015,37(6)：586-589.

[21] 牛海軍,王歌,李明虎. GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值評(píng)估. 中國(guó)防癆雜志, 2017,39(8): 829-832.

[22] 尹青琴，申阿東. Xpert MTB/RIF試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的研究現(xiàn)狀. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2012,35(5): 363-365.

[23] World Health Organization. Rapid implementation of the Xpert Mtb/RIF diagnostic test: technical and operational‘How to’; practical considerations. Geneva: World Health Organization, 2011.

[24] 胡忠義. 結(jié)核病耐藥性檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展及存在的問題和對(duì)策. 中國(guó)防癆雜志，2013,35(11)：865-867.