蔡錦順， 關(guān)立增， 婁鞍鋼， 胡　楠

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種高傳染性的疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA與抑制PRRSV復(fù)制也有密切的關(guān)系[3]。miRNA是一類小分子非編碼單鏈RNA，大小為18～25 bp，廣泛存在于動(dòng)物和植物中，并作為重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子調(diào)控基因的表達(dá)[4]。

最近，研究證明miRNA可以通過外胞體(Exosome)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)揮生物學(xué)作用[5]。Exosome是一類由細(xì)胞通過內(nèi)吞作用形成直徑為30～100 nm的小囊泡，它通過融合細(xì)胞內(nèi)的多泡體而釋放到細(xì)胞外環(huán)境，在細(xì)胞間行使信號(hào)交流，是一種新型的細(xì)胞間信息交流方式[6]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可包裹于母乳Exosome中，母畜可以通過乳Exosome將miRNA傳遞給仔畜，并發(fā)揮生物學(xué)作用[7]。

目前，關(guān)于豬乳Exosome中與抑制PRRSV復(fù)制有關(guān)的miRNA的研究還未見報(bào)道，因此本研究將以延邊地區(qū)的長(zhǎng)白豬為材料，分離豬乳Exosome并提取總miRNA，在細(xì)胞水平上驗(yàn)證其對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的抑制作用。本研究將為PRRS的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)和途徑。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細(xì)胞和病毒Marc-145細(xì)胞和PRRSV，由延邊大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑無水乙醇、CHCl3和異丙醇，購(gòu)于北京佳蘭生物科技公司；Trizol試劑，購(gòu)于Omega公司；Ribonuclease Inhibitor，購(gòu)于大連TAKARA公司；DMEM液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青霉素、鏈霉素，購(gòu)于GIBCO公司；胎牛血清，購(gòu)于浙江杭州四季青生物工程材料有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材，購(gòu)于北京佳蘭生物科技公司；miRNA提取試劑盒，購(gòu)于北京佳蘭生物科技公司。

1.1.3主要儀器高速大容量冷凍離心機(jī)、核酸蛋白測(cè)定儀、紫外/可見光分光光度計(jì)(Eppendorf公司)；細(xì)胞培養(yǎng)CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，-80 ℃超低溫冰箱(REVCO公司)；普通冰箱(SANYO公司)；倒置生物顯微鏡(Olympus公司)；分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；超高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)；超凈工作臺(tái)(江蘇蘇州凈化公司)；超純水系統(tǒng)(廣東廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司)。

1.2　方法

1.2.1豬乳Exosome的分離收集200～300 mL延邊地方長(zhǎng)白母豬(6頭)分娩后初乳和常乳的混合樣，立即放入 -80 ℃ 冰箱儲(chǔ)存?zhèn)洹：髮?80 ℃冰箱的乳樣解凍，3 000 r/min 4 ℃離心40 min，取上清，去掉乳腺細(xì)胞碎片和乳脂蛋白等雜質(zhì)；之后12 000 r/min 4 ℃離心40 min，取上清，進(jìn)一步去掉乳脂蛋白、酪蛋白和一些細(xì)胞碎片；最后 150 000 r/min 4 ℃超高速離心3 h，獲得豬乳Exosome。

1.2.2豬乳Exosome中總miRNA的分離根據(jù)miRNA提取試劑盒步驟(北京佳蘭生物科技公司)進(jìn)行miRNA提取，最后用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度，放入-30 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細(xì)胞水平驗(yàn)證豬乳Exosome對(duì)PRRSV復(fù)制的影響

1.2.3.1Marc-145細(xì)胞的培養(yǎng)從液氮罐中取出保存的Marc-145細(xì)胞，迅速放入預(yù)熱好的37 ℃水浴鍋中，反復(fù)搖動(dòng)，使管中液體快速融化。后在離心機(jī)中1 500 r/min離心，5 min 后在超凈臺(tái)中吸去上清液，加入1 mL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，用玻璃吸管輕輕吹打形成細(xì)胞懸液。最后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基至7 mL，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶底后進(jìn)行傳代，在超凈臺(tái)中吸棄舊的培養(yǎng)基，加入2 mL PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，棄去，然后向細(xì)胞瓶中加入1 mL細(xì)胞消化液，輕輕搖勻使消化液潤(rùn)到所有細(xì)胞，在 37 ℃ 培養(yǎng)箱作用3 min后顯微鏡下觀察，在細(xì)胞變圓并有少量細(xì)胞脫落漂浮時(shí)，立即吸取消化液，加入3 mL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，用玻璃吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞完全脫離瓶底，最后根據(jù)細(xì)胞的量將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充培養(yǎng)基至5 mL，蓋好瓶蓋，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3.2Exosome對(duì)MARC-145的轉(zhuǎn)染按“1.2.3.1”節(jié)傳代方法將MARC-145細(xì)胞傳代到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將鋪好細(xì)胞小心置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約70%時(shí)，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染；取2 mL EP管，加入50 μL DMEM和10 μL Exosome(20 ng/100 μL)，輕微混勻；之后將混合液體加入到MARC-145細(xì)胞中，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，另設(shè)陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組所用試劑為PBS，轉(zhuǎn)染過程與前述相同。

1.2.3.3PRRSV的接毒試驗(yàn)和滴度測(cè)定按“1.2.3.2”節(jié)方法進(jìn)行Exosome轉(zhuǎn)染24 h后，加入MOI為0.5的PRRSV病毒液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中24、48 h，收集上清，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。取出細(xì)胞瓶，-20 ℃反復(fù)凍融3～4次，轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物至大離心管中，3 000 r/min離心5 min收集上清液，將收集得到病毒懸液，以10倍稀釋(10-1～10-8)后，將各稀釋度的病毒液接種于96孔板中的MARC-145細(xì)胞，按Reed-Muench的方法進(jìn)行病毒TCID50滴度測(cè)定。同時(shí)，在96 h后利用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞病變效應(yīng)觀察。

1.2.4細(xì)胞水平驗(yàn)證豬乳Exosome中總miRNA對(duì)PRRSV病毒復(fù)制的影響

1.2.4.1Marc-145細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法見“1.2.3.1”節(jié)。

1.2.4.2總miRNA對(duì)MARC-145的轉(zhuǎn)染取2.0 mL EP管，加入不含血清的DMEM和500 ng的總miRNA，配制成miRNA終濃度為50 nmol/L的混合液，之后按“1.2.3.2”節(jié)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。之后將混合液體加入到MARC-145細(xì)胞中，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，另設(shè)陰性對(duì)照組，試劑采用PBS。

1.2.4.3PRRSV接毒試驗(yàn)和滴度測(cè)定PRRSV接毒試驗(yàn)和滴度測(cè)定方法同“1.2.3.3”節(jié)。

2　結(jié)果與分析

2.1　豬乳Exosome對(duì)PRRSV病毒復(fù)制抑制結(jié)果

本試驗(yàn)在6孔板上對(duì)MARC-145細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，之后用Exosome和PBS進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后感染PRRSV，并在PRRSV感染后24、48 h時(shí)收集上清，測(cè)定其TCID50。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染豬乳Exosome細(xì)胞中的PRRSV滴度顯著低于轉(zhuǎn)染PBS(陰性對(duì)照)細(xì)胞中的PRRSV滴度。結(jié)果初步說明豬乳Exosome對(duì)PRRSV的復(fù)制起到了抑制作用(圖1)。

同時(shí)，本試驗(yàn)在MARC-145細(xì)胞上接種PRRSV 96 h后，在顯微鏡下對(duì)MARC-145細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察。由圖2、圖3可知，豬乳Exosome組中MARC-145細(xì)胞的形態(tài)仍呈不規(guī)則的多邊形，排列較緊密，邊緣較清晰整齊。而陰性對(duì)照組(PBS組)中MARC-145細(xì)胞形態(tài)消失，皺縮、塌陷，邊緣不清晰，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)灶狀聚集，大量細(xì)胞脫落懸浮。進(jìn)一步說明，豬乳Exosome抑制了PRRSV在Marc-145細(xì)胞上產(chǎn)生的病變反應(yīng)。證明豬乳Exosome與抑制PRRSV復(fù)制有密切的關(guān)系。

2.2　豬乳Exosome中總miRNA對(duì)PRRSV病毒復(fù)制抑制結(jié)果

本試驗(yàn)對(duì)豬乳Exosome總miRNA進(jìn)行進(jìn)一步提取，同樣按上述方法在6孔板對(duì)MARC-145細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，后用提取的總miRNA和PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后感染PRRSV，分別在24、48 h時(shí)收集上清，測(cè)定其TCID50。由圖4可知，miRNA處理組中的PRRSV滴度顯著低于陰性對(duì)照組(PBS處理組)的PRRSV滴度，說明豬乳Exosome中的miRNA對(duì)PRRSV的復(fù)制起抑制作用。

同樣本試驗(yàn)在MARC-145細(xì)胞上接種PRRSV病毒96 h后，在顯微鏡下對(duì)MARC-145細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察。由圖5、圖6可知，miRNA處理組中MARC-145細(xì)胞的形態(tài)仍呈不規(guī)則的多邊形，排列較緊密，邊緣較清晰整齊；而陰性對(duì)照組(PBS處理組)中MARC-145細(xì)胞形態(tài)開始變形或消失，細(xì)胞邊緣不清晰，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)灶狀聚集，大量細(xì)胞脫落懸浮。此結(jié)果也進(jìn)一步說明，豬乳Exosome中的某些miRNA抑制了PRRSV在Marc-145細(xì)胞上產(chǎn)生的病變反應(yīng)。證明豬乳Exosome中存在與抑制PRRSV復(fù)制有密切的關(guān)系miRNA。

3　結(jié)論與討論

miRNA對(duì)病毒調(diào)節(jié)作用是人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)之一，其實(shí)miRNA幾乎參與調(diào)控了各個(gè)領(lǐng)域的所有細(xì)胞生命活動(dòng)的發(fā)生[4]。成熟的miRNA一般是長(zhǎng)度約為22 bp單鏈RNA，成熟的miRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合，然后與靶基因的3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)功能[8]。miRNA從發(fā)現(xiàn)開始就受到病毒學(xué)研究者的高度重視，被認(rèn)為是抗病毒感染的最有效方法之一。而研究表明，miRNA可包裹于母乳的Exosome中，母豬可以通過乳Exosome將miRNA傳遞給仔豬并發(fā)揮生物學(xué)作用[7]。如Zhou等在豬乳外胞體中發(fā)現(xiàn)了大量免疫相關(guān)的miRNA，這些miRNA約有59種，其中miR-148a、30b、182和200b的豐度排在前10位，并且初乳中的數(shù)量要高于常乳，而且可抵抗惡劣的環(huán)境[9]。因此，關(guān)于乳Exosome中miRNA功能的研究正成為國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)新的熱點(diǎn)。但關(guān)于豬乳Exosome中與抑制PRRSV復(fù)制有關(guān)的miRNA的研究還未見報(bào)道，因此本試驗(yàn)首次對(duì)豬乳外胞體總miRNA對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制抑制作用進(jìn)行了研究。

本試驗(yàn)首先對(duì)豬乳Exosome進(jìn)行提取并在MARC-145細(xì)胞上初步驗(yàn)證Exosome是否對(duì)PRRSV的復(fù)制有抑制作用。通過病毒滴度測(cè)定和細(xì)胞病變觀察，證實(shí)Exosome能顯著抑制PRRSV的復(fù)制。為了驗(yàn)證Exosome對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制是否通過其含有miRNA起作用，本試驗(yàn)對(duì)Exosome的miRNA進(jìn)行了進(jìn)一步提取，并通過病毒滴度測(cè)定和細(xì)胞病變觀察證實(shí)，提取miRNA能顯著抑制PRRSV的復(fù)制。綜合上述，通過豬乳Exosome中miRNA可以抑制PRRSV復(fù)制。本試驗(yàn)結(jié)果將為下一步采用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)等方法對(duì)豬乳Exosome中的具體miRNA的挖掘并進(jìn)行功能驗(yàn)證、在細(xì)胞水平和活體水平上分析具體抑制PRRSV復(fù)制的miRNA功能及確定豬乳Exosome中miRNA抑制PRRSV病毒復(fù)制的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，將為PRRS的防治和藥物開發(fā)提供一個(gè)新的思路。

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