周鳳嬌 ，韋小麗 ，彭凌帥 ，鄧　銳

（1.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550005）

馬尾松Pinus massonianaLamb是我國(guó)南方特有的用材和產(chǎn)脂樹(shù)種，它面積大，分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)，在我國(guó)林業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[1]。隨著馬尾松良種選育理論與技術(shù)研究的不斷進(jìn)步，馬尾松育苗造林已逐步走上良種化道路，優(yōu)良的馬尾松家系、無(wú)性系成為馬尾松育苗的重要種質(zhì)資源。對(duì)于馬尾松優(yōu)良無(wú)性系的繁育，培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)穗條以提高其扦插成活率十分重要。穗條的生理生化特性，包括內(nèi)源激素、酶活性等與生根密切相關(guān)。前人[2-3]的研究表明，遮蔭有調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素和酶活性的作用，馬尾松采穗圃調(diào)控有截頂與施肥對(duì)穗條的影響[4]的研究，但未見(jiàn)遮蔭處理對(duì)馬尾松穗條及生理生化特性的報(bào)道，因而試圖通過(guò)遮蔭探討是否有助于提高馬尾松穗條生理質(zhì)量，提高穗條生根率。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

馬尾松采穗母株來(lái)源于貴州省都勻市馬尾松國(guó)家級(jí)良種基地，1年生苗，盆栽，栽植盆規(guī)格高28 cm，底部直徑25 cm，上部直徑30 cm，土壤為m黃心土∶m腐殖土=2∶1，每盆1株，于2015年5月10日移栽，在大棚內(nèi)培養(yǎng)，定期澆水。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1　馬尾松采穗母株的遮蔭處理

馬尾松當(dāng)年生苗在2015年5月盆栽成活后，于7月28日截頂[5]，定干高度為13 cm，同時(shí)在露地條件下用黑色遮陽(yáng)網(wǎng)進(jìn)行遮蔭處理，分別為75±5%遮蔭（二層遮蔭）、50±5%遮蔭（一層遮蔭）和不遮蔭3種處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15株， 2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)穗條的數(shù)量、長(zhǎng)度和直徑，測(cè)定其內(nèi)源激素、SOD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和過(guò)氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶（POD）等指標(biāo)，同時(shí)取樣進(jìn)行扦插試驗(yàn)。

1.2.2　穗條內(nèi)源激素及生理生化指標(biāo)的測(cè)定

1.2.2.1內(nèi)源激素的測(cè)定

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)通法（LC/MS/MS）檢測(cè)。

內(nèi)源激素的提?。厚R尾松檢測(cè)樣品3 g，于液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)入20 mL預(yù)冷的80% 甲醇中加入，1 mol /L抗壞血酸100 μL，于4 ℃下置于冰箱12 h后，于冰浴超聲避光浸提2 h，在-10 ℃下，以10 000 r/min 離心15 min，分離上清液，沉淀物中加2 mL預(yù)冷80%甲醇，然后在4 ℃以下超聲浸提2 h，離心，合并上清液，經(jīng)過(guò)聚乙烯聚吡咯烷酮PVPP柱和二乙基氨基乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠（DEAE Sephadex A-25）柱凈化，氮?dú)獯蹈桑蒙V純級(jí)甲醇定容至1 mL，過(guò)0.22 μm 濾膜后上樣進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)的色譜條件： ZT檢測(cè)的掃描模式是正離子，母離子為220.124 m/z，子離子為136.056和202.097 m/z，碰撞能量為24和18 eV，透射電鏡為80和80；IAA檢測(cè)的掃描模式是正離子，母離子為176.106 m/z，子離子為130.079和77.086 m/z，碰撞能量為20和40 eV，透射電鏡為73和73；ABA檢測(cè)的掃描模式是負(fù)離子，母離子為263.111 m/z，子離子為153.143和204.139 m/z，碰撞能量為17和17 eV，透射電鏡為76和76；GA檢測(cè)的掃描模式是負(fù)離子，母離子為345.115 m/z，子離子為143.127 m/z，碰撞能量為40 eV，透射電鏡為95。

1.2.2.2生理生化指標(biāo)的測(cè)定

剪取不同處理的馬尾松穗條測(cè)定生理生化指標(biāo)?？扇苄蕴呛康臏y(cè)定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定； SOD采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶（POD）采用劉萍等的方法測(cè)定[6]；吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性用比色方法測(cè)定[7]。每個(gè)指標(biāo)測(cè)定3個(gè)重復(fù)。

1.2.3　不同遮蔭處理穗條的扦插試驗(yàn)

采穗母株遮蔭處理60 d后，剪取萌發(fā)的穗條進(jìn)行扦插試驗(yàn)。用枝剪剪去穗條基部末端，在1∶1 000的高錳酸鉀溶液中浸泡10 min，取出穗條晾干，用生根劑（IBA∶NAA=1∶1）配制成800 mg/L的溶液浸泡30 min后進(jìn)行扦插，共設(shè)3個(gè)處理組，每組30根穗條，3個(gè)重復(fù)。扦插于大棚內(nèi)扦插池，基質(zhì)為粉狀細(xì)沙。

扦插完成后，10 d內(nèi)，每天定時(shí)噴灌3～5次（依天氣情況），每次噴灌3 min，10 d以后每天噴灌2～3次（依天氣情況），每次1 min。

每隔10 d觀察一次插穗基部愈傷的形成及發(fā)根狀況，扦插后3個(gè)月調(diào)查統(tǒng)計(jì)生根情況，計(jì)算生根率。

1.2.4　數(shù)據(jù)處理

采用Excel2007和SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　遮蔭處理對(duì)馬尾松采穗母株萌條的影響

馬尾松采穗母株截頂后，不同遮蔭處理的萌條數(shù)量差異極顯著（P＜0.01），長(zhǎng)度差異顯著（P＜0.05）。75%遮蔭處理和50%遮蔭處理后萌條的平均數(shù)量分別比不遮蔭處理減少31%和28%；馬尾松采穗母株不遮蔭處理萌條的平均長(zhǎng)度為5.04 cm，75%遮蔭處理和50%遮蔭處理后萌條的平均長(zhǎng)度分別比不遮蔭處理減少18%和10%，這可能與馬尾松是喜光樹(shù)種，在遮蔭條件下受光照脅迫，光合作用減弱有關(guān)（見(jiàn)圖1）。

圖1　遮蔭處理對(duì)馬尾松采穗母株萌條數(shù)量和長(zhǎng)度的影響Fig. 1　Effect of shading on the number and length of the sprout of Piuns massoniana

2.2　遮蔭處理對(duì)馬尾松穗條生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1　對(duì)穗條內(nèi)源激素含量的影響

研究結(jié)果（圖2）表明：遮蔭處理對(duì)穗條的內(nèi)源激素含量影響差異顯著（P＜0.05），遮蔭處理的GA、ZT、IAA、ABA含量均比對(duì)照高，其中GA、IAA、ABA均以50%遮蔭處理含量最高，分別比對(duì)照高出200%、5.99%、13.9%；ZT含量則以75%遮蔭處理最高，比對(duì)照高出27.5%。

圖2　遮蔭處理后馬尾松穗條內(nèi)源激素的含量Fig. 2　The content of endogenous hormones in the spike of Pinus massoniana after different shading treatments

2.2.2　對(duì)穗條可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的影響

不同遮蔭處理穗條內(nèi)可溶性糖含量差異顯著（P＜0.05），50%遮蔭處理的穗條可溶性糖含量最高，比對(duì)照高出12.3%，75%遮蔭處理與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05）。

不同遮蔭處理穗條內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量差異極顯著（P＜0.01），50%遮蔭處理的穗條可溶性蛋白質(zhì)含量最高，其次是75%遮蔭處理的，分別比對(duì)照高出169%、49.1%（見(jiàn)圖3）。

圖3　遮蔭處理后馬尾松穗條可溶性糖和蛋白質(zhì)的含量Fig. 3　The content of soluble sugar and protein in the spike of Pinus massoniana after different shading treatments

2.2.3　對(duì)穗條酶活性的影響

遮蔭處理對(duì)穗條不同酶活性的影響不一致，對(duì)PPO、POD、CAT影響差異不顯著（P＞0.05），對(duì)SOD影響差異顯著（P＜0.05）。50%遮蔭處理SOD酶的活性最高，其次是75%遮蔭，分別比對(duì)照高出54.3%和43.6%；遮蔭處理對(duì)IAAO酶的活性影響差異極顯著（P＜0.01），75%和50%遮蔭處理均比對(duì)照IAAO的活性低，分別低43.3%和32.8%（見(jiàn)表1）。

2.3　遮蔭處理對(duì)穗條扦插效果的影響

方差分析結(jié)果表明，遮蔭處理對(duì)馬尾松穗條扦插生根率的影響差異顯著（P＜0.05）（圖4），75%遮蔭和50%遮蔭處理的穗條生根率均高于對(duì)照，75%遮蔭處理的生根率比對(duì)照高出1.09倍，比50%遮蔭處理的穗條生根率高51%。

表1　遮蔭處理對(duì)馬尾松穗條酶活性的影響?Table 1　Effect of shading on enzyme activity in Pinus massoniana spike

圖4　遮蔭對(duì)馬尾松穗條生根率的影響Fig. 4　Effects of shading on rooting rate of Pinus massoniana

3　結(jié)論與討論

光照強(qiáng)度是影響植物光合作用的主要因子。馬尾松是喜光樹(shù)種，遮蔭處理會(huì)使植物光合作用減弱，制造的有機(jī)物減少，從而穗條的產(chǎn)量和數(shù)量降低。遮蔭下由于受到光脅迫，穗條內(nèi)可溶性糖含量增加，與前人對(duì)少花龍葵、三葉鬼針草和勝紅薊葉片的研究結(jié)果一致[8]，但與木蘭科植物和青岡等常綠闊葉樹(shù)木的幼苗可溶性糖含量隨光強(qiáng)的減弱而呈遞減趨勢(shì)的研究結(jié)果相反[9]，這與不同的植物對(duì)光強(qiáng)的反應(yīng)不同有關(guān)。馬尾松穗條內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)遮蔭條件下比對(duì)照含量高，與遮蔭對(duì)其它木本植物的影響結(jié)果一致[10-11]。插穗在生根過(guò)程中所消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要是碳水化合物和氮素化合物[12]，可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的增加有利于根的形成[13]。

插穗自身的激素含量影響生根性狀[14]，內(nèi)源激素生長(zhǎng)素IAA、脫落酸ABA、細(xì)胞分裂素和赤霉素，對(duì)插穗生根起著重要的作用[15-16]，本研究中遮蔭使IAA、GA、ZT、ABA 4種內(nèi)源激素含量均增加，與光照對(duì)格木苗的影響[17]結(jié)果一致，但是與王興等[18]遮蔭抑制ABA合成的結(jié)果不一致，可能不同的植物對(duì)光照的響應(yīng)不同，另外，也有研究認(rèn)為ABA可以促進(jìn)橫向根的形成[19]，本研究的扦插試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了遮蔭處理后的穗條生根率提高，可能是遮蔭調(diào)控了馬尾松穗條的激素狀況，從而對(duì)插穗的生根起到促進(jìn)作用。

POD、SOD、CAT 3種酶的活性與植物的抗逆性、抗氧化性有關(guān)，多酚氧化酶（PPO）與植物的褐變有關(guān)。本研究中遮蔭處理使馬尾松受到弱光脅迫，馬尾松穗條內(nèi)的POD、SOD、CAT 3種酶的活性增加，可以促進(jìn)植物的生理代謝活動(dòng)，防止自由基毒害，有利于保護(hù)細(xì)胞，這與對(duì)茉莉的研究認(rèn)為遮蔭促使SOD、POD活性增加的結(jié)果一致， 但CAT活性降低結(jié)果不一致[20]，可能是不同物種遮陰度和遮蔭時(shí)間不同，不同酶的活性變化不一致。遮蔭處理使馬尾松穗條褐變及氧化減慢，在脫離母株的狀態(tài)下能夠成活，有利于插穗的生根。而吲哚乙酸氧化酶IAAO的活性施肥后降低，分解IAA的能力減弱，使IAA的濃度升高，促進(jìn)插穗的生根。

綜上所述，遮蔭條件下馬尾松采穗母株萌條的數(shù)量和長(zhǎng)度雖然減少了，但穗條的內(nèi)源激素GA、ZT、IAA、ABA含量增加，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量增加，PPO、POD、SOD、CAT酶的活性升高，而IAAO活性降低，生理質(zhì)量得到改善，因而穗條的扦插生根率升高。為提高插穗生根率，生產(chǎn)上可嘗試對(duì)馬尾松采穗圃進(jìn)行遮蔭，調(diào)控穗條質(zhì)量，提高扦插生根率。

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