錢　路，馬麗娜 ，吳　晶 ，李　健 ，安榆林 ，郝德君

（1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.常州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 常州213001；3.南京出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 211106；4.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210000）

美國白蛾Hyphantria cunea是一種食性廣、危害大的世界性檢疫害蟲。原產(chǎn)北美，傳入并廣泛分布于南美洲大部分地區(qū)[1]。其成蟲具有趨光性，可飛行380多米，可隨貨物及交通工具的運(yùn)輸進(jìn)行遠(yuǎn)距離擴(kuò)散[2]。美國白蛾于1940年傳入歐洲，先后侵入匈牙利、羅馬尼亞、保加利亞、奧地利、原蘇聯(lián)、波蘭和法國，并于1945年后先后傳入日本、韓國、朝鮮。1979年從遼寧丹東傳入我國后，先后擴(kuò)散至陜西、河北、北京、天津、河南、山東、安徽和江蘇等省市，造成重大經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)環(huán)境的破壞[3-4]。由于美國白蛾具有食性雜、食量大、繁殖能力強(qiáng)、適生性廣、傳播速度快、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，已經(jīng)成為我國最具危險(xiǎn)性的外來入侵物種之一，被國家林業(yè)局列為全國林業(yè)檢疫性有害生物[5]。因此，嚴(yán)格防控美國白蛾已成為維護(hù)我國生態(tài)安全和林木資源的重要任務(wù)。

美國白蛾與楊毒蛾Leuoma candida、榆毒蛾Lvela ochropoda、星白雪燈蛾Spilosoma menthastri、稀點(diǎn)雪燈蛾Spilosoma urticae和白雪燈蛾Spilosoma niveus等種類不僅成蟲的體色和形態(tài)上非常相似，不易鑒別，而且卵、幼蟲、蛹也難以區(qū)分。由于美國白蛾的成蟲、幼蟲和蛹等不同蟲態(tài)均可隨果品及包裝材料遠(yuǎn)距離傳播擴(kuò)散，出入境口岸截獲后僅僅依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法很難做出快速準(zhǔn)確的識(shí)別和鑒定。而相比形態(tài)分類學(xué)方法，近些年發(fā)展起來的DNA條形碼(DNA barcode) 檢測技術(shù)簡便易操作、快速且準(zhǔn)確率高，因而在生物分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等遺傳分析研究中的應(yīng)用日漸增多[7-9]。其中線粒體DNA由于具有提取技術(shù)簡單、母系遺傳、無重組、單拷貝、進(jìn)化速率較核基因快等特點(diǎn)，常被選做DNA條形碼技術(shù)中的分子標(biāo)記[10-11]。線粒體細(xì)胞色素氧化酶 C 亞基Ⅰ( mt DNACOⅠ) 基因是目前背景研究最為清楚的基因之一，其結(jié)構(gòu)相對保守但種間變異較大，能夠提供較全的系統(tǒng)發(fā)育信息，在昆蟲近緣種間的系統(tǒng)進(jìn)化研究及分類鑒定等方面都有較廣泛的應(yīng)用，也為出入境檢疫部門快速、準(zhǔn)確地檢疫鑒定截獲的昆蟲提供了新方法[12-15]。

關(guān)于分子標(biāo)記技術(shù)如AFLP、RAPD和微衛(wèi)星位點(diǎn)等方法在美國白蛾的種群遺傳結(jié)構(gòu)方面已有研究[16-19]，但是利用分子標(biāo)記方法比較分析美國白蛾與近緣種或相似種的種間鑒定技術(shù)的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究以美國白蛾及其形態(tài)相似的8種蛾類的COⅠ基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)美國白蛾特異性熒光探針，建立快速、高效、可靠的美國白蛾快速分子鑒定技術(shù)，以期可以對成蟲、蛹、幼蟲和卵不同蟲態(tài)實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的鑒定效果，為出入境口岸和森防部門檢疫、監(jiān)測美國白蛾具有十分重要的實(shí)踐意義。

1　材料與方法

1.1　供試蟲源

本實(shí)驗(yàn)選取了美國白蛾及其形態(tài)近似的8種蛾類，蟲樣形態(tài)特征見圖1。該實(shí)驗(yàn)蟲樣分別采自安徽、江蘇、浙江、河北等地，具體信息見表1。蟲樣保存于5 mL離心管中，用無水乙醇浸泡，于－20 ℃冰箱保存，供實(shí)驗(yàn)用。

圖1　蟲樣的形態(tài)Fig.1　The morphologic pictures of sample insect

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1　總DNA提取

樣品DNA的提取采用GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA 磁珠提取試劑盒。

1.2.2　PCR引物

參考Herbert的研究，用通用引物L(fēng)epF1和LepR1[19]對供試樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增COⅠ基因并測序。具體見表2。

表1　實(shí)驗(yàn)用蟲樣信息Table 1　Information of insect in experiment

表2　PCR擴(kuò)增所用到的引物Table 2 The primers of polymerase chain reaction (PCR)

1.2.3　PCR擴(kuò)增COⅠ基因片段

在PCR儀(Epgradient S)上以25 μL的體系：2 μL MgCl2（25 mmol/L），2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，1 U Taq DNA polymerase，0.5 μL LepF1/LepR1（Genscript）進(jìn)行擴(kuò)增，蟲樣的總DNA模板1 μL，后加dd H2O至終體積25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 1 min， 5個(gè)循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增（94 ℃40 s，45 ℃ 0 s，72 ℃ 1 min）加 35 個(gè)循環(huán)（94 ℃40 s，51 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min），最后在 72 ℃下延伸5 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物，采用1.5 %凝膠電泳分析檢測（Agarose gel electrophoresis）。將含有目的條帶的PCR產(chǎn)物直接送到南京金斯瑞有限公司雙向測序。

1.2.4　美國白蛾COⅠ基因特異性引物設(shè)計(jì)

根據(jù)測序比對結(jié)果，找出美國白蛾的特異性堿基位點(diǎn)，設(shè)計(jì)美國白蛾特異性引物HC-F和HC-R（500 nmol/L），引物序列見表3。

表3　美國白蛾特異性引物Table 3 The specific primers of Hyphantria cunea

在引物HC-F和HC-R擴(kuò)增片段之間再尋找美國白蛾的特意堿基位點(diǎn)設(shè)計(jì)MGB探針，探針的核酸序列為AAGTATGGTAATAGCTC，5’末端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’末端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)NFQ，濃度為250 nmol/L。

引物HC-F、HC-R和MGB探針在COⅠ基因上的大致位置見圖2。

圖2　特異性引物探針位置Fig.2　Location sketch map of speci fic primer probe

1.2.5　實(shí)時(shí)熒光PCR

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：0.5 U Taq DNA polymerase ，2 μL 模板 DNA，10 μL TaqMan mix，從100 nmol/ L ～ 1 000 nmol/ L以50 nmol/ L遞增的引物HC-F/HC-R及濃度從50 nmol/L ～500 nmol/L以25 nmol/ L遞增的MGB探針，對引物和探針濃度進(jìn)行不同的配比試驗(yàn)。根據(jù)Ct值和曲線形態(tài)，確定最佳濃度以及配比。

針對ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，對退火溫度、循環(huán)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，以期達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。

2　結(jié)果與分析

2.1　美國白蛾與近似種COⅠ基因的獲得

用通用引物L(fēng)epF1和LepR1[9]對供試樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖3。從圖3可以看出，各供試樣本PCR產(chǎn)物在700 bp左右均有條帶出現(xiàn)。將美國白蛾P(guān)CR產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBI上的序列進(jìn)行比對，相似度達(dá)100%，說明本方法的PCR產(chǎn)物確實(shí)為美國白蛾的COⅠ序列。

圖3　美國白蛾及其近似種樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳（部分樣品）Fig.3　Ampli fication of PCR product about Hyphantria cunea and other allied species

用MEGA7.0軟件對測序獲得的美國白蛾COⅠ和其他近源種的COⅠ進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹分析，1 000次重復(fù)結(jié)果，分析無誤的序列上傳至Genbank，見圖4。結(jié)果表明，從不同地區(qū)采集的美國白蛾Hyphantria cunea位于進(jìn)化樹同一分支上，說明它們來自于相同的祖先。進(jìn)化樹分析表明凈雪燈蛾Spilosoma album和凈污燈蛾Spilarctia album位于同一分支上，作者分析認(rèn)為凈雪燈蛾和凈污燈蛾可能是同物異名。另外，進(jìn)化樹結(jié)果顯示來自不同地區(qū)的相同物種（人紋污燈蛾、八點(diǎn)灰燈蛾、紅緣燈蛾和楊雪毒蛾）均能分別聚集到同一分支，說明地域的差異并沒有引起他們COⅠ基因的改變，顯示出其在進(jìn)化上的保守性。

2.2　美國白蛾COⅠ基因?qū)崟r(shí)熒光PCR體系的建立

反應(yīng)體系最終確定為：總體系20 μL，各組分加入量分別為：TaqMan mix 混合反應(yīng)液10 μl，上游引物HC-F為0.5 μL，下游引物HC-R為0.5 μL，MGB 探針為 0.25 μL，模板 2 μL，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL (5 U/μL)，加 ddH2O 補(bǔ)足到 20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min，95 ℃預(yù)變性10 min；進(jìn)入循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共 40個(gè)循環(huán)。

結(jié)果見圖5，美國白蛾的4個(gè)樣本都出現(xiàn)了熒光信號(hào)，而楊雪毒蛾、紅緣燈蛾、八點(diǎn)灰燈蛾、人紋污燈蛾、凈雪燈蛾、凈污燈蛾、星白雪燈蛾、白雪燈蛾的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物沒有熒光信號(hào)，表明該引物探針和熒光PCR方法能夠?qū)γ绹锥赀M(jìn)行特異性的擴(kuò)增。

圖4　鄰接法基于COⅠ基因構(gòu)建的美國白蛾及近似種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Neighbor-joining phylogenetic tree of COⅠgene of Hyphantria cunea and other allied species

圖5　實(shí)時(shí)熒光PCR特異檢測美國白蛾熒光Fig.5　Fluorescence diagram of Hyphantria cunea by qRT-PCR

2.3　美國白蛾COⅠ基因熒光PCR循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化

采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測其靈敏度，具體結(jié)果見圖6。美國白蛾的所有測試濃度都出現(xiàn)熒光檢測信號(hào)，Ct值與DNA模板濃度相關(guān)。模板濃度為2.5 ng/μL、0.25 ng/μL、25 pg/μL、2.5 pg/μL、0.25 pg/μL時(shí)，擴(kuò)增的Ct值分別為18.1，21.8，25.4，29.2，32.8。在0.25 pg/μL的濃度下熒光PCR擴(kuò)增曲線明顯，兩個(gè)平行樣間的Ct值分別為33.1和32.7，體現(xiàn)了良好重復(fù)性，表明該方法的檢測下限在0.25 pg/μL以下。上述結(jié)果說明，采用引物HC-F/HC-R和探針HC-TZ能夠?qū)?.25 pg/μL以上濃度的樣本進(jìn)行穩(wěn)定的擴(kuò)增，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，表明采用上述引物和探針對美國白蛾的檢測靈敏度為 0.25 pg/μL。

圖6　實(shí)時(shí)熒光PCR檢測美國白蛾的靈敏度結(jié)果Fig.6　Sensitivity analysis of Hyphantria cunea by qRT-PCR

3　小結(jié)和討論

基因克隆以及分子標(biāo)記等技術(shù)是開展入侵遺傳學(xué)、昆蟲毒理等研究必不可少的手段之一，其在昆蟲的分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、種群動(dòng)態(tài)與遺傳關(guān)系、入侵等分析中起到了重要的作用。毛珊珊等[20]利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法擴(kuò)增松墨天牛ERP基因，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法研究了其防御相關(guān)機(jī)制，揭示了其免疫與分子毒理之間的相互作用。此外昆蟲基因組研究中，高效的多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用越來越多，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPDs）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、微衛(wèi)星等；另外可以利用單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的分子標(biāo)記技術(shù)檢測基因中保守的遺傳變異情況[21]。DNA條形碼技術(shù)由于具有簡便、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，因此在昆蟲鑒定中的作用日漸加強(qiáng)，目前許多國家將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用到外來物種的鑒定之中[22-23]。而其中基于COⅠ基因的DNA條形碼鑒定技術(shù)應(yīng)用更加廣泛，尤其在形態(tài)學(xué)難以鑒定的蚧蟲、實(shí)蠅、小蠹蟲、舞毒蛾等分類中的應(yīng)用較多[24-26]，解決了非成蟲蟲態(tài)、復(fù)合種、隱存種、近緣近似種、不同地理種等鑒定疑難問題，為重大的檢疫性害蟲的鑒定監(jiān)測提供了技術(shù)支持。

本研究通過生物信息學(xué)分析和PCR技術(shù)測定了美國白蛾及星白雪燈蛾、白雪燈蛾、楊雪毒蛾、紅緣燈蛾、八點(diǎn)灰燈蛾、人紋污燈蛾、凈雪燈蛾、凈污燈蛾等8個(gè)近似種的線粒體COⅠ基因片段，進(jìn)行了DNA條形碼比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示除了凈雪燈蛾、凈污燈蛾外，其它DNA條碼都為各物種所獨(dú)有，不存在物種之間的共享，提示該條碼在美國白蛾及其近似種中有很好的識(shí)別能力，可以用于美國白蛾的物種鑒定。DNA條碼也為凈雪燈蛾和凈污燈蛾為同物異名提供了分子證據(jù)。同時(shí)篩選得到美國白蛾的特異性DNA序列，并以此設(shè)計(jì)出針對美國白蛾快速鑒定的MGB探針，應(yīng)用熒光PCR方法能夠?qū)γ绹锥赀M(jìn)行特異性的擴(kuò)增。本項(xiàng)目的研究結(jié)果為美國白蛾的口岸檢疫鑒定、森防部門的監(jiān)測和除治提供了新型技術(shù)手段。

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