王 　媛，鄧小飛*

（1. 安順市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州　安順　561000；2. 第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院急診科，重慶 　400037）

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染是慢性胃炎、胃潰瘍、甚至胃癌的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[1]。炎癥、活性氧(reactive oxygen species，ROS)及DNA損傷在HP感染后胃組織從胃炎向胃癌演變過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[2]。HP感染產(chǎn)生的低水平ROS，在感染初期，并不會(huì)直接導(dǎo)致DNA鏈斷裂，而是導(dǎo)致DNA堿基氧化性損傷，其中，8羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤(8 h ydroxy d eoxyguanine，8-OHdG)是主要損傷形式[3]。堿基切除修復(fù)是DNA堿基損傷的主要修復(fù)方式，8-OHdG DNA糖基化酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1，OGG1)是堿基切除修復(fù)過(guò)程的限速酶，識(shí)別并修復(fù)損傷的堿基，防止基因組不穩(wěn)定和基因突變[4]。研究表明，胃腫瘤組織的OGG1表達(dá)顯著低于正常胃組織[5]，并且，OGG1基因多態(tài)性與人群胃癌易感性呈顯著正相關(guān)[6]，提示OGG1可能在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了重要的角色。因此，本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默OGG1表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡及PARP表達(dá)等，探討OGG1在HP感染致胃上皮細(xì)胞(GES-1) DNA損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1　細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和H.pylori ACTC43504(CagA+，VacA+)標(biāo)準(zhǔn)菌株由貴州省安順市人民醫(yī)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)添加10%胎牛血清(Hyclone公司)和100 U/mL的青霉素-鏈霉素雙抗(Sigma公司)，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中，傳代接種于6孔板或96孔板經(jīng)培養(yǎng)達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在HP感染前，細(xì)胞更換不含抗生素的培養(yǎng)基。感染時(shí)，將HP接種于含有10%無(wú)菌脫脂羊血的空腸彎曲桿菌培養(yǎng)基(西寶生物)中，于37 ℃、N2體積分?jǐn)?shù)為85%、CO2體積分?jǐn)?shù)為10%、O2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，刮取HP至含有1.5 mL DMEM培養(yǎng)基的EP管中，4 ℃、12 000 g離心10 min，去上清，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)為660 nm時(shí)的細(xì)菌吸光度D(660)值。實(shí)驗(yàn)分組為4組：對(duì)照組、干擾組(OGG1 siRNA)、HP感染組、OGG1干擾+HP感染組。在HP(病毒滴度10∶1)感染GES-1細(xì)胞24或48 h后檢測(cè)。

1.2　OGG1 siRNA轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染試劑采用脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司)，采用OptiMEM(Invitrogen公司)配制脂質(zhì)體和siRNA(100 nmol/L)的工作液。于HP感染前12 h，將干擾組細(xì)胞轉(zhuǎn)染OGG1特異的siRNA(Invitrogen公司)，正義鏈為5′-GC UUGAUGAUGUCACUUAUTT-3′，反義鏈為5′-AUAAG UGACAUCAUCAAGCTG-3′；對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照序列正義鏈為5′-GUACUUCCA GCUAGAUGUUUU -3′，反義鏈為5′-AACAUCUAGCUGGAAGUACUU-3′，OGG1干擾效率采用Western blot檢測(cè)干擾24 h后OGG1蛋白表達(dá)。

1.3　細(xì)胞活力檢測(cè)

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)(Dojindo公司)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，將GES-1細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為5×105/mL，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染和HP感染處理完畢，每孔加入含10% CCK-8原液的DMEM 100 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，分別于HP感染后24和48 h后檢測(cè)細(xì)胞活力。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4　細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Roche公司)檢測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放。各組細(xì)胞同1.3處理完畢后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，分別收集HP感染24和48 h后的細(xì)胞上清并加入LDH溶液在25 ℃反應(yīng)30 min。采用Infinite M200(TECAN公司)讀取各孔的D(450)值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，測(cè)量值采用對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化百分率表示。

1.5　彗星試驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷

采用彗星試驗(yàn)試劑盒(Trevigen公司)檢測(cè)經(jīng)HP感染48 h后的細(xì)胞DNA損傷情況。用胰酶消化、重懸各組GES-1細(xì)胞，調(diào)整密度至(3～5)×105/mL，與0.65%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠按1∶10(V/V)混勻并平鋪于Trevigen彗星試驗(yàn)專用載玻片上，4 ℃預(yù)冷30 min后，將載玻片置于裂解液(2.5 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris HCl，100 mmol/L EDTA，10%二甲亞砜和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，pH 10.0)，4 ℃裂解2 h，后置于堿性解旋液(200 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na2EDTA，pH＞13)，室溫解旋30 min。隨后將載玻片置于水平電泳槽，以1 V/cm電泳40 min。電泳完畢后，用去離子水清洗載玻片2次，75%乙醇脫水5 min，4 ℃干燥后，SYBR Green I(Invitrogen)染色液，避光染色25 min，熒光顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。所獲圖片采用CASP軟件分析，每組至少分析100個(gè)細(xì)胞，采用尾長(zhǎng)(tail length，TL)、尾部DNA含量、Olive尾矩(Olive tail moment，OTM) 和 尾矩(tail moment，TM)評(píng)價(jià)DNA損傷程度。

1.6　免疫熒光檢測(cè)γH2AX焦點(diǎn)形成

采用免疫熒光法檢測(cè)經(jīng)HP感染48 h后的γH2AX焦點(diǎn)形成。用多聚賴氨酸包被蓋玻片并放置于24孔板，GES-1細(xì)胞按5×105/mL接種，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)轉(zhuǎn)染OGG1 siRNA，24 h后實(shí)施HP感染，于感染后48 h將貼有細(xì)胞的蓋玻片用4%甲醛室溫固定15 min，采用0.1% Triton X-100 在4 ℃透膜15 min，熒光封閉液(碧云天公司)封閉30 min后，加入γH2AX(Abcam，1∶200)，4 ℃過(guò)夜，次日，加入相應(yīng)的Alexa Fluor?647熒光二抗(Invitrogen，1∶100)，37 ℃反應(yīng)1 h，洗片后，采用DAPI(碧云天公司)反染細(xì)胞核，共聚焦顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。

1.7　細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)各組細(xì)胞經(jīng)HP感染48 h后的凋亡情況。細(xì)胞處理同1.5。根據(jù)TUNEL試劑盒(Roche公司)說(shuō)明書，細(xì)胞接種貼片后，將貼有細(xì)胞的蓋玻片用4%甲醛室溫固定15 min，0.3%的H2O2室溫處理10 min以抑制內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶，采用0.1% Triton X-100在4 ℃條件下透膜15 min，隨后，每個(gè)樣本滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液37 ℃避光反應(yīng)1 h，熒光顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。每組至少記錄500個(gè)細(xì)胞，凋亡指數(shù)為總細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

1.8　Western blot檢測(cè)

采用Western blot檢測(cè)經(jīng)HP感染24 h后OGG1蛋白表達(dá)及感染48 h后的γH2AX和PARP蛋白表達(dá)。GES-1細(xì)胞按5×105/mL接種于6孔板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)轉(zhuǎn)染OGG1 siRNA，24 h后實(shí)施HP感染，于感染后48 h刮取細(xì)胞并加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Roche公司)的RIPA裂解液(碧云天公司)冰上裂解30 min，15 000 g離心20 min，取上清，采用BCA試劑盒(碧云天公司)測(cè)定蛋白濃度，60 μg蛋白上樣10% SDS-PAGE電泳，蛋白分離后，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜，封閉，而后加入兔抗人OGG1單克隆抗體(Abcam，1∶1 000)、羊抗人γH2AX單克隆抗體(Abcam，1∶1 000)、羊抗人PARP 多克隆抗 體 (Abcam， 1∶ 1 000)及 鼠 抗 人 β-actin (Sigma-Aldrich，1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，次日洗膜，37 ℃辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham公司)檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件錄入各組數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)各組數(shù)-據(jù)，用Student’s t檢驗(yàn)分析兩組間的差異，數(shù)據(jù)采用x±s表示，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1　OGG1干擾對(duì)HP感染引起的胃上皮細(xì)胞活力變化和LDH釋放的影響

圖1　OGG1干擾對(duì)HP感染引起的胃上皮細(xì)胞活力變化和LDH釋放的影響

GES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染OGG1 siRNA或者對(duì)照siRNA序列后，再感染HP，分別于感染后24 h和48 h檢測(cè)細(xì)胞活力和LDH釋放。如圖1所示。Western blot檢測(cè)顯示干擾組OGG1蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(p＜0.01)(圖1A和B)。與對(duì)照組相比，單純HP感染和單純OGG1干擾細(xì)胞活力及LDH釋放均無(wú)明顯影響。而在OGG1干擾+HP感染24和48 h后，與對(duì)照組和單純HP感染組相比，OGG1干擾+HP感染組細(xì)胞活力顯著下降，LDH釋放顯著增多(p＜0.05或p＜0.01)。

2.2　OGG1干擾對(duì)HP感染引起的胃上皮細(xì)胞DNA 損傷的影響

彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OGG1干擾后，細(xì)胞DNA在HP感染后24 h和48 h發(fā)生拖尾現(xiàn)象(圖2A～D和I～L)。經(jīng)CASP軟件分析后，與對(duì)照組及HP感染組比較，OGG1干擾+HP感染24 h后尾長(zhǎng)、尾部DNA含量和Olive尾矩顯著增加(p＜0.05或p＜0.01)(圖2F和G)，而尾矩差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖2H)；而在OGG1干擾+HP感染48 h后，與對(duì)照組及HP感染組比較，尾長(zhǎng)、尾部DNA含量、Olive尾矩均顯著增加(p＜0.01)，尾矩也顯著增加(p＜0.05)(圖2F和G)。與對(duì)照組比較，單純HP感染組和單純OGG1感染組細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾部DNA含量、Olive尾矩及尾矩在感染后的24 h和48 h均無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

2.3　OGG1沉默聯(lián)合HP感染引起胃上皮細(xì)胞DNA雙鏈斷裂

圖2　OGG1干擾對(duì)HP感染引起的胃上皮細(xì)胞DNA損傷的影響

γH2AX是DNA雙鏈斷裂的分子標(biāo)志物，與對(duì)照組比較，單純HP感染組和單純OGG1感染組細(xì)胞核內(nèi)γH2AX焦點(diǎn)無(wú)明顯變化，而HP感染+OGG1干擾組細(xì)胞核γH2AX焦點(diǎn)明顯增多(圖3A)，而采用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，HP感染+OGG1干擾組γH2AX蛋白表達(dá)顯著升高(p＜0.01)(圖3B和C)。

圖3　OGG1干擾對(duì)HP感染引起的胃上皮細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)形成及蛋白表達(dá)的影響

2.4　OGG1干擾對(duì)HP感染引起細(xì)胞凋亡的影響

HP感染48 h后，與對(duì)照組比較，單純HP感染組和單純OGG1感染組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞及活化的PARP無(wú)明顯變化，HP感染+OGG1干擾組細(xì)胞核TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多(圖4A)。而采用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，HP感染+OGG1干擾組活化的PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)(圖4B和C)。

3　討論

本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默OGG1表達(dá)，評(píng)估了細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡；并采用彗星實(shí)驗(yàn)和γH2AX焦點(diǎn)形成檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷，我們發(fā)現(xiàn)HP感染在胃上皮細(xì)胞OGG1表達(dá)下調(diào)的情況下，導(dǎo)致顯著的細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞水平解釋了人群OGG1多態(tài)性和表達(dá)下調(diào)與胃癌發(fā)生相關(guān)關(guān)系的分子機(jī)制。

研究表明，HP感染引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，主要通過(guò)兩條經(jīng)典途徑：一是通過(guò)PI3K/Rac1信號(hào)通路激活NADPH氧化酶1(NOX1)產(chǎn)生ROS[7]，二是通過(guò)精胺氧化酶在多胺精胺向精胺轉(zhuǎn)化的過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)氧化氫，細(xì)胞氧化應(yīng)激進(jìn)而引起氧化性DNA損傷[3]。由于OGG1是氧化性DNA堿基損傷修復(fù)途徑的關(guān)鍵酶，因此本研究發(fā)現(xiàn)的HP感染引起OGG1下調(diào)的胃上皮細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡主要是氧化應(yīng)激介導(dǎo)的。既往研究表明，HP感染(病毒滴度為50∶1)引起胃上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高和ATM/ATR依賴的DNA損傷[8]，而本研究采用更低劑量的HP感染(病毒滴度為10∶1)未引起DNA損傷，而在OGG1沉默的情況下出現(xiàn)DNA損傷效應(yīng)，表明OGG1在HP感染致胃上皮細(xì)胞DNA損傷過(guò)程中發(fā)揮了保護(hù)作用。

HP感染產(chǎn)生的氧自由基攻擊細(xì)胞DNA，首先引起具有潛在致癌特性的8-OHdG形成，此種DNA損傷類型主要由OGG1介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)途徑完成，從而防止基因突變，維持基因組DNA完整性[9]。OGG1介導(dǎo)的氧化性DNA損傷修復(fù)不完全或失敗將導(dǎo)致DNA鏈斷裂、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡以及線粒體功能障礙，進(jìn)而加劇ROS產(chǎn)生[10]。研究表明，OGG1沉默引起氧化性DNA損傷加重、DNA鏈斷裂和細(xì)胞凋亡，提示OGG1對(duì)細(xì)胞DNA具有保護(hù)作用[11]。這與本研究的結(jié)論是一致的。

DNA損傷在各類癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵作用已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同。而OGG1因?yàn)閰⑴c氧化性DNA損傷修復(fù)，與癌癥發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。人群研究提示，OGG1基因多態(tài)性與胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[12-15]，OGG1在多種腫瘤組織中OGG1表達(dá)下降[4]，OGG1敲除小鼠致癌模型中發(fā)生肺癌的數(shù)量和大小較對(duì)照組顯著增多，發(fā)生時(shí)間明顯提前[16]。新近研究發(fā)現(xiàn)，OGG1過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠在誘導(dǎo)乳腺癌模型中，腫瘤的體積較對(duì)照明顯減小，轉(zhuǎn)移率顯著減低，同時(shí)伴隨著氧化應(yīng)激水平降低，DNA損傷減輕和線粒體功能改善，表明OGG1介導(dǎo)的氧化性DNA損傷修復(fù)限制了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]。我們發(fā)現(xiàn)較低劑量的HP感染未引起胃上皮細(xì)胞DNA損傷和凋亡，然而OGG1沉默后，HP感染導(dǎo)致了細(xì)胞DNA損傷，同時(shí)伴隨著細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞活力下降，表明OGG1保護(hù)了HP感染致胃上皮細(xì)胞DNA損傷。綜合前面的分析，OGG1可能是HP感染致胃癌發(fā)生的早期關(guān)鍵分子，這為防護(hù)HP感染導(dǎo)致的胃癌發(fā)生提供了新的理論依據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)。

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