張藝 丁新良 張玨 周彬 郭明明 黃飚

（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所 衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214063；無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心，無(wú)錫 214023）

微囊藻毒素（MC）是一種環(huán)狀七肽物質(zhì)，是古生物藍(lán)藻的代謝釋放產(chǎn)物，有多種異構(gòu)體，對(duì)動(dòng)物和人有強(qiáng)烈的肝毒性［1-2］。其中最常見(jiàn)、水體含量高、毒性最大的是MC-LR，能誘發(fā)肝癌，低劑量的MC-LR還能損傷神經(jīng)細(xì)胞、生殖細(xì)胞，甚至危害腎、肺等器官［2-8］。在淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化的今天，藍(lán)藻爆發(fā)事件時(shí)有發(fā)生，代謝產(chǎn)物MC-LR對(duì)人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，而此毒素在水體中自然降解緩慢，使用現(xiàn)行自來(lái)水處理工藝難以去除［9-14］。鑒于此，我國(guó)制定標(biāo)準(zhǔn)《GB5749-2006》要求對(duì)飲用水、湖泊水、河水和地表水的MC-LR含量進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)。

因?yàn)闄z測(cè)手段的便利程度和準(zhǔn)確程度，關(guān)系到各水廠和環(huán)保單位，關(guān)系到對(duì)藍(lán)藻水華的控制、對(duì)水環(huán)境的綜合治理，關(guān)系到居民飲用水安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，意義重大。因此，建立符合我國(guó)實(shí)際情況，快速、準(zhǔn)確、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)MC-LR的方法，必要而且迫切，具有良好的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。

目前常用的MC-LR檢測(cè)方法包括：高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法［15-18］，這些方法各自的特點(diǎn)如下：前者測(cè)得結(jié)果準(zhǔn)確，但采用的儀器昂貴、操作繁瑣、成本高；以后者為代表的免疫分析方法價(jià)格低、操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但存在或僅能定性、準(zhǔn)確度欠佳，或不能單樣本檢測(cè)等缺點(diǎn)，因此上述方法不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、定量測(cè)定MC-LR。因此，本研究擬解決上述問(wèn)題，運(yùn)用試紙條層析的優(yōu)勢(shì)，建立可快捷、定量、簡(jiǎn)單檢測(cè)該毒素的一種方法，并研制相應(yīng)的試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 水樣源于無(wú)錫太湖水域，由無(wú)錫市疾控中心采樣、收集。檢測(cè)前，樣品用0.45 μm膜過(guò)濾后，取澄清。

1.1.2 試劑與耗材 MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品、MC-LR-牛血清白蛋白（MC-LR-BSA）、抗MC-LR多克隆抗體、MC-LF，均由無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心提供。羊抗鼠IgG由武漢華美提供。含有熒光染料異硫氰酸的高分子納米微球，購(gòu)自biodot公司。樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和卡殼，購(gòu)自杰一公司。碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）由Sigma公司提供。MC-LR ELISA試劑盒，由江蘇省蘇微微生物研究有限公司提供。其他試劑均為滬試分析純。1.1.3 儀器 免疫層析定量分析儀，上?；焦?；ELX800酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；5417R離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf 公司；超聲儀，深圳潔康公司；噴金劃膜儀和切條機(jī)，杭州賽凱生物公司。

1.2 方法

1.2.1 試紙條的制備

1.2.1.1 MC-LR抗體的預(yù)處理 將MC-LR單克隆抗體、MC-LR-BSA和羊抗鼠IgG，分別用0.05 mol/L（pH 7.2）的磷酸鹽緩沖液在4℃下透析過(guò)夜。

1.2.1.2 結(jié)合墊的制備 在高分子納米微球溶液中加入碳二亞胺（EDC）（終濃度為20 mmol）和預(yù)處理過(guò)的MC-LR抗體，室溫反應(yīng)2 h，離心，去除上清液后，加入樣品稀釋液（含有1%BSA的0.05 mol/L，pH 7.2的磷酸鹽緩沖液）至微球濃度為1.0 g/L，待用。用噴金劃膜儀以3 μL/cm-5 μL/cm的量將制備好的微球噴涂于聚酯膜形成的結(jié)合墊上，避光的條件下于35-38℃烘干1 h，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 硝酸纖維素膜的制備 使用含1%蔗糖的0.02 mol/L，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，分別將透析過(guò)的MC-LR-BSA抗原和1 g/L的羊抗鼠IgG抗體，使用定量噴膜儀以1 μL/cm的量將兩者以一定的間隔噴于硝酸纖維素膜上，35-38℃烘干1 h，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 試紙條的組裝 在底板中間先鋪設(shè)硝酸纖維素膜，然后在與質(zhì)控線相臨近的一端鋪吸水紙，使吸水紙與硝酸纖維素膜部分重疊；在與檢測(cè)線相臨近的一端鋪結(jié)合墊，使硝酸纖維素膜與結(jié)合墊部分重疊；最后貼樣品墊。試紙條結(jié)構(gòu)如圖1所示。用切條機(jī)切按0.4 cm寬度斬切后，裝入塑料卡殼中。

圖1 MC-LR-POCT試紙條結(jié)構(gòu)

1.2.2 反應(yīng)過(guò)程 使用前，先將試紙條和其他試劑室溫放置15 min。將10 μL樣品或者M(jìn)C-LR標(biāo)準(zhǔn)品與50 μL樣品緩沖液，滴加入試紙條的樣品墊上，室溫放置一定時(shí)間后，將試紙條卡殼放入檢測(cè)儀器中讀數(shù)，儀器可根據(jù)測(cè)定熒光值自動(dòng)計(jì)算出樣品的MC-LR濃度值。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個(gè)樣品均檢測(cè)3次，對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)用均值（X）或X±變異系數(shù)（X±SD）表示。用Origin 8.0軟件繪制曲線。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)原理

MC-LR-熒光納米免疫層析采用競(jìng)爭(zhēng)型反應(yīng)，經(jīng)毛細(xì)管作用，樣品中的MC-LR向結(jié)合墊方向移動(dòng)，然后，帶動(dòng)了結(jié)合墊處耦聯(lián)著MC-LR抗體的熒光微球向硝酸纖維素膜方向移動(dòng)。當(dāng)混合物到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，游離抗原、固定相人工抗原與熒光微球表面的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，最終在檢測(cè)線處形成抗原-抗體復(fù)合物。未被檢測(cè)線捕獲的微球，將與質(zhì)控線上的羊抗鼠二抗，形成免疫復(fù)合物。其中，樣品中MC-LR的含量與檢測(cè)線上的熒光強(qiáng)度呈反比，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱由數(shù)值顯示，這使得樣品濃度的定量成為可能。

2.2 檢測(cè)線抗原濃度的選擇

檢測(cè)線抗原的濃度與抗體結(jié)合的效率決定了反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度，因此本研究率先探討了檢測(cè)線上MC-LR人工抗原的含量。使用1 μg/mL微球噴涂與結(jié)合墊，針對(duì)空白樣品做檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖所示，0.5 g/L的MC-LR人工抗原適合噴涂在檢測(cè)線上，此時(shí)可以在檢測(cè)線獲得較高的熒光信號(hào)。

圖2 檢測(cè)線上MC-LR-BSA含量與熒光信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系

2.3 微球標(biāo)記量的選擇

預(yù)處理過(guò)的MC-LR抗體和微球按照不同的質(zhì)量比1∶200-1∶10，與EDC混合反應(yīng)。獲得的微球按照1 μg/L噴涂在結(jié)合墊上。用0和1 μg/L的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品作為樣品，考察按照不同質(zhì)量比標(biāo)記的微球?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果的影響。測(cè)0 μg/L濃度樣品時(shí)，有最高熒光值B0；1 μg/L與0 μg/L的比值B0/B1作為競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)效率的反映，比值越大，說(shuō)明1 μg/L與空白濃度的區(qū)分度越大。結(jié)果見(jiàn)圖3，可知抗體與微球反應(yīng)比率為1∶50（wt∶wt）時(shí)，免疫反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合效率較高，空白樣本的熒光值也相當(dāng)較高，因此選為本研究的工作比率。

圖3 微球標(biāo)記量對(duì)結(jié)果的影響

2.4 結(jié)合墊微球濃度的選擇

將微球用含有1%BSA，0.1%NaN3的0.05 mol/L，pH7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋到0.12 μg/mL，0.25 μg/mL，0.5 μg/mL，1.0 μg/mL 等不同的濃度，并進(jìn)行噴涂等處理，然后按前述方法反應(yīng)檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表1，從上面的數(shù)據(jù)可以看到，噴涂不同的微球濃度，檢測(cè)結(jié)果誤差不同。當(dāng)微球濃度較低時(shí)，標(biāo)記抗體量不足，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低，誤差過(guò)大。當(dāng)噴涂濃度為0.5 μg/L或以上時(shí)，誤差降低，可控制在10%以內(nèi)，從成本考慮，0.5 μg/mL的噴涂濃度合適。

表1 微球濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響（μg/mL）

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得

根據(jù)優(yōu)化的條件制備MC-LR免疫層析試紙條，即以0.5 g/L的MC-LR人工抗原噴涂檢測(cè)線，抗體與微球反應(yīng)比率為1∶50，使用該微球以0.5 μg/L的濃度噴涂于結(jié)合墊上。在試紙條的加樣區(qū)加入不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品（取6個(gè)不同的濃度，分別為0 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L，每個(gè)濃度做5個(gè)平行樣）。膜層析反應(yīng) 15 min后，儀器讀取T、C線信號(hào)，以檢測(cè)的樣品熒光值信號(hào)為縱坐標(biāo)，MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，建立方程并擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 730.42x2- 6158.4x+ 14665（R2= 0.985），見(jiàn)圖4，然后通過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)卡，作為對(duì)樣品中所含MC-LR濃度進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。

圖4 MC-LR熒光納米免疫層析法的工作曲線

2.6 性能的評(píng)估

2.6.1 靈敏度 采用重復(fù)測(cè)定10孔空白標(biāo)準(zhǔn)品熒光值，以X-2SD計(jì)算，再帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得對(duì)應(yīng)的濃度值，即為本研究測(cè)定MC-LR的靈敏度0.195 μg/L。2.6.2 準(zhǔn)確性 本方法的準(zhǔn)確性由添加回收率反映，即向空白水樣中添加0.5、2 μg/L低、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)應(yīng)的MC-LR濃度分別為0.517±0.041和1.906±0.095 μg/L?；厥章史謩e為103.4%和95.3%，平均回收率99.4%。方法回收率于90%-110%內(nèi)，說(shuō)明本研究的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

2.6.3 可靠性與精密度 取試紙和市售的MC-LR酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA），分別測(cè)試同一樣品，重復(fù)3次，驗(yàn)證試紙的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。表2結(jié)果說(shuō)明：用該試紙和市售試劑盒檢測(cè)的誤差均小于10%，本方法的變異系數(shù)（SD/X）小于10%，該試劑的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.6.4 特異性 MC-LF為MC-LR的異構(gòu)體，三孔測(cè)定2 μg/L 的MC-LF對(duì)應(yīng)的MC-LR含量，結(jié)果交叉反應(yīng)率為1.75%，說(shuō)明本方法采用的單克隆抗體特異性較好。

表2 不同濃度樣本的MC-LR測(cè)定結(jié)果（μg/L）

2.6.5 穩(wěn)定性 在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)中，將試劑于37℃放置6 d若穩(wěn)定，則代表該試劑可在2-8℃保存6個(gè)月。將市售的MC-LR-ELISA試劑與37℃放置6 d的試劑比較，標(biāo)準(zhǔn)品系列的熒光強(qiáng)度下降幅度低于10%，說(shuō)明試劑在2-8℃可以保存6個(gè)月，可滿足實(shí)際使用的需要。

3 討論

隨著生物傳感技術(shù)的發(fā)展，以及設(shè)備的小型化、便捷化，免疫層析技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展和快速推廣應(yīng)用。采用這一方法研發(fā)的試劑，一般情況下，加樣15 min后，即可讀取檢測(cè)結(jié)果［19］。常見(jiàn)的免疫層析標(biāo)記物為膠體金，對(duì)應(yīng)的試紙條不需外部檢測(cè)儀器，只需裸眼即可讀取檢測(cè)結(jié)果，可用于定性分析，區(qū)分陰陽(yáng)性結(jié)果［18，20-21］。但這種標(biāo)記物不能用于精確定量檢測(cè)，也很難將弱陽(yáng)性結(jié)果區(qū)分開來(lái)。因此，尤其對(duì)MC-LR這樣需要定量分析的小分子物質(zhì)，傳統(tǒng)的免疫層析技術(shù)尚不能完全滿足監(jiān)測(cè)要求。

本實(shí)驗(yàn)所述定量檢測(cè)MC-LR的納米熒光免疫層析試劑將納米熒光免疫技術(shù)、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原與具體試紙結(jié)構(gòu)相結(jié)合，形成了一種可用于單次、定量檢測(cè)MC-LR含量的試紙條，解決了現(xiàn)有納米熒光熒光分析技術(shù)中MC-LR試劑不適合單樣本、小批量檢測(cè)的問(wèn)題，也解決了現(xiàn)有的免疫層析技術(shù)僅能定性，不能準(zhǔn)確定量的問(wèn)題。本方法所述MC-LR高分子納米微球，解決了熒光染料發(fā)光效率低從而造成檢測(cè)不準(zhǔn)確的問(wèn)題，進(jìn)而提高了檢測(cè)靈敏度，達(dá)到0.195 μg/L，遠(yuǎn)低于1 μg/L的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。方法的線性工作范圍達(dá)到5 μg/L，特異性強(qiáng)，與市售商品化試劑盒一致性好，因此可以滿足實(shí)際使用需求。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的定量檢測(cè)MC-LR的納米熒光免疫層析試紙，由熒光免疫層析試紙條和外殼組成，簡(jiǎn)單操作，性能穩(wěn)定，對(duì)試劑長(zhǎng)期存儲(chǔ)有利；采用的儀器小，對(duì)工作環(huán)境要求低，便于推廣使用。所述MC-LR檢測(cè)試紙條靈敏度高，準(zhǔn)確性好，操作快捷，具有實(shí)用性和良好的應(yīng)用前景。

［1］ 郁晞, 高紅梅, 彭麗霞, 等. 淀山湖微囊藻毒素-LR的污染狀況及居民肝功能的調(diào)查［J］. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2010, 27（3）：153-155.

［2］ Dietrich D, Hoeger S. Guidance values for microcystins in water and cyanobacterial supplement products（blue-green algal supplements）：a reasonable or misguided approach ？［J］.Toxicology & Applied Pharmacology, 2005, 203（3）：273-289.

［3］ Covaci O I, Sassolas A, Alonso G A, et al. Highly sensitive detection and discrimination of LR and YR microcystins based on protein phosphatases and an artificial neural network［J］. Analytical &Bioanalytical Chemistry, 2012, 404（3）：711-720.

［4］ Li Y, Han X. Microcystin-LR causes cytotoxicity effects in rat testicular Sertoli cells［J］. Environmental Toxicology &Pharmacology, 2012, 33（2）：318.

［5］ 周玨, 劉冉, 李曉波, 等. 微囊藻毒素-LR對(duì)PC12細(xì)胞氧化性損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 癌變突變畸變, 2012, 24（5）：349-351.

［6］ He S, Liang XF, Sun J, et al. Induction of liver GST transcriptions by tert -butylhydroquinone reduced microcystin-LR accumulation in Nile tilapia（Oreochromis niloticus）［J］. Ecotoxicology &Environmental Safety, 2013, 90（3）：128-135.

［7］ Wang J, Lin F, Cai F, et al. Microcystin-LR inhibited hippocampal long-term potential via regulation of the glycogen synthase kinase-3β pathway. ［J］. Chemosphere, 2013, 93（2）：223-229.

［8］ Xu P, Zhang XX, Miao C, et al. Promotion of melanoma cell invasion and tumor metastasis by microcystin-LR via phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway. ［J］. Environmental Science & Technology,2013, 47（15）：8801-8808.

［9］ 夏商周, 楊朝暉. 微囊藻毒素的檢測(cè)及危害研究進(jìn)展［J］. 四川環(huán)境, 2012, 31（3）：90-93.

［10］ Li D, Yu Y, Yang Z, et al. The dynamics of toxic and nontoxic Microcystis during bloom in the large shallow lake, Lake Taihu,China［J］. Environmental Monitoring & Assessment, 2014, 186（5）：3053-3062.

［11］ 胡新梅, 農(nóng)清清, 趙惠柳, 等. 廣西地區(qū)原發(fā)性肝癌患者血清微囊藻毒素-LR水平研究［J］. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué), 2017, 20（11）：1330-1334.

［12］ 萬(wàn)翔, 邰義萍, 王瑞, 等. 洱海水華期間飲用水源區(qū)產(chǎn)毒微囊藻和微囊藻毒素-LR的分布特征［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2017,37（6）：2040-2047.

［13］ 王陽(yáng), 徐明芳, 耿夢(mèng)夢(mèng), 等. 基于Monte Carlo模擬法對(duì)水源水體中微囊藻毒素的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［J］. 環(huán)境科學(xué), 2017, 38（5）：1842-1851.

［14］ 姜蕾. 不同工藝給水廠對(duì)典型微囊藻毒素的去除研究［J］.給水排水. 2017, 53（9）：11-15.

［15］ Poon KF, Lam MH, Lam PK, et al. Determination of microcystins in cyanobacterial blooms by solid-phase microextraction-highperformance liquid chromatography［J］. Environ Toxicol Chem,2001, 20（8）：1648-1655.

［16］ Mountfort DO, Holland P, Sprosen J. Method for detecting classes of microcystins by combination of protein phosphatase inhibition assay and ELISA ：comparison with LC-MS［J］. Toxicon, 2005,45（2）：199-206.

［17］ 沈強(qiáng), 李嗣新, 胡俊. 微囊藻毒素HPLC快速檢測(cè)方法研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2017（2）：103-106.

［18］ Liu L, Xing C, Yan H, et al. Development of an ELISA and immunochromatographic strip for highly sensitive detection of microcystin-LR［J］. Sensors, 2014, 14（8）：14672.

［19］ 劉鑫. 熒光免疫層析分析儀的設(shè)計(jì)分析［J］. 生命科學(xué)儀器,2015（3）：23-26.

［20］ Zhang GP, Guo JQ, Wang XN, et al. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for trichinellosis detection［J］.Veterinary Parasitology, 2006, 137（3）：286-293.

［21］ Wen-de W, Min L, Ming C, et al. Development of a colloidal gold immunochromatographic strip for rapid detection of Streptococcus agalactiae in tilapia［J］. Biosensors & Bioelectronics, 2016, 91 ：66-69.