張藝 丁新良 張玨 周彬 郭明明 黃飚
(江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所 衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫 214063;無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心,無(wú)錫 214023)
微囊藻毒素(MC)是一種環(huán)狀七肽物質(zhì),是古生物藍(lán)藻的代謝釋放產(chǎn)物,有多種異構(gòu)體,對(duì)動(dòng)物和人有強(qiáng)烈的肝毒性[1-2]。其中最常見(jiàn)、水體含量高、毒性最大的是MC-LR,能誘發(fā)肝癌,低劑量的MC-LR還能損傷神經(jīng)細(xì)胞、生殖細(xì)胞,甚至危害腎、肺等器官[2-8]。在淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化的今天,藍(lán)藻爆發(fā)事件時(shí)有發(fā)生,代謝產(chǎn)物MC-LR對(duì)人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅,而此毒素在水體中自然降解緩慢,使用現(xiàn)行自來(lái)水處理工藝難以去除[9-14]。鑒于此,我國(guó)制定標(biāo)準(zhǔn)《GB5749-2006》要求對(duì)飲用水、湖泊水、河水和地表水的MC-LR含量進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)。
因?yàn)闄z測(cè)手段的便利程度和準(zhǔn)確程度,關(guān)系到各水廠和環(huán)保單位,關(guān)系到對(duì)藍(lán)藻水華的控制、對(duì)水環(huán)境的綜合治理,關(guān)系到居民飲用水安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展,意義重大。因此,建立符合我國(guó)實(shí)際情況,快速、準(zhǔn)確、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)MC-LR的方法,必要而且迫切,具有良好的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。
目前常用的MC-LR檢測(cè)方法包括:高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法[15-18],這些方法各自的特點(diǎn)如下:前者測(cè)得結(jié)果準(zhǔn)確,但采用的儀器昂貴、操作繁瑣、成本高;以后者為代表的免疫分析方法價(jià)格低、操作相對(duì)簡(jiǎn)單,但存在或僅能定性、準(zhǔn)確度欠佳,或不能單樣本檢測(cè)等缺點(diǎn),因此上述方法不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、定量測(cè)定MC-LR。因此,本研究擬解決上述問(wèn)題,運(yùn)用試紙條層析的優(yōu)勢(shì),建立可快捷、定量、簡(jiǎn)單檢測(cè)該毒素的一種方法,并研制相應(yīng)的試劑。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 水樣源于無(wú)錫太湖水域,由無(wú)錫市疾控中心采樣、收集。檢測(cè)前,樣品用0.45 μm膜過(guò)濾后,取澄清。
1.1.2 試劑與耗材 MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品、MC-LR-牛血清白蛋白(MC-LR-BSA)、抗MC-LR多克隆抗體、MC-LF,均由無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心提供。羊抗鼠IgG由武漢華美提供。含有熒光染料異硫氰酸的高分子納米微球,購(gòu)自biodot公司。樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和卡殼,購(gòu)自杰一公司。碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)由Sigma公司提供。MC-LR ELISA試劑盒,由江蘇省蘇微微生物研究有限公司提供。其他試劑均為滬試分析純。1.1.3 儀器 免疫層析定量分析儀,上?;焦?;ELX800酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek公司;5417R離心機(jī),美國(guó)Eppendorf 公司;超聲儀,深圳潔康公司;噴金劃膜儀和切條機(jī),杭州賽凱生物公司。
1.2.1 試紙條的制備
1.2.1.1 MC-LR抗體的預(yù)處理 將MC-LR單克隆抗體、MC-LR-BSA和羊抗鼠IgG,分別用0.05 mol/L(pH 7.2)的磷酸鹽緩沖液在4℃下透析過(guò)夜。
1.2.1.2 結(jié)合墊的制備 在高分子納米微球溶液中加入碳二亞胺(EDC)(終濃度為20 mmol)和預(yù)處理過(guò)的MC-LR抗體,室溫反應(yīng)2 h,離心,去除上清液后,加入樣品稀釋液(含有1%BSA的0.05 mol/L,pH 7.2的磷酸鹽緩沖液)至微球濃度為1.0 g/L,待用。用噴金劃膜儀以3 μL/cm-5 μL/cm的量將制備好的微球噴涂于聚酯膜形成的結(jié)合墊上,避光的條件下于35-38℃烘干1 h,加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1.3 硝酸纖維素膜的制備 使用含1%蔗糖的0.02 mol/L,pH 7.4的磷酸鹽緩沖液,分別將透析過(guò)的MC-LR-BSA抗原和1 g/L的羊抗鼠IgG抗體,使用定量噴膜儀以1 μL/cm的量將兩者以一定的間隔噴于硝酸纖維素膜上,35-38℃烘干1 h,加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1.4 試紙條的組裝 在底板中間先鋪設(shè)硝酸纖維素膜,然后在與質(zhì)控線相臨近的一端鋪吸水紙,使吸水紙與硝酸纖維素膜部分重疊;在與檢測(cè)線相臨近的一端鋪結(jié)合墊,使硝酸纖維素膜與結(jié)合墊部分重疊;最后貼樣品墊。試紙條結(jié)構(gòu)如圖1所示。用切條機(jī)切按0.4 cm寬度斬切后,裝入塑料卡殼中。
圖1 MC-LR-POCT試紙條結(jié)構(gòu)
1.2.2 反應(yīng)過(guò)程 使用前,先將試紙條和其他試劑室溫放置15 min。將10 μL樣品或者M(jìn)C-LR標(biāo)準(zhǔn)品與50 μL樣品緩沖液,滴加入試紙條的樣品墊上,室溫放置一定時(shí)間后,將試紙條卡殼放入檢測(cè)儀器中讀數(shù),儀器可根據(jù)測(cè)定熒光值自動(dòng)計(jì)算出樣品的MC-LR濃度值。
1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個(gè)樣品均檢測(cè)3次,對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)用均值(X)或X±變異系數(shù)(X±SD)表示。用Origin 8.0軟件繪制曲線。
MC-LR-熒光納米免疫層析采用競(jìng)爭(zhēng)型反應(yīng),經(jīng)毛細(xì)管作用,樣品中的MC-LR向結(jié)合墊方向移動(dòng),然后,帶動(dòng)了結(jié)合墊處耦聯(lián)著MC-LR抗體的熒光微球向硝酸纖維素膜方向移動(dòng)。當(dāng)混合物到達(dá)檢測(cè)線時(shí),游離抗原、固定相人工抗原與熒光微球表面的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,最終在檢測(cè)線處形成抗原-抗體復(fù)合物。未被檢測(cè)線捕獲的微球,將與質(zhì)控線上的羊抗鼠二抗,形成免疫復(fù)合物。其中,樣品中MC-LR的含量與檢測(cè)線上的熒光強(qiáng)度呈反比,熒光信號(hào)的強(qiáng)弱由數(shù)值顯示,這使得樣品濃度的定量成為可能。
檢測(cè)線抗原的濃度與抗體結(jié)合的效率決定了反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度,因此本研究率先探討了檢測(cè)線上MC-LR人工抗原的含量。使用1 μg/mL微球噴涂與結(jié)合墊,針對(duì)空白樣品做檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖所示,0.5 g/L的MC-LR人工抗原適合噴涂在檢測(cè)線上,此時(shí)可以在檢測(cè)線獲得較高的熒光信號(hào)。
圖2 檢測(cè)線上MC-LR-BSA含量與熒光信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系
預(yù)處理過(guò)的MC-LR抗體和微球按照不同的質(zhì)量比1∶200-1∶10,與EDC混合反應(yīng)。獲得的微球按照1 μg/L噴涂在結(jié)合墊上。用0和1 μg/L的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品作為樣品,考察按照不同質(zhì)量比標(biāo)記的微球?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果的影響。測(cè)0 μg/L濃度樣品時(shí),有最高熒光值B0;1 μg/L與0 μg/L的比值B0/B1作為競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)效率的反映,比值越大,說(shuō)明1 μg/L與空白濃度的區(qū)分度越大。結(jié)果見(jiàn)圖3,可知抗體與微球反應(yīng)比率為1∶50(wt∶wt)時(shí),免疫反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合效率較高,空白樣本的熒光值也相當(dāng)較高,因此選為本研究的工作比率。
圖3 微球標(biāo)記量對(duì)結(jié)果的影響
將微球用含有1%BSA,0.1%NaN3的0.05 mol/L,pH7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋到0.12 μg/mL,0.25 μg/mL,0.5 μg/mL,1.0 μg/mL 等不同的濃度,并進(jìn)行噴涂等處理,然后按前述方法反應(yīng)檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表1,從上面的數(shù)據(jù)可以看到,噴涂不同的微球濃度,檢測(cè)結(jié)果誤差不同。當(dāng)微球濃度較低時(shí),標(biāo)記抗體量不足,導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低,誤差過(guò)大。當(dāng)噴涂濃度為0.5 μg/L或以上時(shí),誤差降低,可控制在10%以內(nèi),從成本考慮,0.5 μg/mL的噴涂濃度合適。
表1 微球濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響(μg/mL)
根據(jù)優(yōu)化的條件制備MC-LR免疫層析試紙條,即以0.5 g/L的MC-LR人工抗原噴涂檢測(cè)線,抗體與微球反應(yīng)比率為1∶50,使用該微球以0.5 μg/L的濃度噴涂于結(jié)合墊上。在試紙條的加樣區(qū)加入不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品(取6個(gè)不同的濃度,分別為0 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L,每個(gè)濃度做5個(gè)平行樣)。膜層析反應(yīng) 15 min后,儀器讀取T、C線信號(hào),以檢測(cè)的樣品熒光值信號(hào)為縱坐標(biāo),MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),建立方程并擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 730.42x2- 6158.4x+ 14665(R2= 0.985),見(jiàn)圖4,然后通過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)卡,作為對(duì)樣品中所含MC-LR濃度進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。
圖4 MC-LR熒光納米免疫層析法的工作曲線
2.6.1 靈敏度 采用重復(fù)測(cè)定10孔空白標(biāo)準(zhǔn)品熒光值,以X-2SD計(jì)算,再帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得對(duì)應(yīng)的濃度值,即為本研究測(cè)定MC-LR的靈敏度0.195 μg/L。2.6.2 準(zhǔn)確性 本方法的準(zhǔn)確性由添加回收率反映,即向空白水樣中添加0.5、2 μg/L低、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),對(duì)應(yīng)的MC-LR濃度分別為0.517±0.041和1.906±0.095 μg/L?;厥章史謩e為103.4%和95.3%,平均回收率99.4%。方法回收率于90%-110%內(nèi),說(shuō)明本研究的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。
2.6.3 可靠性與精密度 取試紙和市售的MC-LR酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA),分別測(cè)試同一樣品,重復(fù)3次,驗(yàn)證試紙的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。表2結(jié)果說(shuō)明:用該試紙和市售試劑盒檢測(cè)的誤差均小于10%,本方法的變異系數(shù)(SD/X)小于10%,該試劑的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
2.6.4 特異性 MC-LF為MC-LR的異構(gòu)體,三孔測(cè)定2 μg/L 的MC-LF對(duì)應(yīng)的MC-LR含量,結(jié)果交叉反應(yīng)率為1.75%,說(shuō)明本方法采用的單克隆抗體特異性較好。
表2 不同濃度樣本的MC-LR測(cè)定結(jié)果(μg/L)
2.6.5 穩(wěn)定性 在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)中,將試劑于37℃放置6 d若穩(wěn)定,則代表該試劑可在2-8℃保存6個(gè)月。將市售的MC-LR-ELISA試劑與37℃放置6 d的試劑比較,標(biāo)準(zhǔn)品系列的熒光強(qiáng)度下降幅度低于10%,說(shuō)明試劑在2-8℃可以保存6個(gè)月,可滿足實(shí)際使用的需要。
隨著生物傳感技術(shù)的發(fā)展,以及設(shè)備的小型化、便捷化,免疫層析技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展和快速推廣應(yīng)用。采用這一方法研發(fā)的試劑,一般情況下,加樣15 min后,即可讀取檢測(cè)結(jié)果[19]。常見(jiàn)的免疫層析標(biāo)記物為膠體金,對(duì)應(yīng)的試紙條不需外部檢測(cè)儀器,只需裸眼即可讀取檢測(cè)結(jié)果,可用于定性分析,區(qū)分陰陽(yáng)性結(jié)果[18,20-21]。但這種標(biāo)記物不能用于精確定量檢測(cè),也很難將弱陽(yáng)性結(jié)果區(qū)分開來(lái)。因此,尤其對(duì)MC-LR這樣需要定量分析的小分子物質(zhì),傳統(tǒng)的免疫層析技術(shù)尚不能完全滿足監(jiān)測(cè)要求。
本實(shí)驗(yàn)所述定量檢測(cè)MC-LR的納米熒光免疫層析試劑將納米熒光免疫技術(shù)、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原與具體試紙結(jié)構(gòu)相結(jié)合,形成了一種可用于單次、定量檢測(cè)MC-LR含量的試紙條,解決了現(xiàn)有納米熒光熒光分析技術(shù)中MC-LR試劑不適合單樣本、小批量檢測(cè)的問(wèn)題,也解決了現(xiàn)有的免疫層析技術(shù)僅能定性,不能準(zhǔn)確定量的問(wèn)題。本方法所述MC-LR高分子納米微球,解決了熒光染料發(fā)光效率低從而造成檢測(cè)不準(zhǔn)確的問(wèn)題,進(jìn)而提高了檢測(cè)靈敏度,達(dá)到0.195 μg/L,遠(yuǎn)低于1 μg/L的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。方法的線性工作范圍達(dá)到5 μg/L,特異性強(qiáng),與市售商品化試劑盒一致性好,因此可以滿足實(shí)際使用需求。
本研究開發(fā)的定量檢測(cè)MC-LR的納米熒光免疫層析試紙,由熒光免疫層析試紙條和外殼組成,簡(jiǎn)單操作,性能穩(wěn)定,對(duì)試劑長(zhǎng)期存儲(chǔ)有利;采用的儀器小,對(duì)工作環(huán)境要求低,便于推廣使用。所述MC-LR檢測(cè)試紙條靈敏度高,準(zhǔn)確性好,操作快捷,具有實(shí)用性和良好的應(yīng)用前景。
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