張帆 李樹垚 張子豪 蔡雪鳳 任巖 劉凱 侯翠艷易欣欣 高秀芝

（1. 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2. 國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100094）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）也稱綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，是一種重要的水源和食源性致病菌［1］，廣泛分布在自然界中，如水、土壤及空氣中均有存在，能引起傷口、呼吸道以及泌尿道感染，甚至?xí)饠⊙Y［2-3］。銅綠假單胞菌耐藥能力強(qiáng)，在治療時(shí)往往需要使用多種抗生素進(jìn)行聯(lián)合用藥，但也不能保證將其完全根除。因此，如何快速而準(zhǔn)確地鑒定出銅綠假單胞菌對(duì)保障食品安全具有重要的意義［4-9］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，人類 70%-80%的疾病都來(lái)源于不潔凈的飲用水［10-11］。瓶裝礦泉水中銅綠假單胞菌污染情況分析日漸受到重視。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有在水源水或成品水中檢出銅綠假單胞菌的報(bào)道［10，12-17］，甚至多批次樣品的銅綠假單胞菌檢出率大于 10%［11］。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 8538-2016天然礦泉水檢驗(yàn)方法和GB/T7918.4-1987化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中分別規(guī)定了礦泉水中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法和化妝品種銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法［18-19］。VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)用于微生物鑒定的準(zhǔn)確率高，可用于微生物實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)工作［20-21］。但根據(jù)日常檢驗(yàn)工作經(jīng)驗(yàn)，按照GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法分離得到的部分陽(yáng)性菌株，采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定后為假陽(yáng)性或假陰性。按照GB/T7918.4-1987化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，同樣會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤檢驗(yàn)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)以VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果為參考，對(duì)GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢測(cè)方法和GB/T 7918.4-1987化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中綠膿桿菌的檢測(cè)方法進(jìn)行分析與比較，研究并優(yōu)化現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法，旨在提高日常樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 （1）標(biāo)準(zhǔn)菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853（BZ-33）與殺鮭氣單胞菌CICC 23564（BZ-34）為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心保藏菌種，支氣管炎博德特菌CGMCC 1.2418（BZ-38）、熒光假單胞菌CGMCC 1.0867（BZ-41），以及惡臭假單胞菌CGMCC 1.2309（BZ-42）為中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏菌種，其中銅綠假單胞菌作為陽(yáng)性對(duì)照，其余菌株為陰性對(duì)照。（2）實(shí)驗(yàn)室保藏菌株：YP-129、YP-131、YP-132、YP-141、YP-143、YP-170、YP-171、YP-190、YP-249、YP-250、YP-251、YP-252、YP-253、YP-254、YP-255、YP-256、YP-257、YP-258、YP-259、YP-260、YP-261 及 YP-269，22株實(shí)驗(yàn)室保藏菌株均分離自礦泉水，保藏菌種前初次乙酰胺試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。

1.1.2 主要試劑及耗材 假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CN瓊脂）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基、血瓊脂平板、SCDLP液體培養(yǎng)基、十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基、綠膿菌色素測(cè)定用培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基（King’s B）、明膠培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯、氧化酶試劑、鈉氏試劑、革蘭氏染色液、生理鹽水（0.45% NaCl和0.85%NaCl）等，以上試劑購(gòu)買自北京陸橋技術(shù)有限公司。GN TEST 革蘭氏陰性桿菌鑒定卡與GP TEST 革蘭氏陽(yáng)性桿菌鑒定卡購(gòu)于北京威泰科生物技術(shù)有限公司、0.45 μm濾膜購(gòu)于PEEL CORNER公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 將-80℃凍存的5株標(biāo)準(zhǔn)菌株與22株實(shí)驗(yàn)菌株劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，36℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代2-3次，得到活化菌株。

1.2.2 梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定方法 （1）把活化好的菌株接種至血瓊脂平板，36℃培養(yǎng)18 h，有刺激性味道、多數(shù)有溶血現(xiàn)象、邊緣不整齊的墨綠色菌落或者扁圓形灰白色菌落為可疑菌落；（2）將可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果與菌體形態(tài)，根據(jù)結(jié)果準(zhǔn)備相應(yīng)的鑒定卡類型；（3）用無(wú)菌棉拭子挑取血平板上活性良好的待測(cè)菌落，將3 mL 0.45% NaCl溶液加入一次性懸浮液管，用生理鹽水調(diào)配至麥?zhǔn)蠞舛?.6左右，在真空填充艙內(nèi)填充至革蘭氏陰性桿菌鑒定卡或革蘭氏陽(yáng)性桿菌鑒定卡，采用梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.2.3 GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法 （1）將1.2.1得到的活化菌株與礦泉水混勻制備102CFU/mL待測(cè)水樣（因?yàn)槿斯の廴舅畼?，菌濃高于?shí)際樣品，省略掉GB 8538-2016中水樣過(guò)濾操作）。（2）吸取1 mL 待測(cè)水樣至無(wú)菌平皿中，與冷卻好的CN瓊脂培養(yǎng)基混勻，（36±1）℃培養(yǎng)。（3）培養(yǎng)24 h和48 h后觀察菌落的生長(zhǎng)情況。計(jì)數(shù)所有顯藍(lán)色或綠色（綠膿菌素）疑似銅綠假單胞菌的菌落，并進(jìn)行綠膿菌素確證性試驗(yàn)。在紫外線下檢查所有發(fā)光不產(chǎn)綠膿菌素疑似銅綠假單胞菌菌落，并進(jìn)行乙酰胺肉湯確證試驗(yàn)。將其它所有紅褐色不發(fā)熒光的菌落進(jìn)行氧化酶測(cè)試、乙酰胺液體培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基確證性試驗(yàn)。（4）確證性試驗(yàn)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂；氧化酶試驗(yàn)；金氏B培養(yǎng)基；綠膿菌素試驗(yàn)；乙酰胺液體培養(yǎng)基產(chǎn)氨試驗(yàn)［18］。

1.2.4 GB/T 7918.4-1987化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 （1）取1 mL的1.2.3待測(cè)水樣接種到體積為99 mL的SCDLP液體培養(yǎng)基中（因人工污染樣品，加樣體積區(qū)別于GB/T7918.4-1987），置于36℃下進(jìn)行培養(yǎng)24 h；觀察培養(yǎng)液顏色是否為黃綠色或藍(lán)綠色以及培養(yǎng)液的表面是否有一層薄薄的菌膜；（2）挑取一環(huán)培養(yǎng)物，劃線接種于十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，（36±1）℃培養(yǎng)24 h；（3）在非選擇性培養(yǎng)基上挑取活性良好的可疑菌落進(jìn)行涂片，并進(jìn)行革蘭氏染色，革蘭氏陰性菌的可疑菌落需進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)；（4）氧化酶試驗(yàn)；（5）綠膿菌素試驗(yàn)操作；（6）硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)；（7）明膠液化試驗(yàn)；（8）42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)［19］。

1.2.5 對(duì)GB 8538.57-2016銅綠假單胞菌檢測(cè)方法的優(yōu)化 結(jié)合幾種方法的測(cè)定原理與結(jié)果對(duì)GB 8538.57-2016銅綠假單胞菌檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，并且應(yīng)用優(yōu)化后的方法對(duì)27株試驗(yàn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果

5株標(biāo)準(zhǔn)菌株與22株實(shí)驗(yàn)室保藏菌株經(jīng)革蘭氏染色，結(jié)果全部為陰性，采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果如表1所示。VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)5株標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定結(jié)果符合率為100%，其中BZ-33為銅綠假單胞菌（Ps. Aeruginosa，94%），其余22株保藏菌株中YP-141（98%）、YP-170（97%）、YP-190（97%）、YP-249（99%）以及YP-258（97%）鑒定為銅綠假單胞菌，全部27株菌株中陽(yáng)性菌株為6株，檢出率為22.2%。陰性菌株為21株。以VITEK 2 Compact對(duì)所有標(biāo)準(zhǔn)菌株和試驗(yàn)菌株的鑒定結(jié)果作為其它兩種檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)結(jié)果的參考。

2.2 GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)結(jié)果

以VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果作為檢驗(yàn)結(jié)果的參考，27株試驗(yàn)菌株采用GB 8538.57- 2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示，12株菌檢測(cè)為銅綠假單胞菌陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為44.4%。假陽(yáng)性的菌有8株，分別是BZ-38、BZ-42、YP-132、YP-250、YP-253、YP-254、YP-256、YP-259，假陽(yáng)性檢出率為29.6%。假陰性的菌株有2株，YP-141和YP-249，假陰性的檢出率為7.4%。結(jié)果表明GB 8538.57-2016中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法對(duì)銅綠假單胞菌檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確率較低。

2.3 GB/T 7918.4-1987化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中綠膿桿菌檢驗(yàn)結(jié)果

27株試驗(yàn)菌株采用GB/T 7918.4-1987化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法綠膿桿菌（銅綠假單胞菌）檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，陽(yáng)性檢出率為26%。假陽(yáng)性的菌株有2株，YP-171和YP-260。假陰性的菌株有1株，YP-141。假陽(yáng)性的檢出率為7.4%。假陰性的檢出率為3.7%。結(jié)果表明GB/T 7918.4-1987檢驗(yàn)方法對(duì)銅綠假單胞菌檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度存在一定的誤差，但是檢驗(yàn)準(zhǔn)確率高于GB 8538.57-2016方法。

2.4 對(duì)銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法的改進(jìn)

綜合3種對(duì)銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)程序與相應(yīng)的檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)其檢驗(yàn)方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，以GB 8538. 57-2016礦泉水中銅綠假單胞菌檢測(cè)方法為例，改進(jìn)后的檢驗(yàn)程序如圖1所示。檢驗(yàn)程序中主要增加了3步：（1）將CN平板上生長(zhǎng)出的藍(lán)綠色菌落、360 nm紫外燈下產(chǎn)熒光（非藍(lán)綠）菌落，轉(zhuǎn)接到血瓊脂平板36±1℃培養(yǎng)24-48 h并計(jì)數(shù)；（2）將可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性桿菌；（3）對(duì)血平板所有可疑菌落進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。結(jié)果判定時(shí)菌體同時(shí)滿足革蘭氏陰性桿菌、氧化酶陽(yáng)性、乙酰胺產(chǎn)氨陽(yáng)性及綠膿菌素陽(yáng)性，判定為銅綠假單胞菌陽(yáng)性，其余反應(yīng)為陰性。

表1 VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)菌株的鑒定結(jié)果

2.5 改進(jìn)銅綠假單胞菌檢測(cè)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)

采用改進(jìn)后的GB 8538. 57-2016礦泉水中銅綠假單胞菌檢測(cè)方法對(duì)27株試驗(yàn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，改進(jìn)后的方法結(jié)果判定BZ-33、YP-141、YP-170、YP-190、YP-249及 YP-258為銅綠假單胞菌陽(yáng)性，全部27株菌株中陽(yáng)性菌株為6株，檢出率為22.2%，與VITEK 2 Compact的鑒定結(jié)果完全一致。

3 討論

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（包括藥敏測(cè)試）是法國(guó)生物梅里埃公司推出的智能系統(tǒng)。適合用于微生物實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)工作。該系統(tǒng)能簡(jiǎn)化日常復(fù)雜的生化實(shí)驗(yàn)操作，曾寫進(jìn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789-2016中，如GB/T4789.4-2016沙門氏菌中的生化鑒定［22］。孫燕萍等［23］采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀對(duì)無(wú)錫市常見(jiàn) 12 種224株食源性致病微生物的鑒定結(jié)果與 API 鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果的總體符合率為99.6%（223/224）；何艷霞等［24］采用 16S rRNA 和 rpoB 基因序列分析在銅綠假單胞菌鑒定中的應(yīng)用，用表型分類方法對(duì)VITEK自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為銅綠假單胞菌的23 株分離株進(jìn)行再鑒定，結(jié)果表明表型再鑒定結(jié)果與自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果一致。宋逸萍等［25］研究發(fā)現(xiàn)VITEK 2 Compact對(duì)銅綠假單胞菌鑒定準(zhǔn)確率在98%以上。但條件一般的檢測(cè)機(jī)構(gòu)，尤其偏遠(yuǎn)地區(qū)的不具備VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物生化鑒定儀，采用其對(duì)樣品鑒定的試驗(yàn)條件要求較高。基于VITEK 2 Compact的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度高的原因，本實(shí)驗(yàn)選用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物生化鑒定儀鑒定結(jié)果作為其它檢測(cè)方法的結(jié)果參照標(biāo)準(zhǔn)。

表2 GB 8538.57-2016對(duì)27株試驗(yàn)菌株的檢驗(yàn)結(jié)果

用GB 8538.57-2016礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法的檢測(cè)結(jié)果中與VITEK 2 Compact結(jié)果相比，假陽(yáng)性的檢出率為29.6%，分析原因是這8株菌在CN培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出黃色菌落，是產(chǎn)熒光（非藍(lán)綠色）的菌落并且乙酰胺實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，依標(biāo)準(zhǔn)被判定為陽(yáng)性檢出銅綠假單胞菌。假陰性的檢出率為7%，分別是YP-141和YP-249。一般陽(yáng)性菌株的熒光多為綠色或黃色，與綠膿菌素的顏色相近。YP-249的菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)異常，分析為該菌為藍(lán)綠色菌落并且綠膿菌素實(shí)驗(yàn)陰性，被判定為陰性未檢出銅綠假單胞菌，然而乙酰胺試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，符合銅綠假單胞菌的生化特性。因此，單純根據(jù)GB 8538.57-2016中所設(shè)計(jì)的生化實(shí)驗(yàn)判定銅綠假單胞菌檢驗(yàn)結(jié)果明顯準(zhǔn)確度不高。另外，所有參與試驗(yàn)的菌株在CN上的菌落顏色均無(wú)紅褐色，故實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行接種金氏B瓊脂培養(yǎng)基的步驟，金氏B 產(chǎn)熒光實(shí)驗(yàn)是不是判定陽(yáng)性結(jié)果的必要條件，這一結(jié)論還需要實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，CN瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出藍(lán)（綠）菌落加綠膿菌素試驗(yàn)和CN瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的黃色產(chǎn)熒光菌落加乙酰胺試驗(yàn)的生化特性并不足以保證其結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，標(biāo)準(zhǔn)GB 8538-2016中的試驗(yàn)方法是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模枰O(shè)計(jì)相應(yīng)的補(bǔ)充生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

表3 GB/T 7918.4-1987對(duì)27株試驗(yàn)菌株的檢驗(yàn)結(jié)果

采用GB/T 7918.4-1987中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)結(jié)果中假陽(yáng)性的菌株有2株，YP-171和YP-260，假陰性的菌株有1株，YP-141。十六烷三甲基溴化銨是標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的作為化妝品受測(cè)試樣品增菌后的篩選分離培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)是用實(shí)驗(yàn)室保藏的純菌種進(jìn)行檢測(cè)，菌株增菌之后，劃線于十六烷三甲基溴化胺瓊脂，經(jīng)培養(yǎng)觀察，即便是標(biāo)準(zhǔn)菌株BZ-33在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況不是很好。而此法的假陽(yáng)性檢測(cè)數(shù)量明顯低于GB 8538.57-2016，分析原因?yàn)槭槿谆寤翻傊x擇性較強(qiáng)，同樣因此出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。

基于GB 8538.57-2016和GB/T 7918.4-1987檢測(cè)方法的程序與實(shí)驗(yàn)判定不足，以GB 8538.57-2016天然礦泉水檢驗(yàn)方法中銅綠假單胞菌檢測(cè)方法為例，改進(jìn)了檢測(cè)方法，改進(jìn)后的檢測(cè)方法避免了單純某種生化反應(yīng)造成的結(jié)果誤判，對(duì)27株試驗(yàn)菌株進(jìn)行鑒定與鑒定儀的結(jié)果完全相符。產(chǎn)品檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性對(duì)企業(yè)和消費(fèi)者都尤為重要。國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心每年檢驗(yàn)工作量巨大，2015年GB 19298-2014包裝飲用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施后，以往不需要做銅綠假單胞菌的純凈水、蒸餾水等樣品也需要做5份銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)［26］。2016年本檢驗(yàn)中心的礦泉水樣品檢測(cè)量約300份，樣品總檢測(cè)量約2 000份。2016年陽(yáng)性檢出率約為5%，用改進(jìn)后方法檢出率降低到3%。改進(jìn)后的GB 8538.57-2016銅綠假單胞菌檢測(cè)方法結(jié)果判定依據(jù)更嚴(yán)謹(jǐn)，結(jié)果更準(zhǔn)確、試驗(yàn)條件要求低、相對(duì)操作簡(jiǎn)單易行。當(dāng)然，這一方法還需要后續(xù)大量的檢測(cè)試驗(yàn)去驗(yàn)證其可行性與準(zhǔn)確性。

圖1 改進(jìn)后的礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)程序

4 結(jié)論

本研究改進(jìn)了GB 8538.57-2016銅綠假單胞菌的檢測(cè)方法，改進(jìn)后的方法增加了血瓊脂平板培養(yǎng)、革蘭氏染色及鏡檢和對(duì)血平板所有可疑菌落進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。用改進(jìn)后的GB 8538-2016銅綠假單胞菌檢測(cè)方法對(duì)27株試驗(yàn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果與VITEK 2 Compact一致。

表4 改進(jìn)后銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)

［1］聞?dòng)衩? 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué)［M］. 上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1999.

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