宋 軍 馬賽君 羅建華 劉 卉 徐 麗 李 麗 張智廣 周瑞祥△

(1 福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室， 福州 350122； 2 福州總醫(yī)院第二住院部檢驗科， 福州 350002)

胃癌是導致原發(fā)性癌癥死亡損失健康生命年(years of life lost，YLL)的第3大原因。2015年全球有130萬胃癌病例和81.9萬胃癌死亡病例[1]。在中國，胃癌的發(fā)病率男性僅次于肺癌排第2，女性胃癌發(fā)病率在乳腺癌、肺癌之后排第3，是死亡率最高的幾種癌癥之一，嚴重威脅人類健康[2]。褪黑素(melatonin，MLT)又名N乙酰5甲氧色胺，是一種吲哚類神經內分泌激素。研究表明，褪黑素具有抗腫瘤的作用，可以抑制胃癌、肝癌、乳腺癌[3]等多種腫瘤。褪黑素通過促進凋亡，抑制增殖，調節(jié)免疫等多種途徑發(fā)揮抗癌作用，然而其抗癌作用的分子機制尚待明確。本研究選取人胃癌細胞系AGS和MGC803，探討褪黑素作用后對細胞周期及增殖的影響，并檢測與細胞周期及增殖相關蛋白的變化以闡明其抗胃癌作用及分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

人胃癌細胞系AGS、MGC803購自上海細胞研究所。采用含10%胎牛血清的RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 及MEM/F12培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。胎牛血清和培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司。褪黑素購自美國Sigma-Aldrich公司，褪黑素溶于無水乙醇中，無水乙醇在培養(yǎng)基中的終濃度不超過1%。CellTiter 96?AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(MTS)細胞增殖試劑盒購自美國Promega公司；BD PharmingenTMPI/RNase Staining Buffer購自美國BD公司；RIPA細胞強裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；蛋白酶抑制劑(cocktail)及蛋白磷酸酶抑制劑(PhosStop)購自瑞士Roche公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司；化學發(fā)光檢測底物CDP-STAR購自Roche公司；免疫印跡實驗(Western blotting)用的特異性抗體，包括CDC25A和磷酸化CDC25A(pCDC25A, phosphor S75)、p21和磷酸化p21(pp21, phosphor T145)抗體以及堿性磷酸酶標記山羊抗兔抗體購自英國Abcam公司；GAPDH購自美國CST公司；堿性磷酸酶標記山羊抗鼠抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 褪黑素對胃癌細胞增殖作用的影響

采用CellTiter 96?AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay(MTS)細胞增殖試劑盒分析褪黑素作用后細胞的增殖活性來選擇合適的作用濃度和作用時間。人胃癌細胞AGS、MGC803以1×104/ml的濃度接種于96孔板中，24 h后用1、2、3、4、5 mmol/L的褪黑素處理，并用加1%無水乙醇的細胞作為陰性對照。分別作用24、48、72 h加入MTS，以不含細胞的培養(yǎng)液做空白對照組，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，檢測490 nm處的吸光度值來分析細胞的增殖活性。細胞增殖抑制率按如下公式計算：增殖抑制率=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。并在倒置顯微鏡下觀察褪黑素處理胃癌細胞狀態(tài)。

1.3 細胞周期分析

采用碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀分析細胞周期。AGS、MGC803用3 mmol/L褪黑素及處理24 h，以加入1%乙醇的培養(yǎng)細胞作為對照組(control)，胰酶消化制成單細胞懸液，加入PI后用流式細胞儀檢測，分析處于G0/G1、S、G2期的細胞百分率。

1.4 免疫印跡檢測

褪黑素處理細胞與加入1%乙醇溶劑的對照細胞(control)采用加入蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白質抑制劑的強裂解液裂解，BCA法定量后，加入12%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，三明治法轉入PVDF上，0.5%牛血清封閉，加入以下幾種一抗4℃孵育過夜：CDC25A(1∶200 稀釋)、pCDC25A(phosphor S75，1∶1 000稀釋)、p21(p21Cip1/p21Waf1，1∶5 000稀釋)、pp21(phosphor Thr145，1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶1 000 稀釋)。PBS漂洗后加堿性磷酸酶連接的二抗室溫孵育1 h，加入化學發(fā)光底物CDP STAR，化學發(fā)光儀檢測目的蛋白。用灰度分析軟件Image J2x分析其灰度值變化。褪黑素處理細胞的蛋白質灰度值除以對照細胞蛋白質灰度值計算蛋白質表達水平變化，以此變化倍數(shù)為縱坐標做直方圖。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 褪黑素作用引起細胞增殖抑制、細胞顯微結構變化顯著

分別用0、1、2、3、4、5 mmol/L的褪黑素處理AGS、MGC803細胞24、48 h和72 h，MTS試劑盒分析細胞增殖活力。結果顯示，褪黑素可抑制AGS、MGC803細胞增殖，具有濃度依賴性(圖1)。褪黑素處理濃度及時間以3 mmol/L和24 h為宜，其細胞抑制率在50%左右，濃度過高或時間過長使細胞死亡過多，難以進行后期的試驗分析。倒置顯微鏡觀察，3 mmol/L褪黑素處理24 h AGS、MGC803與只加褪黑素溶劑乙醇的對照細胞相比，細胞數(shù)量減少，漂浮死亡細胞增多，胞體細長多角，形態(tài)出現(xiàn)明顯變化(圖2)。

2.2 褪黑素作用引起細胞周期阻滯于G1/S期

PI染色流式細胞儀分析細胞周期顯示，褪黑素作用引起不同細胞周期細胞的分布發(fā)生變化。在AGS細胞中，褪黑素作用組較對照組細胞G0/G1期從50.28%

圖1 褪黑素作用人胃癌細胞AGS(A)、MGC803(B)細胞抑制率分析Fig 1 Percentage of cell inhibition in AGS(A) and MGC803(B) treated with melatonin

圖2 3 mmol/L褪黑素作用人胃癌細胞24 h的顯微鏡觀察Fig 2 Microscopic examination of human gastric cancer cells treated with 3 mmol/L melatonin for 24 h compared to control cells

±0.31% 上升到67.04%±1.46%(P<0.01)，S期從17.21%±1.22%下降到9.71%±0.58%(P<0.01)，G2/M 期從32.47%±1.12%下降到23.27%±1.91%(P<0.01)。G0/G1期細胞升高，S期和G2/M期細胞下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在MGC803細胞中，褪黑素作用組較對照組細胞G0/G1期從42.24%±1.27%上升到 47.66%±1.57%(P<0.01)，S期從12.68%±1.13%到 10.03±1.22%(P>0.05)，G2/M 期從44.84%±2.45%到41.88%±0.40%(P>0.05)。G0/G1期細胞升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；S期和G2/M期細胞差異沒有統(tǒng)計學意義。2種類型胃癌細胞褪黑素作用細胞周期分析見圖3。

2.3 褪黑素對AGS、MGC803細胞CDC25A和p21表達及其磷酸化水平的影響

細胞分裂周期蛋白CDC25A 及細胞周期蛋白激酶抑制蛋白p21其表達及磷酸化水平可調控細胞周期的運行。采用免疫印跡的方法，用相應蛋白的普通抗體及磷酸化抗體對細胞增殖及細胞周期調控相關蛋白CDC25A及p21的表達及磷酸化水平進行了分析，在2種胃癌細胞褪黑素作用后都出現(xiàn)CDC25A及p21表達的下調，相應的CDC25A及p21的磷酸化水平也較對照組降低(圖4)。

圖3 3 mmol/L褪黑素作用24 h對人胃癌細胞周期的影響Fig 3 Effect of 3 mmol/L melatonin for 24 h on cell cycle of human gastric cancer cells by flow cytometry

圖4 褪黑素作用AGS(A、C)、MGC803(B、D)細胞CDC25A(A、B)及p21(C、D)表達及磷酸化水平免疫印跡分析Fig 4 Western blotting analysis of the expression and phosphorylation of CDC25A(A,B) and p21(C,D) in AGS(A,C) and MGC803(B,D) with melatonin

3 討論

褪黑素是主要由松果體合成并分泌的一種神經內分泌激素。除松果體外，其他組織和器官也合成褪黑素，如紋狀體、視網(wǎng)膜、脾、肝和胃腸道等[4]。褪黑素具有多種多樣的生理學功能，如：調節(jié)日夜節(jié)律，抑制生殖系統(tǒng)發(fā)育成熟，調節(jié)骨骼生長，抑制腫瘤發(fā)生，調節(jié)免疫，清除自由基抗氧化、抗炎、神經保護等作用[5-6]。褪黑素的抗腫瘤作用是目前褪黑素研究的熱點領域，研究表明褪黑素可以通過多種途徑抑制多種腫瘤，但是褪黑素作用的分子機制尚不十分明確。褪黑素可以抗胃癌。在胃腸道中，褪黑素的含量遠遠超過其他組織，是松果體的400倍，比血清中含量高10～100倍。胃腸道組織細胞不僅可以分泌褪黑素，其上還有褪黑素受體，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮重要的保護和調節(jié)作用。研究表明褪黑素可以增強胃腸道的免疫系統(tǒng)，調節(jié)糞便水份，減緩腸道蠕動，保護胃腸道免受消化酶、胃酸以及外源性藥物的影響[7]。本課題組前期動物實驗表明，褪黑素可通過促進凋亡、抑制增殖以及降低腫瘤組織局部CD4+CD25+Treg細胞抗鼠胃癌[8-9]。Li 等[10]研究褪黑素對胃癌細胞AGS的作用，認為其可通過激活JNK和P38和抑制NF-κB途徑促進AGS的凋亡。

為了進一步研究褪黑素對人胃癌細胞的作用及其作用的分子機制，本研究采用AGS及MGC803作為體外模型，探索褪黑素對其細胞周期、增殖的影響及相關的細胞內分子機制。研究表明褪黑素可以誘導人胃癌細胞AGS及MGC803細胞周期阻滯在G1/S期，抑制AGS及MGC803增殖。細胞周期調控相關分子CDC25A及p21表達及磷酸化水平下降，是褪黑素引起周期阻滯及增殖抑制的作用分子。

CDC25A(細胞分裂周期25A)是一種重要的細胞周期調控因子，其本身為蛋白磷酸酶，可以使磷酸化的CDK4或CDK6 去磷酸化，從而激活cyclin D-CDK4/ CDK6復合體，驅動細胞周期從G1進入S期。體外研究表明，增殖細胞內微注射CDC25A的抗體，或者下調CDC25A的表達可以使細胞周期阻滯于G1/S期。CDC25A在S75位置上磷酸化可以使其穩(wěn)定，避免其泛素化降解，推動細胞周期的進行[11]。褪黑素作用后S75位置上的CDC25A磷酸化水平下調，使其趨向泛素化降解，從而抑制細胞周期從G1進入S期。CDC25A在多種惡性腫瘤如胃癌、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等中高表達，與不良預后相關。本研究結果顯示褪黑素作用MGC803細胞后引起CDC25A表達下調，磷酸化CDC25A(S75)下降促進其分解，提示CDC25A可能是褪黑素誘導MGC803細胞G1/S期周期阻滯，抑制其增殖的關鍵分子。

p21(p21Cip1/p21Waf1)是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族CIP/KIP中的一員，可以激活細胞周期檢測點抑制細胞周期運行。由于p21可以與CDC25A的啟動子相結合從而抑制其表達，因此CDC25A的抑制曾被認為是在DNA受損的情況下，通過p53上調p21來實現(xiàn)的。但在本研究中顯示，p21并不像預期的那樣升高而是下降。提示p21對細胞增殖的調控作用除了抑制作用之外還有其他的作用方式。目前已有研究表明，p21有促進細胞分裂的作用。p21可以與cyclin/cdk 形成cyclin/cdk-p21復合物推動細胞周期的進行；Martin等[12]在研究褪黑素抑制C6神經膠質瘤的作用時也顯示p21下降的現(xiàn)象。另外，Rother 等[13]研究表明p53家族成員Tap63α和p73α可以上調p21，但不抑制CDC25A表達，說明p53對CDC25A的抑制可以不通過p21，表明p21及CDC25A同時下調是可能的。Zhang 等[14]研究表明，當p21在Thr145上磷酸化時，可以促進其穩(wěn)定并定位于細胞核，增強肺癌細胞H1299增殖，p21在腫瘤中的作用具有雙面性[15]。本研究結果顯示褪黑素作用后Thr145位點的磷酸化p21下調，抑制胃癌細胞增殖。

本研究通過分析褪黑素作用人胃癌細胞AGS、MGC803表明：褪黑素下調CDC25A、p21表達及其磷酸化，引起胃癌細胞G1/S期細胞周期阻滯，抑制胃癌細胞增殖，為明確褪黑素抑制胃癌的分子機制提供了理論基礎。