王付燕 杜立群

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院眼科， 濟(jì)南 250012)

組織工程技術(shù)的發(fā)展為再生醫(yī)學(xué)及組織器官的修復(fù)重建提供了新的研究思路，理想的支架材料是組織工程研究及臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)，來源于天然組織或器官的細(xì)胞外基質(zhì)能為細(xì)胞的黏附、生長、增殖和分化提供最為接近自然的微環(huán)境，其用做組織工程支架材料越來越受到研究者的重視[1-3]。取自豬空腸的小腸黏膜下層(small intestinal submucosa，SIS)本質(zhì)為不含細(xì)胞的天然細(xì)胞外基質(zhì)材料，具有良好的生物相容性、一定的機(jī)械強(qiáng)度以及低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于組織工程腹壁、膀胱和角膜上皮等組織器官的修復(fù)重建[4-6]。脫細(xì)胞生物支架可有效降低移植后免疫排斥反應(yīng)，并能很好維持原有細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[7]。為更加深入了解脫細(xì)胞SIS異體移植的可行性，本研究應(yīng)用0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS) 脫細(xì)胞處理豬SIS，SD大鼠皮下埋植組織學(xué)觀察脫細(xì)胞SIS的組織相容性，為其作為組織工程支架材料修復(fù)組織損傷及進(jìn)行臨床移植的可行性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

新鮮豬小腸由濟(jì)南農(nóng)家土豬肉食品有限公司提供(雌雄均可，約6月齡，體質(zhì)量約100 kg)。

雄性SD大鼠(4周齡，體質(zhì)量180～220 g)18只，購于濟(jì)南騰利經(jīng)貿(mào)有限公司。隨機(jī)分為2組，每組9只，分別為正常SIS移植組和脫細(xì)胞SIS移植組。各組大鼠均在清潔恒溫恒濕環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 脫細(xì)胞SIS的制備

獲取新鮮豬小腸，充分沖洗腸內(nèi)容物，超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌PBS(含200 U/ml雙抗)浸泡；機(jī)械剝離獲取黏膜下層，無菌PBS(含200 U/ml雙抗)沖洗；4℃條件下，0.1% SDS處理30 min；無菌PBS反復(fù)清洗；-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 H-E、DAPI、天狼星紅染色觀察SIS生物學(xué)特性

隨機(jī)選取正常SIS和脫細(xì)胞SIS標(biāo)本各5個(gè)常規(guī)石蠟包埋切片，分別行H-E、DAPI及天狼星紅染色，組織學(xué)觀察比較脫細(xì)胞前后SIS支架材料細(xì)胞、DNA成分殘留、組織結(jié)構(gòu)保留及膠原纖維的排列情況。

1.4 SD大鼠皮下埋植

SD大鼠10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)。背部剃毛，局部3%碘酒消毒，鋪無菌洞巾。于背部正中作長約1 cm縱行切口，切開皮膚全層至深筋膜，鈍性分離皮膚及皮下組織做成 1 cm×1 cm 的囊袋，將無菌處理的正常及脫細(xì)胞SIS植片分別平鋪于2組大鼠背部囊袋中。各組均用3-0絲線縫合皮膚切口。大體觀察術(shù)后大鼠的活動(dòng)、進(jìn)食以及傷口情況等。并與術(shù)后1、2、4周各組均麻醉處死3只大鼠，將囊袋的植片完整取出，4%甲醛溶液浸泡固定，標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，行H-E染色分析觀察埋植物及周圍炎癥細(xì)胞的浸潤分布情況。移植后各時(shí)間段炎癥細(xì)胞的數(shù)量主要是通過計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus(IPP) software(Media Cybernetics, Bethesda, MD) 計(jì)算獲得。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 正常及脫細(xì)胞SIS的大體形態(tài)及組織學(xué)觀察(圖1，見封二)

正常SIS在濕潤狀態(tài)下為乳白色菲薄、半透明的膜狀物，并且具有一定的彈性及韌性(圖1A)；脫細(xì)胞SIS呈白色、半透明的膜狀物，稍水腫，保持了良好的彈性及柔韌性(圖1E)。H-E染色光學(xué)顯微鏡下觀察可見機(jī)械刮除的正常豬SIS由整齊有序的膠原纖維排列組成，其組織結(jié)構(gòu)完整，并可見藍(lán)染的細(xì)胞和核物質(zhì)存在(圖1B)。脫細(xì)胞SIS細(xì)胞被完全去除，未見細(xì)胞碎片及藍(lán)染核物質(zhì)殘留(圖1F)；DAPI染色熒光顯微鏡下觀察可見正常SIS細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(圖1C)。脫細(xì)胞SIS細(xì)胞核染色陰性，未見殘留的DNA成分(圖1G)；天狼星紅染色光學(xué)顯微鏡下觀察正常豬SIS組織結(jié)構(gòu)完整，膠原纖維排列規(guī)則、有序(圖1D)。脫細(xì)胞SIS膠原纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，膠原纖維間孔隙率增大(圖1H)。

2.2 SD大鼠皮下埋植實(shí)驗(yàn)

大體觀察(圖2A～C，見封二)：術(shù)后觀察期間2組SD大鼠飲食、活動(dòng)均正常，未出現(xiàn)動(dòng)物死亡情況，未見移植物脫出現(xiàn)象。正常SIS植入組SD大鼠術(shù)后l周時(shí)創(chuàng)緣輕微裂開，2周時(shí)創(chuàng)緣明顯紅腫、裂開，4周時(shí)創(chuàng)緣仍未愈合。脫細(xì)胞SIS植入組術(shù)后l周時(shí)創(chuàng)緣基本愈合，2周時(shí)創(chuàng)緣完全愈合，4周時(shí)幾乎看不清切口(圖2D～F，見封二)。

組織學(xué)觀察(圖2G～L，見封二)：術(shù)后1周時(shí)脫細(xì)胞SIS植片形態(tài)尚完整，植片周圍可見少量以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，些許淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞；術(shù)后2周時(shí)，部分植片開始降解，結(jié)構(gòu)松散，炎癥細(xì)胞總數(shù)明顯增多，可見少量巨噬細(xì)胞，植片周圍出現(xiàn)成纖維細(xì)胞；4周時(shí)脫細(xì)胞SIS植片降解明顯，結(jié)構(gòu)更為松散，植片周圍炎癥細(xì)胞數(shù)較1、2周時(shí)明顯減少，其浸潤細(xì)胞主要為細(xì)長的成纖維細(xì)胞，并可見少量淋巴細(xì)胞浸潤。術(shù)后整個(gè)觀察期內(nèi)正常SIS植片周圍均可見廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤，數(shù)目明顯多于脫細(xì)胞SIS植片組。炎癥細(xì)胞數(shù)定量分析結(jié)果顯示，術(shù)后1周時(shí)正常SIS及脫細(xì)胞SIS植片炎癥細(xì)胞的平均密度分別為5 609/mm2和 1 124/mm2(P<0.05)，術(shù)后2周時(shí)分別為6 186/mm2和 2 045/mm2(P<0.05)， 術(shù)后4周時(shí)炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少，分別為3 991/mm2和226/mm2(P<0.05)(圖3)。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)2組植片炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 正常及脫細(xì)胞SIS植片SD大鼠皮下埋植7、14、28 d炎癥細(xì)胞平均密度計(jì)數(shù)Fig 3 Density of inflammatory cells of normal and acellular SIS implanted in the back of SD rats at 7, 14, 28 days

3 討論

隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的有功能的種子細(xì)胞種植于可降解的支架材料上，將其移植到體內(nèi)損傷部位，隨著支架材料的逐步降解，功能性的種子細(xì)胞增殖分化為形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能與天然組織、器官相似的具有特殊功能的活性組織，其研發(fā)有望解決供體材料匱乏的難題[8]。支架材料是組織工程研究領(lǐng)域不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，理想的支架材料應(yīng)當(dāng)具備以下特點(diǎn)：(1)生物相容性良好；(2)強(qiáng)度大、彈性及柔韌性好，能耐受手術(shù)縫線牽拉；(3)體內(nèi)可降解性，以避免2次手術(shù)取出；(4)具有利于細(xì)胞黏附、生長的空隙；(5)含有促進(jìn)細(xì)胞黏附、 生長、增殖和分化的細(xì)胞因子；(6)來源廣泛、取材方便、價(jià)格低廉[9-10]。豬與人體具有較相似的解剖學(xué)特性，豬的角膜、心、心瓣膜、皮膚等組織器官的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)支架早已廣泛應(yīng)用于組織工程再造的研究[11-14]，并取得良好的效果。豬SIS取自空腸，來源廣泛、獲取方便、價(jià)格低廉，取材不存在倫理方面的問題；具有良好的生物相容性，適當(dāng)?shù)纳锪W(xué)性能以及低免疫原性；含有能促進(jìn)細(xì)胞生長分化的細(xì)胞因子，比如血管內(nèi)皮生長因子及轉(zhuǎn)化生長因子-β等[1, 15]。豬SIS的優(yōu)良生物學(xué)特性是其成為理想支架材料的物質(zhì)基礎(chǔ)，相關(guān)研究報(bào)道美國FDA已批準(zhǔn)其用于部分臨床組織器官的修復(fù)重建[16-17]。

豬來源的SIS帶有能夠引起宿主移植排斥反應(yīng)的細(xì)胞膜表面抗原及異種DNA物質(zhì)，高效的脫細(xì)胞方法能夠完全去除SIS所含異種抗原物質(zhì)，并完整保留其膠原纖維結(jié)構(gòu)及生長因子等活性物質(zhì)，為種子細(xì)胞的黏附、生長提供適宜的支架[18-19]。以往的研究證明[12, 15]，SDS是目前廣泛使用的脫細(xì)胞試劑，具有比其他離子型洗滌劑(Triton X-100 和丙酮/乙醇)更強(qiáng)的脫細(xì)胞效果，并且在有效去除細(xì)胞成分的同時(shí)不會(huì)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能造成明顯損傷。本研究應(yīng)用 0.1%濃度的SDS脫細(xì)胞處理豬SIS 30 min，組織學(xué)觀察未見藍(lán)染的細(xì)胞及DNA物質(zhì)殘留，同時(shí)可見脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)支架組織結(jié)構(gòu)完整，膠原纖維排列規(guī)則有序，膠原結(jié)構(gòu)完整，膠原間孔隙率增大。

理論上講，外源性的組織工程支架材料對(duì)宿主來說是異物，機(jī)體必然要對(duì)其產(chǎn)生異物反應(yīng)。而支架材料的組織相容性對(duì)應(yīng)答的反應(yīng)程度、炎癥消退和修復(fù)重建的完成起到?jīng)Q定性的作用。本實(shí)驗(yàn)將脫細(xì)胞SIS植入SD大鼠背部皮下，通過觀察皮膚切口的愈合，植入體內(nèi)的降解情況及計(jì)算炎癥細(xì)胞的數(shù)量來評(píng)價(jià)脫細(xì)胞SIS的組織相容性，并與正常SIS移植SD大鼠做比較。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示脫細(xì)胞SIS在植入初期時(shí)結(jié)構(gòu)尚完整，周圍可見些許淋巴細(xì)胞浸潤；中期時(shí)植片開始部分降解，組織結(jié)構(gòu)松散，并可見成纖維細(xì)胞浸潤；隨著植入時(shí)間的延長，植片降解明顯，結(jié)構(gòu)較初始狀態(tài)更為松散，成纖維細(xì)胞變細(xì)變長。有研究報(bào)道[1, 20]，SIS作為異體移植物植入宿主體內(nèi)主要誘導(dǎo)輔助性Th2淋巴細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)，Th2淋巴細(xì)胞主要是通過釋放白細(xì)胞介素-4、10、13調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，促進(jìn)宿主對(duì)移植材料的耐受以及材料的重塑，是宿主對(duì)移植物的正常反應(yīng)，且Th2淋巴細(xì)胞能減弱Th1淋巴細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的釋放。本研究處理的脫細(xì)胞SIS中有少量的DNA 殘留，但殘留量很少，尚不足以引起排斥反應(yīng)[21]。

總之，制備的脫細(xì)胞SIS在植入SD大鼠體內(nèi)短期內(nèi)有少量以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，隨著植入時(shí)間的延長，炎癥細(xì)胞逐漸減少，成纖維細(xì)胞逐漸增多，植片逐漸變薄，結(jié)構(gòu)逐漸松散，表現(xiàn)出良好的組織相容性，為后期進(jìn)一步的開展臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。