張 穎, 劉 佳, 廉 想, 張金梅, 佟德利

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

黃瓜起源于印度,是世界栽培廣泛的園藝作物之一,在我國(guó)設(shè)施內(nèi)栽培面積大,因其風(fēng)味和口感廣受人民喜愛(ài),在蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)中占重要地位,但我國(guó)設(shè)施環(huán)境中的亞適宜問(wèn)題對(duì)黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。自2009年黃瓜全基因組測(cè)序以來(lái)[1],釋放了大量的基因組數(shù)據(jù),隨后進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序,為黃瓜的品質(zhì)改良提供了豐富的組學(xué)數(shù)據(jù),為進(jìn)一步從基因水平提高黃瓜的品質(zhì)提供契機(jī)。

WRKY是近年來(lái)廣泛研究的熱點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子,自從1994年從甘薯中被發(fā)現(xiàn)以來(lái),研究人員利用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等方法,逐步揭示了WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能,發(fā)現(xiàn)它們不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物及非生物脅迫的過(guò)程,還參與一些特殊的代謝途徑。但WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物響應(yīng)逆境,以及詳細(xì)的生理生化反應(yīng)分子機(jī)制,目前尚未完全解析清楚[2]。借助黃瓜基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序完成的契機(jī),以黃瓜為研究對(duì)象,利用生物信息學(xué)工具在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子這個(gè)調(diào)控基因表達(dá)的開(kāi)關(guān),以期揭示黃瓜在設(shè)施內(nèi)亞適宜環(huán)境下的調(diào)控機(jī)制,為設(shè)施黃瓜調(diào)控抗逆提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種為設(shè)施溫室內(nèi)抗病抗逆品種“中農(nóng)26”,種子購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。

植物總RNA的提取采用TRIzol方法進(jìn)行, 提取后測(cè)定其濃度,取5 μg RNA進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。使用Fermentas公司的Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。RT-PCR所用的酶及T載體均購(gòu)自Vazyme公司。

1.2 方 法

1.2.1 黃瓜總RNA的提取及cDNA克隆

本實(shí)驗(yàn)于沈陽(yáng)師范大學(xué)生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,2017年2月將黃瓜種子經(jīng)消毒后催芽,種子露白播種于50孔穴盤(pán),育苗基質(zhì)為按體積比為2∶1混配的草炭和蛭石。出苗后待第一片真葉完全展開(kāi),分苗到營(yíng)養(yǎng)缽里(直徑10 cm)。之后培養(yǎng)于沈陽(yáng)師范大學(xué)日光溫室內(nèi)。當(dāng)黃瓜生長(zhǎng)至兩葉一心時(shí),提取葉片組織RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR,電泳回收后轉(zhuǎn)入GV pXT19-T Vector的載體中,進(jìn)行TA克隆,篩選獲得陽(yáng)性克隆后,送上海生工公司測(cè)序并做序列比對(duì)。

1.2.2CsWRKY32基因的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析CsWRKY32基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列的性質(zhì),應(yīng)用GSDS[3]軟件繪制CsWRKY32基因的結(jié)構(gòu);應(yīng)用SMART軟件預(yù)測(cè)WRKY結(jié)構(gòu)域,利用NetPhos 2.0 Server進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè),PORTII軟件預(yù)測(cè)基因的亞細(xì)胞定位。使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)選用鄰位相接法(neighbor-joining),設(shè)置bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsWRKY32的cDNA克隆

CsWRKY32基因克隆以?xún)扇~一心的黃瓜葉片做實(shí)驗(yàn)材料,液氮速凍后提取RNA,如圖1a所示,得到較為清晰的28S,18S和5.8S三條RNA條帶,證明RNA提取完整,經(jīng)ScanDrop200測(cè)試RNA濃度,得A260/280在2.0～2.2之間,證明RNA純度較高。進(jìn)一步應(yīng)用表1引物進(jìn)行RT-PCR克隆CsWRKY32,如圖1b所示,除目的條帶1 000 bp左右,還出現(xiàn)一條非特異性擴(kuò)增條帶,因此,我們割膠回收目的條帶進(jìn)行TA克隆,經(jīng)藍(lán)白斑篩選后,選擇白斑,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè),如圖1c所示,為BglⅡ及SpeⅠ酶切質(zhì)粒的電泳圖。出現(xiàn)目的條帶送菌液測(cè)序。

表1 PCR引物表Tab.1 Primers used for PCR assays

(a)—黃瓜RNA提取電泳圖; (b)—CsWRKY32逆轉(zhuǎn)錄PCR電泳圖; (c)—TA克隆后雙酶切電泳圖圖1 CsWRKY32的基因cDNA克隆電泳圖Fig.1 cDNA clone of CsWRKY32 gene

2.2 CsWRKY32基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1CsWRKY32的基因結(jié)構(gòu)及序列分析

CsWRKY32的cDNA開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)975 bp,如圖2a顯示,由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成,外顯子1、2、3、4、5大小分別為1～84、196～264、730～1068、1948～2064、2544～2909 bp;該基因編碼的蛋白預(yù)測(cè)由324個(gè)氨基酸組成, WRKY結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果表明:CsWRKY32蛋白含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域,位于蛋白的166個(gè)氨基酸到226個(gè)氨基酸之間(圖2b)。依據(jù)Eulgem[4]等 的分類(lèi)方法,屬于Ⅱ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子。PORTII軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)后,結(jié)果表明該蛋白60.9%定位于細(xì)胞核中,17.4%定位于細(xì)胞質(zhì),13.0%定位于細(xì)胞支架,4.3%定位于高爾基體,4.3%定位于線粒體。這一結(jié)果符合CsWRKY32是轉(zhuǎn)錄因子的特性。

圖2 預(yù)測(cè)CsWRKY32的基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域Fig.2 Analysis of CsWRKY23 gene structure and prediction of WRKY domain

2.2.2CsWRKY32預(yù)測(cè)蛋白基本性質(zhì)分析

應(yīng)用 http:∥web.expasy.org/protparam/網(wǎng)站對(duì)CsWRKY32蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析:CsWRKY32蛋白的等電點(diǎn)為6.35、分子量為36.3 kDa;其中帶有負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)46個(gè),帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)44個(gè),平均親水系數(shù)(grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.766,脂肪系數(shù)(aliphatic index)為71.02,通常認(rèn)為平均親水系數(shù)越低,蛋白親水性越強(qiáng)[5],因此,預(yù)測(cè)CsWRKY32是一個(gè)親水蛋白。應(yīng)用ProtScale網(wǎng)站對(duì)CsWRKY23蛋白做親疏水性分析,氨基酸標(biāo)度選Hphob.Kyte & Doolittle為默認(rèn)值,如圖3所示,該蛋白的324個(gè)氨基酸的親疏水性分析結(jié)果表明,氨基酸標(biāo)度的最大值是第308位氨基酸的2.289,氨基酸標(biāo)度最小值是119位氨基酸的-2.911。應(yīng)用Expasy網(wǎng)站的Swiss-Model工具進(jìn)行蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),并用Swiss PDB viewer軟件顯示,預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)有5個(gè)β折疊片(圖4)。

圖3 CsWRKY32的親水性、疏水性分析Fig.3 Hydrophobic or hydrophilic property of CsWRKY32

圖4 CsWRKY32的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of 3-D structure of CsWRKY32

利用NetPhos 2.0 Server 軟件[6-7]對(duì)CsWRKY32的蛋白序列進(jìn)行潛在的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè),結(jié)果表明, 該蛋白含有潛在的絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr和酪氨酸Tyr磷酸化位點(diǎn),其中磷酸化位點(diǎn)數(shù)目最多是Ser,為20個(gè),其次為T(mén)yr,有6個(gè),最少的為T(mén)hr,有4個(gè)。

2.2.3 CsWRKY32系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NCBI的BLAST功能在UniProKB數(shù)據(jù)庫(kù)中與CsWRKY32序列比對(duì),獲得得分較高的WRKY蛋白10個(gè),如圖5所示,分別是AtWRKY18(Q9C5T4.2)、AtWRKY60(Q9SK33.1)、AtWRKY40(Q9SAH7.1)、OsWRKY76(Q6IEK5.1)、OsWKRY62(Q6EPZ0.1)、AtWRKY47(Q9ZSI7.2)、AtWRKY42(Q9XEC3.1)、AtWRKY9(Q9C9F0.1)、AtWRKY72(Q9LXG8.1)和AtWRKY36(Q9CAR4.1),系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5所示,結(jié)果表明AtWRKY40與CsWRKY32是同源基因,這與我們之前的研究結(jié)果[8]吻合。

圖5 CsWRKY32的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic analysis of CsWRKY32

3 討 論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,具有特殊的WRKYGQK保守的結(jié)構(gòu)域[9]。在植物的一生中生物脅迫與非生物脅迫時(shí)有發(fā)生,諸多的研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了干旱[10-11]、高鹽[12]、低溫[13-14]等非生物脅迫,并在植物的抗逆過(guò)程中起到了重要的調(diào)控作用,這為改良設(shè)施環(huán)境內(nèi)園藝作物的產(chǎn)量和品質(zhì)提供了新思路。

隨著黃瓜基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的完成, 以及生物信息學(xué)的發(fā)展[15], 以黃瓜為研究對(duì)象揭示W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子的功能的報(bào)道逐漸增多, 李勝男等[16]揭示了黃瓜WRKY30在霜霉威脅迫下的表達(dá)變化及功能, 張穎等[17]揭示了黃瓜CsWRKY23這個(gè)含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的基因響應(yīng)低溫脅迫, 并且對(duì)其蛋白的功能進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。 但目前對(duì)單一WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能研究較多, 對(duì)于其調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)通路、上下游作用因子尚不明確[18-19]。 因此, 要進(jìn)一步借助組學(xué)及生物信息學(xué)的工具對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步預(yù)測(cè), 進(jìn)而利用分子生物學(xué)、遺傳學(xué)以及生物化學(xué)等手段驗(yàn)證其網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的作用。

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究表明,黃瓜CsWRKY32基因開(kāi)放讀碼框全長(zhǎng)975 bp,含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域,屬于類(lèi)ⅡWRKY轉(zhuǎn)錄因子,與擬南芥AtWRKY40同源。車(chē)永梅等[10]研究表明,AtWRKY40響應(yīng)干旱信號(hào),參與干旱脅迫反應(yīng);這與我們前期在黃瓜上的研究結(jié)果不盡相同,Ling等[8]在黃瓜幼苗期利用半定量RT-PCR研究CsWRKY32發(fā)現(xiàn),其并未響應(yīng)干旱等非生物脅迫,但該基因在黃瓜結(jié)果期是否響應(yīng)干旱脅迫的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。此外,AtWRKY40參與植物對(duì)抗脅迫的過(guò)程,并在調(diào)控脅迫響應(yīng)的編碼葉綠體及線粒體蛋白的核基因中起了重要作用[20]。這些為繼續(xù)研究黃瓜CsWRKY32基因的功能提供了思路。