孔麗蕊，黃深華，黃亨建

(1.成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,四川 成都,611730; 2.四川大學(xué) 華西醫(yī)院,四川 成都,610041)

膿毒癥是指宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的致命性的器官功能障礙[1]，是導(dǎo)致重癥感染患者死亡的主要原因，是人類健康的重大威脅之一。按嚴(yán)重程度分為膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克。肝素結(jié)合蛋白是一種多功能蛋白，具有殺菌功能和趨化特性，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。文中將對HBP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分泌表達(dá)及其對膿毒癥的早期預(yù)警、預(yù)后評估作用進(jìn)行闡述。

1 HBP結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

HBP是一種存在于多形核白細(xì)胞(human polymorphonuclear leukocyte，PMN)顆粒中的多功能炎癥介質(zhì)。1984年，作為中性粒細(xì)胞內(nèi)對具有殺滅革蘭陰性菌和白色念珠菌活性作用的蛋白質(zhì)被Shafer等[2]首次發(fā)現(xiàn)并分離成功，因其具有殺菌活性，相對分子量為37000，被命名為陽離子抗菌蛋白37(cation,ic antimicrobial protein of 37000，CAP37)。后來，Gaday等[3]從多形核白細(xì)胞顆粒中成功分離出具有殺菌活性的嗜苯胺藍(lán)蛋白，將其命名為天青殺素(Azurocidin)。1991年，F(xiàn)lodgaand等[4]又從人和豬的多形核白細(xì)胞顆粒中分離出具有強(qiáng)結(jié)合肝素能力的蛋白，因其特殊結(jié)構(gòu)帶有正電荷，與肝素有極高的親和力，將其命名為肝素結(jié)合蛋白。通過蛋白及相關(guān)基因測序證實(shí)，CAP37、天青殺素、HBP三者為同一種蛋白。

未成熟的HBP由251個(gè)氨基酸組成。在合成單鏈糖蛋白過程中，N末端去除26個(gè)氨基酸殘基，C末端去除3個(gè)氨基酸殘基，導(dǎo)致HBP失去蛋白酶的活性[5]，變?yōu)橛?22個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的成熟HBP分子。成熟HBP分子與人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶有45%的同源性，因其結(jié)構(gòu)上有一個(gè)催化作用的三聯(lián)體，使HBP41位的組氨酸殘基和175位的絲氨酸殘基被絲氨酸和甘氨酸替代，在分子表面形成獨(dú)立的板塊[6]，致其無法與二異丙基氟磷酸結(jié)合而失去蛋白酶的活性。 重組HBP分子上具有催化作用的三聯(lián)體，三聯(lián)體是由兩個(gè)類似胰蛋白酶的蛋白酶類區(qū)域組成的，這兩個(gè)區(qū)域是由6個(gè)反向平行的β氨基酸組成的β圓柱形，仍具有與胰蛋白酶抑制劑(BPTI)結(jié)合的活性。另外，HBP序列還與人的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶有45%的同源性，與蛋白酶3有42%的同源性，與組織蛋白酶G有32%的同源性[7]，它們同為絲氨酸蛋白酶家族的成員，具有蛋白消化、免疫調(diào)節(jié)、激活激素等生理功能[8]。同時(shí)，HBP蛋白序列中第20-44位氨基酸殘基組成的V型疏水結(jié)構(gòu)，對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)脂質(zhì)A具有高親和力而獲得結(jié)合內(nèi)毒素的能力[9]。LPS是全身炎癥反應(yīng)的重要觸發(fā)劑，通過LPS受體刺激多種細(xì)胞，釋放、表達(dá)多種細(xì)胞因子，發(fā)揮其毒性作用[10]。

2 HBP的表達(dá)機(jī)制

2.1 HBP的釋放機(jī)理

HBP存在于多形核白細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒和分泌顆粒中[11]，正常人含量極低，一般不超過10ng/ml。一旦機(jī)體發(fā)生感染，菌體或細(xì)菌釋放毒素進(jìn)入血液循環(huán)，激活體內(nèi)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種炎性介質(zhì)釋放HBP。目前報(bào)道的HBP釋放機(jī)制有：1)化膿性鏈球菌細(xì)胞壁表面的M1蛋白進(jìn)入血液與纖維蛋白原結(jié)合形成復(fù)合物，再與多形核白細(xì)胞表面β2整合素結(jié)合，誘導(dǎo)PMN釋放HBP[12]；2)溶血性鏈球菌產(chǎn)生鏈球菌溶血素(streptolysin O，SLO)，SLO是一種含-SH的蛋白質(zhì)，對中性粒細(xì)胞通過毒力穿孔破壞細(xì)胞，致細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，激活p38-絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)信號通路，使效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)、合成、釋放IL-1、IL-8、腫瘤壞死因子α(Tumour necrosis factor-α，TNF-α)等多種炎性細(xì)胞因子及花生四烯酸產(chǎn)物，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)PMN釋放HBP[13]； 3)A族β溶血性鏈球菌引起真皮細(xì)菌感染，導(dǎo)致炎癥蔓延，通過局部激活人體接觸系統(tǒng)導(dǎo)致HBP釋放[14]；4)中性粒細(xì)胞表面胰蛋白酶抑制劑(BLT1)與花生四烯酸代謝產(chǎn)物白三烯(LTB4)結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路，誘導(dǎo)HBP釋放[15]； 5)LPS刺激單核細(xì)胞分泌少量HBP[16]。

2.2 HBP的作用機(jī)制

血管內(nèi)皮細(xì)胞是HBP釋放表達(dá)后第一個(gè)靶細(xì)胞。HBP分子帶有大量正電荷，與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的多糖包被結(jié)合[17]，激活細(xì)胞內(nèi)小G蛋白家族的Rho信號通路[18]，引起肌球蛋白輕鏈激酶/肌球蛋白輕鏈(MLCK/MLC)磷酸化，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活，形成肌動(dòng)蛋白張力纖維，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞骨架重排，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞屏障破壞，通透性增強(qiáng)，細(xì)胞旁通路滲漏，細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)流出[19]。血漿漏出的同時(shí)多形核白細(xì)胞移行到組織并脫顆粒，釋放大量HBP，導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞的趨化與激活[20]。

Rasmssen等[21]發(fā)現(xiàn)HBP能激活單核/巨噬細(xì)胞，使其分泌炎癥介質(zhì)和相關(guān)分子表達(dá)上調(diào)，吞噬和直接清除殺傷細(xì)菌，還能合成和釋放非特異性炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)免疫功能[22]。這些細(xì)胞因子以旁分泌的形式激活第二信使，改變相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而改變靶細(xì)胞行為。經(jīng)孵育后的巨噬細(xì)胞，其人白細(xì)胞抗原Ⅱ(HLAⅡ)、CD40、CD86表達(dá)增加[23],白細(xì)胞IgG受體(FcγRs)、CD64、CD32表達(dá)上調(diào)，釋放TNF-α、IFN-α等炎癥介質(zhì)[24],擴(kuò)大相關(guān)炎癥反應(yīng)。

另有研究[25]證實(shí)HBP進(jìn)入細(xì)胞后聚集在線粒體區(qū)域，通過線粒體途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。HBP分子帶有大量正電荷，能被線粒體外膜轉(zhuǎn)位因子及內(nèi)膜轉(zhuǎn)位因子(TOM/TIM)識別并允許通過進(jìn)入線粒體[26]，引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)內(nèi)線粒體形態(tài)學(xué)異常，膜電位下降，氧代謝關(guān)鍵蛋白CoxⅡ基因表達(dá)下調(diào)，從而抑制線粒體氧代謝功能[27]。

3 HBP在膿毒癥中的評估預(yù)警作用

膿毒癥是指由感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response sydrome，SIRS)[28]。機(jī)體感染時(shí)血漿外滲，中性粒細(xì)胞聚集到感染部位，進(jìn)一步加重導(dǎo)致SIRS，發(fā)展為膿毒癥，膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展出現(xiàn)循環(huán)和細(xì)胞/代謝失調(diào)，最后導(dǎo)致膿毒性休克[29]?！吨袊鴩?yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)》[30]指出，肝素結(jié)合蛋白(HBP)可作為膿毒癥，特別是嚴(yán)重細(xì)菌感染的一種早期診斷標(biāo)志物。

3.1 HBP早期預(yù)警價(jià)值

炎癥反應(yīng)早期，血漿外滲、中性粒細(xì)胞趨化、游走、激活引起的病理生理過程是造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的始動(dòng)因素[31]，大量研究[32-33]證實(shí)膿毒癥患者HBP水平表達(dá)高于非膿毒癥組。Akesson等[34]發(fā)現(xiàn)338名膿毒癥患者HBP水平在血壓降低前已明顯高于對照組，143名嚴(yán)重膿毒血癥患者血漿HBP濃度大于30ng/ml時(shí)，平均在10.5h后80%的患者出現(xiàn)器官衰竭。這些特征，凸顯了HBP作為一種診斷工具的潛力。

陳瓊娜等[35]通過收集診斷膿毒癥的時(shí)刻0h、前24h、前48h、前72h HBP檢測水平發(fā)現(xiàn)，診斷膿毒癥0h、前24h、前48h、前72h時(shí)的敏感度和特異度分別為90.7%和84.2%、90.7%和65.8%、83.7%和63.2%、83.0%和42.3%，HBP從膿毒癥早期至膿毒癥診斷前72h就存在較佳的診斷效能，其診斷窗口期一直延續(xù)至膿毒癥診斷成立時(shí)刻。馮敏[36]等在探討HBP的診斷學(xué)價(jià)值的過程中也發(fā)現(xiàn)，HBP對膿毒癥的靈敏度或者特異度的表達(dá)均在85%以上，對膿毒癥的早期診斷具有一定的參考價(jià)值。

3.2 HBP評估預(yù)測作用

膿毒癥是導(dǎo)致重度感染患者死亡的主要因素。Kumar等[37]證實(shí)膿毒癥休克患者，血壓下降與抗生素使用之間的時(shí)間與患者病死率密切相關(guān)。膿毒癥發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞被菌體、毒素及凝血因子復(fù)合物等激活[27,38]，粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放HBP[39]，激活Ca2+，血管通透性增加，大分子物質(zhì)滲漏及組織損傷[16，40]，炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，從而破壞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞缺氧、有效循環(huán)血容量降低、機(jī)體器官功能衰竭、死亡，引起低血壓甚至休克。

朱宏坤[41]研究發(fā)現(xiàn)，血漿HBP與膿毒性休克的發(fā)生及疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，與器官功能障礙數(shù)目多少關(guān)系不大，說明HBP參與了內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和毛細(xì)血管滲漏機(jī)制,具有很強(qiáng)的致血管滲漏作用,HBP能特異性地作用于循環(huán)血管，但不參與多器官功能障礙的炎癥打擊反應(yīng)機(jī)制，可以作為預(yù)測疾病預(yù)后、評估病死率的指標(biāo)。Linder等[34]對ICU病房中嚴(yán)重?cái)⊙Y或膿毒性休克患者的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，HBP水平與病情嚴(yán)重性息息相關(guān)，HBP隨著病程延長而上升是病情惡化的一種預(yù)兆，HBP含量較高的患者有更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)。

劉楊等[42]研究血漿HBP在膿毒癥休克中的預(yù)測作用中時(shí)發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者HBP水平明顯高于非膿毒癥患者，休克組膿毒癥患者HBP水平高于非休克組膿毒癥患者，HBP預(yù)測膿毒癥休克時(shí)較傳統(tǒng)指標(biāo)乳酸和APACHEⅡ評分有優(yōu)勢，是良好且特異性的膿毒癥休克發(fā)生和膿毒癥患者死亡的早期預(yù)測指標(biāo)。

4 結(jié)語

臨床上用于判斷感染的炎癥指標(biāo)很多，其升高水平不一定能準(zhǔn)確反映病情的嚴(yán)重程度。研究證實(shí)[43-44]，白細(xì)胞(WBC)、C反應(yīng)蛋白(CRP)等缺乏特異性，無法反映預(yù)后，降鈣素原(procalcitonin ，PCT)有助于診斷膿毒癥及評判膿毒癥的嚴(yán)重程度，只在機(jī)體感染產(chǎn)生全身反應(yīng)時(shí)才會產(chǎn)生，局部感染或慢性感染時(shí)血清水平正?；蜉p微升高[45]，不能有效區(qū)分是細(xì)菌感染還是非細(xì)菌感染所引起的SIRS[46]。 HBP作為一種顆粒釋放蛋白，與細(xì)菌感染有緊密的關(guān)系，作為臨床新型炎癥標(biāo)志物，HBP存在較寬的窗口期，具有早期、特異、敏感的特性，優(yōu)于傳統(tǒng)的炎癥標(biāo)志物[47-48]，且對膿毒癥的早期預(yù)警、預(yù)測評估及療效觀察具有特異性的臨床價(jià)值。但有關(guān)HBP在體內(nèi)產(chǎn)生和釋放機(jī)制及臨床應(yīng)用方面的研究尚存在許多空白點(diǎn)，仍需進(jìn)一步探索研究。