王 琳, 李 瑩, 戴紹軍, 喻娟娟*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室,黑龍江,哈爾濱 150040;2.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

環(huán)境脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)積累過量的活性氧分子(ROS),包括過氧化氫(H2O2)、羥自由基(?OH)、超氧陰離子(O2?-)和單線態(tài)氧(1O2)等[1].雖然適量的ROS可以作為信號分子參與脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo),但是過量的ROS會對植物體內(nèi)的生物分子(蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等)和細胞結(jié)構(gòu)造成氧化損傷.蛋白質(zhì)中的半胱氨酸(Cys)殘基含有富含電子的硫原子,是ROS介導(dǎo)氧化還原的敏感靶點之一[2].Cys可氧化修飾由ROS引發(fā)的二硫鍵(S-S)形成、S-谷胱甘肽化(-SSG)、S-磺胺化(-SN)、S-亞磺?；?-SOH)、次磺?；?-SO2H),以及S-磺?；?-SO3H).其中,Cys氧化形成的S-S、-SSG和-SOH可以被相應(yīng)的還原劑還原成游離巰基(-SH).這三種形式的Cys可逆修飾可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象影響蛋白質(zhì)功能.因此,多數(shù)研究關(guān)注了植物中S-S、-SSG和-SOH等可逆氧化修飾[3].

近年來,逐漸發(fā)展起來的一系列氧化還原蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為系統(tǒng)研究植物氧化還原修飾提供了重要手段[4].其中,差異烷基化技術(shù)是研究蛋白質(zhì)Cys可逆氧化修飾的常用方法.該技術(shù)先利用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)或碘乙酰胺(IAM)等烷基化試劑封閉游離巰基,再利用還原劑如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)對已被可逆氧化修飾的Cys進行還原,進而應(yīng)用不同試劑標記還原后新形成的自由巰基,并通過生物質(zhì)譜鑒定氨基酸序列或Cys位點.因標記試劑不同形成了幾種氧化還原蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法.本文作者對這些研究方法進行了綜述.

1 基于熒光標記的雙向電泳(2DE)技術(shù)

基于熒光標記的2DE分析技術(shù)應(yīng)用能巰基特異結(jié)合的熒光試劑(如單溴二胺mBBr或吲哚乙酰氨基熒光素IAF)標記還原后新形成的自由巰基.其中,mBBr是一種應(yīng)用最為廣泛的熒光試劑,它能夠穩(wěn)定結(jié)合自由巰基,分子量小,對蛋白質(zhì)分子量的影響較小,適合被應(yīng)用于質(zhì)譜分析.熒光試劑標記后的蛋白質(zhì)通過2DE被分離,并可以在紫外光下的凝膠上呈現(xiàn)出熒光斑點.蛋白質(zhì)斑點的熒光強度與mBBr的結(jié)合量存在比例關(guān)系,據(jù)此可以計算出蛋白質(zhì)中Cys被氧化的程度.進而,通過mBBr信號與蛋白質(zhì)豐度信號(經(jīng)Ruby等染色劑獲得)的比值可以判斷蛋白質(zhì)氧化還原水平的變化[5-7].

2DE是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù),該技術(shù)結(jié)果呈現(xiàn)方式直觀、成本低廉,但是操作步驟繁瑣,重復(fù)性不佳,對于特殊蛋白質(zhì)(如極端等電點、極端分子量,和低豐度蛋白質(zhì))分離效果不好.盡管基于熒光標記的2DE技術(shù)可以檢測蛋白質(zhì)總體Cys氧化還原水平的變化,但無法對蛋白質(zhì)中被修飾的Cys進行定量分析.

2 基于生物素-巰基特異性試劑標記的技術(shù)

2.1 基于生物素-巰基特異性試劑標記的2DE技術(shù)

基于生物素-巰基特異性試劑標記的2DE技術(shù)應(yīng)用與生物素結(jié)合的巰基特異性試劑,如biotin-HDPD(N-[6-(biotinamido)hexyl]-3′-(2′-pyridyldithio) propionamide)或biotin-IAM/NEM/maleimide,可用于標記還原后新形成的自由巰基,從而使可逆氧化修飾的蛋白質(zhì)Cys被生物素化.進而,利用可與生物素特異結(jié)合的鏈霉親和素(streptavidin)或抗生素蛋白(avidin)柱子富集和純化生物素化蛋白質(zhì),并通過2DE分離蛋白質(zhì).2DE凝膠上呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點大小反映了Cys被氧化的蛋白質(zhì)豐度[8].此技術(shù)與基于熒光標記的2DE技術(shù)類似,無法實現(xiàn)蛋白質(zhì)中被氧化修飾Cys的定量分析.

2.2 基于生物素-巰基特異性試劑標記的同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)

應(yīng)用生物素-巰基特異性試劑標記的可逆氧化修飾的蛋白質(zhì),也可利用iTRAQ技術(shù)進行定量分析.iTRAQ技術(shù)是美國AB SCIEX公司推出的一項蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析技術(shù),其關(guān)鍵在于iTRAQ試劑.iTRAQ試劑是一系列小分子同重元素化學(xué)物質(zhì),由分子量不同的系列報告基團(分子量分別為113,114,115,116,117,118,119,121 u)、中性平衡基團和反應(yīng)基團三部分組成[9-10].反應(yīng)基團可以與蛋白質(zhì)酶切后的多肽的氨基末端或賴氨酸側(cè)鏈基團相連,從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)多肽的標記;質(zhì)譜檢測到的報告基團的信號強度可以反映每個被標記的蛋白質(zhì)多肽的豐度.另外,由于生物素-巰基特異性試劑可以與可逆氧化修飾的Cys共價連接,該技術(shù)可以對含有可逆氧化修飾的Cys進行定量分析.與2DE技術(shù)相比,iTRAQ技術(shù)具有更高的靈敏度、檢測通量和重現(xiàn)性,能保證氧化還原多肽鑒定與定量分析的準確性.

3 基于同位素親和標簽(ICAT)標記的技術(shù)

基于ICAT標記的技術(shù)應(yīng)用ICAT試劑與還原后新形成的自由巰基反應(yīng),可直接實現(xiàn)對蛋白質(zhì)可逆修飾Cys的定量分析.ICAT試劑由反應(yīng)基團、連接子和生物素親和標簽三部分組成.反應(yīng)基團可特異結(jié)合肽鏈中Cys的自由巰基,而生物素親和標簽在ICAT標記多肽的分離純化過程中起作用.因連接子中的氫/氘原子存在質(zhì)量差異,ICAT試劑用“輕標”(連接子含有8個氫原子)和“重標”(連接子含有8個氘原子)加以區(qū)分,兩者的質(zhì)量相差8 u.標記蛋白質(zhì)酶切后的多肽可經(jīng)生物素-親和素柱子進行富集和純化,進而通過質(zhì)譜鑒定分析[11].與iTRAQ試劑相比,ICAT試劑通過特異結(jié)合肽鏈中Cys的自由巰基實現(xiàn)定量,因此可直接被用于對氧化還原蛋白質(zhì)的分析.此外,ICAT試劑自身具有生物素結(jié)合位點,可直接利用親和素富集低豐度蛋白,有利于鑒定更多的可逆氧化修飾蛋白質(zhì).然而,ICAT試劑只含有兩種標簽,實驗通量相對較低.此外,ICAT試劑分子量相對較大(約500 u),與蛋白質(zhì)連接后可能會造成分子的空間位阻,在質(zhì)譜分析時標簽仍保留在肽段上,導(dǎo)致肽段在碰撞誘導(dǎo)解吸附時,容易被片段化,造成質(zhì)譜圖復(fù)雜程度增加,尤其不利于低分子量多肽的分析.

4 基于巰基特異性串聯(lián)質(zhì)量標簽(CysTMT/iodoTMT)標記的技術(shù)

基于CysTMT/iodoTMT標記的技術(shù)應(yīng)用CysTMT或iodoTMT試劑與還原后新形成的自由巰基反應(yīng),直接實現(xiàn)蛋白質(zhì)可逆氧化修飾Cys的標記.串聯(lián)質(zhì)量標簽(TMT)技術(shù)是由美國Thermo Scientific公司研發(fā)的一種多肽體外標記技術(shù).TMT試劑由報告基團、平衡基團和反應(yīng)基團三部分組成.TMT試劑的反應(yīng)基團能與肽段氨基末端及賴氨酸側(cè)鏈氨基共價連接,從而標記肽段.而在TMT試劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的CysTMT和iodoTMT試劑只能與蛋白質(zhì)中Cys的自由巰基結(jié)合,從而只標記含有Cys的多肽.CysTMT和iodoTMT試劑都包括6種質(zhì)量報告基團,其分子量分別為126,127,128,129,130,131 u.CysTMT試劑的反應(yīng)基團與Cys自由巰基的結(jié)合是可逆的,而iodoTMT試劑的反應(yīng)基團與Cys自由巰基的結(jié)合是不可逆的.因此,與CysTMT試劑相比,iodoTMT試劑標記氧化修飾Cys的效率更高.經(jīng)CysTMT或iodoTMT試劑標記的蛋白質(zhì)被酶解為多肽后,標記的多肽可以通過anti-TMT抗體被富集和純化,進而可通過質(zhì)譜分析被鑒定[12].

CysTMT和iodoTMT試劑都可直接與Cys自由巰基結(jié)合,因此可直接用于對氧化還原蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.該技術(shù)利用anti-TMT抗體實現(xiàn)含有Cys肽段的富集,從而實現(xiàn)了對低豐度氧化還原修飾蛋白的鑒定.然而,盡管這兩種試劑可以直接對蛋白質(zhì)Cys的氧化還原水平進行定量分析,但是無法同時定量蛋白質(zhì)豐度,導(dǎo)致無法準確判斷蛋白質(zhì)氧化還原水平的變化.

5 基于iodoTMT與iTRAQ聯(lián)用(iodoTMTRAQ)的標記技術(shù)

為了解決同時定量蛋白質(zhì)豐度與Cys氧化還原水平的問題,美國佛羅里達大學(xué)陳思學(xué)實驗室發(fā)明了iodoTMTRAQ技術(shù).該技術(shù)利用iodoTMT試劑標記Cys,同時利用iTRAQ試劑標記多肽氨基末端,實現(xiàn)同時檢測Cys氧化還原水平和蛋白質(zhì)表達豐度的變化[13-14],這是該技術(shù)獨特的優(yōu)勢.然而,該技術(shù)仍然無法克服MS2串聯(lián)質(zhì)量標簽分析帶來的因前體離子干擾造成的標簽豐度比率壓縮問題.

6 結(jié)論與展望

近年來不斷發(fā)展的氧化還原蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究植物中蛋白質(zhì)氧化還原穩(wěn)態(tài)提供了更加完善的技術(shù)平臺.在2DE凝膠分離技術(shù)的基礎(chǔ)上,發(fā)展了非凝膠蛋白質(zhì)分離技術(shù)(如納升高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)),提高了蛋白質(zhì)分離與鑒定的通量和重現(xiàn)性.同時,對蛋白質(zhì)Cys的標記技術(shù)由最初的熒光試劑標記發(fā)展為同位素標簽標記,提高了標記的靈敏度,實現(xiàn)了對Cys的精確定量.尤其是iodoTMTRAQ技術(shù)的出現(xiàn),實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)豐度與Cys氧化還原水平的同時定量分析.這些技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于植物發(fā)育與響應(yīng)環(huán)境過程中蛋白質(zhì)氧化還原修飾變化的分析[5-12,14].然而,上述技術(shù)雖然能同時標記與定量分析可逆氧化修飾的Cys(S-S、-SSG或-SOH),但是無法區(qū)分Cys的具體氧化形式.進一步開發(fā)能夠標記和定量分析不同Cys氧化形式的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),將有利于深入研究蛋白質(zhì)氧化還原修飾參與調(diào)控的植物發(fā)育與環(huán)境應(yīng)答機制.