翟學萍,　尤慧艷(1. 大連大學環(huán)境與化學工程學院, 遼寧 大連 116622; 2. 中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003)

拉曼光譜成像技術具有靈敏度高、多元信號識別能力強等優(yōu)勢,近年來在分子檢測、疾病診斷等領域受到了廣泛關注[1]。研發(fā)拉曼信號強、光學性質(zhì)穩(wěn)定的表面增強拉曼散射(SERS)探針是實現(xiàn)拉曼成像的前提和基礎。傳統(tǒng)的SERS探針主要由金(Au)、銀(Ag)等貴金屬納米粒子和其表面結(jié)合的拉曼報告分子兩部分組成。貴金屬納米粒子為拉曼信號增強基底,報告分子則賦予SERS探針特征散射譜峰,二者的光學性質(zhì)對SERS探針的信號強度具有決定性影響[2,3]。

內(nèi)標化SERS探針是最近發(fā)展起來的一類新型納米光學探針[4,5],其報告分子鑲嵌于SERS探針結(jié)構內(nèi)部[6,7],有別于傳統(tǒng)SERS探針中報告分子吸附于貴金屬納米基底外層的結(jié)構。內(nèi)標化SERS探針一般以金納米球(AuNPs)或金納米棒(AuNRs)為核心,在其表面修飾報告分子,進一步在復合物表面生長Au或Ag殼層,形成AuNP@Au[8-10]、AuNR@Ag[11-13]等核殼納米結(jié)構。該設計不僅能顯著提高信號強度,也可以提高探針在生物基質(zhì)中的穩(wěn)定性,避免報告分子解離和內(nèi)源物質(zhì)干擾所造成的信號變化[14]。此外,殼層貴金屬的外表面裸露,可進一步吸附待測分子生成SERS信號,實現(xiàn)后續(xù)免標記傳感[15-17]。

內(nèi)標化探針的殼層種類對探針的性質(zhì)具有重要影響?；贏u殼的內(nèi)標化SERS探針生物相容性好[18],但其殼層厚度不易精確控制,靈敏度也較低;基于Ag殼的內(nèi)標化探針雖然生物相容性較差,但其合成方法簡單,殼層厚度可以精確調(diào)控[19]。而且Ag的拉曼增強能力優(yōu)于Au,其信號靈敏度較Au殼包裹的探針高數(shù)十倍,在活體深層次檢測中展示了更大的優(yōu)勢[20]。因此,基于銀納米材料探針的研發(fā)仍然是近年來的熱點方向,值得注意的是,銀層包覆內(nèi)標化SERS探針一般在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)體系中合成,形成的探針表面會吸附CTAB，其細胞毒性較大[21],導致探針難以直接用于生物標記。此外,Ag殼層的化學性質(zhì)較Au更為活潑,其氧化和溶解現(xiàn)象容易引起SERS探針的結(jié)構和信號變化[22-24]。

為了克服Ag殼內(nèi)標化SERS探針的上述缺陷,發(fā)揮其高靈敏度的成像優(yōu)勢,本研究在合成以4-硝基苯硫酚(NT)為報告分子的Au@NT@Ag內(nèi)標化SERS探針的基礎上,進一步以牛血清白蛋白(BSA)置換探針表面的CTAB,發(fā)展了Au@NT@Ag@BSA內(nèi)標化SERS探針。實驗發(fā)現(xiàn),Au@NT@Ag@BSA探針既保留了原探針的單分散性和高靈敏度,又顯著提高了探針的信號穩(wěn)定性和生物相容性。進一步將Au@NT@Ag@BSA探針和SMMC7721肺癌細胞共孵育,實現(xiàn)了細胞的探針標記和激光共聚焦顯微拉曼光譜成像。研究表明,Au@NT@Ag@BSA內(nèi)標化SERS探針在活體生物成像等方面展示了良好的應用潛力。

1　實驗部分

1.1　儀器與試劑

s-4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司), RFS 100DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀、FT/IR-4100傅里葉變換紅外光譜儀、2000/2000C紫外-可見分光光度計、FORMA STERI-CYCLE培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司), Nano-ZS90馬爾文電位-粒度分析儀(英國Malvern公司), InfiniteM200全功能酶標儀(帝肯上海貿(mào)易有限公司), H1650-W臺式微量高速離心機(湘儀儀器有限公司), KQ-250TDB超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司)。

氯金酸(HAuCl453H2O)、硝酸銀(AgNO3)、硼氫化鈉(NaBH4)、氫氧化鈉(NaOH)和抗壞血酸(AA)均購自國藥集團化學試劑有限公司,CTAB、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)、NT、檸檬酸鈉、二甲亞砜(DMSO)和氮藍四唑鹽(MTT)均購自阿拉丁試劑有限公司,BSA購自北京索萊寶科技有限公司,SMMC7721肺癌細胞購自中科院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司,胎牛血清(滅活)購自美國Gibco公司,胰酶消化液、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自賽爾斯(中國)生物科技有限公司。

實驗所用玻璃儀器均用新配制的王水HCl-HNO3(3∶1, v/v)清洗;實驗所用的水均為二次純化后的超純水(18.2 MΩ5cm)。

1.2　AuNPs的制備

根據(jù)文獻報道[25]采用種子生長法合成16 nm AuNPs。

種子的合成：將5 mL HAuCl4(0.5 mmol/L)和5 mL CTAB(200 mmol/L)混合攪拌均勻,向其中加入600 μL冰水配制的NaBH4溶液(10 mmol/L),攪拌,待溶液顏色由亮黃色變?yōu)樽厣笸Ｖ箶嚢?靜置3 h。

金納米球的合成:向2 mL CTAC(200 mmol/L)與1.5 mL AA(100 mmol/L)的混合溶液中加入20 μL種子,再加入2 mL HAuCl4溶液(0.5 mmol/L),于27 ℃攪拌15 min,得到16 nm AuNPs。

1.3　內(nèi)標化Au@NT@Ag SERS探針的制備

取1 mL 16 nm AuNPs離心水洗2次(13 000 r/min, 15 min),棄去上清液,重新分散在1 mL去離子水中。向上述溶液中加入50 μL 1 mmol/L NT溶液,使NT報告分子的終濃度為0.05 mmol/L,超聲15 min。然后取1 mL所得溶液加入200 μL CTAB溶液(200 mmol/L),以13 000 r/min離心15 min,棄去上清液,并用1 mL CTAB溶液(200 mmol/L)重新分散。所得溶液以13 000 r/min離心15 min,采用CTAB溶液(200 mmol/L)分散,重復此操作3次,最后分散在1 mL去離子水中,既得NT結(jié)合的金納米球(Au@NT)。

進一步在Au@NT粒子表面包覆銀層,借鑒文獻[26]方法,分次加入不同體積的生長液。取1 mL Au@NT溶液,加入1 mL CTAB溶液(200 mmol/L),攪拌均勻,依次加入30 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),然后用NaOH溶液(100 mmol/L)將反應體系的pH值調(diào)節(jié)至10,反應5 min，得到Au@NT@50Ag SERS探針。

另取一份Au@NT溶液采用上述相同的方法制得Au@NT@50Ag后,繼續(xù)向其中依次加入20 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),再用NaOH溶液調(diào)節(jié)反應體系的pH值至10,攪拌5 min后得到Au@NT@100Ag SERS探針。重復此操作,直至AgNO3溶液加入的體積達到300、500、700和1 000 μL,得到Au@NT@300Ag、Au@NT@500Ag、Au@NT@700Ag和Au@NT@1000Ag SERS探針。

1.4　外標化Au@Ag@NT探針的制備

取1 mL 16 nm AuNPs離心水洗2次(13 000 r/min, 15 min),棄去上清液,重新分散于1 mL去離子水中,向其中加入1mL CTAB(200 mmol/L)溶液,攪拌均勻,依次加入30 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L),然后用NaOH溶液(100 mmol/L)將反應體系的pH值調(diào)節(jié)至10,反應5 min，得到Au@50Ag納米粒子。按照1.3節(jié)方法繼續(xù)生長Ag層,得到Au@300Ag納米粒子。離心水洗之后分散于950 μL去離子水中,加入50 μL 1 mmol/L的NT溶液,使NT報告分子的終濃度為0.05 mmol/L,超聲15 min,然后加入200 μL CTAB(200 mmol/L)溶液,離心,棄去上清液,加入1 mL去離子水分散,備用。

1.5　Au@NT@Ag@BSA探針的制備

稱取0.5 g BSA,溶于50 mL去離子水中,使BSA的終濃度為0.147 mmol/L,加入0.01 g檸檬酸鈉,用NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值至7,備用。另外稱取0.05 g BSA,溶于50 mL去離子水中,使BSA的終濃度為0.014 7 mmol/L,加入0.01 g檸檬酸鈉,用NaOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值至12,備用。

取1.3節(jié)制備的Au@NT@700Ag SRES探針溶液1 mL,離心(5 800 r/min, 8 min),棄去上清液,分散于1 mL pH 7的去離子水中,將所得溶液逐滴加入3 mL pH 7的BSA溶液中,攪拌均勻,超聲30 min,然后離心(5 800 r/min, 8 min),分散于1 mL pH 12的BSA溶液中,靜置2 h,最后離心(5 800 r/min, 8 min),用pH 12的去離子水洗一次,分散于去離子水中并濃縮至500 mg/L。Au@NT@Ag@BSA SERS探針的合成過程見圖1。

1.6　MTT比色法測SERS探針的細胞毒性

培養(yǎng)肺癌SMMC7721細胞至對數(shù)期,胰蛋白酶將其消化制成單細胞懸浮液,顯微鏡下計數(shù),接種于96孔板,調(diào)節(jié)細胞含量為7×103個/孔,每孔加入200 μL細胞培養(yǎng)基,置于含5%(體積分數(shù))CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi),于37 ℃下培養(yǎng)24 h,使其貼壁。

培養(yǎng)24 h后,觀察細胞生長狀態(tài)。設置調(diào)零組、空白對照組和加樣組,調(diào)零組不添加任何試劑,空白組加入20 μL滅菌水,加樣組分別加入20 μL系列質(zhì)量濃度(5、10、100和300 mg/L)的兩種SERS探針(Au@NT@Ag與Au@NT@Ag@BSA)溶液,每個質(zhì)量濃度設5個復孔,置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi),于37 ℃培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,棄去上清液,每孔加入200 μL DMSO,置于搖床上振搖10 min,直至結(jié)晶完全溶解,用酶標儀測定570 nm處的吸光度A570, 5個復孔取平均值。細胞存活率=A實驗組/A對照組×100%。

1.7　細胞成像

培養(yǎng)SMMC7721細胞至對數(shù)期,胰蛋白酶消化制成單細胞懸液,稀釋后于顯微鏡下觀察計數(shù),于24孔板中調(diào)節(jié)細胞含量為1.2×104個/孔,每孔加入500 μL細胞培養(yǎng)基,于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)12 h后,前12個孔分別加入100 μL Au@NT@Ag探針,后12個孔分別加入100 μL Au@NT@Ag@BSA SERS探針,使二者的質(zhì)量濃度均為50 mg/L,共培養(yǎng)3 h后,用PBS清洗細胞兩遍,置于玻璃片上密封,在拉曼顯微鏡下觀察細胞形態(tài),記錄細胞不同區(qū)域的拉曼信號。

2　結(jié)果與討論

2.1　Au@NT@Ag SERS探針的表征

對Au@NT@Ag SERS探針進行了理化性質(zhì)和光學性質(zhì)表征。采用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡測定,得到的結(jié)果顯示,AuNPs的粒徑約為16 nm,且分布均勻(見圖2a)。Au@NT@Ag的冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示,Au@NT@Ag近球形,且結(jié)構均勻,粒徑大小約為60 nm(見圖2b)。馬爾文電位-粒度儀測試SERS探針結(jié)果顯示,探針的水合粒徑約為79 nm,平均Zeta電位為28.9 mV,表明探針表面吸附了陽離子表面活性劑CTAB。

采用紫外-可見分光光度計和激光共聚焦顯微拉曼光譜儀對Ag層的生長過程進行監(jiān)測。結(jié)果顯示,隨著AgNO3加入體積的增加,銀層逐漸變厚,內(nèi)標化SERS探針的紫外吸收峰顯示了先藍移后紅移的過程,紫外吸收峰強度從0.18增加到1.17(見圖3a)。圖3b為加入不同AgNO3體積后制備的探針的激光共聚焦顯微拉曼光譜圖,可以看出報告分子NT在1 568、1 328和1 078 cm-1等處有特征峰。當AgNO3的加入體積從50 μL增加到700 μL時,SERS探針的拉曼信號逐漸增強,并在700 μL時達到最大。這是由于相較于Au納米粒子,Ag層包裹后具有更好的拉曼增強效應[27]。當AgNO3的加入體積進一步增加到1 000 μL時拉曼信號出現(xiàn)降低趨勢,可能是因為形成的Ag層過厚,對激發(fā)光的遮擋效應大于報告分子信號的增強效應,因此拉曼信號出現(xiàn)降低趨勢[28]。因此選擇Au@NT@700Ag作為SERS探針進行下一步研究。

圖 3　AuNPs和加入不同體積AgNO3制備的Au@NT@Ag內(nèi)標化SERS探針的(a)紫外吸收光譜圖和(b)拉曼光譜圖　Fig. 3　(a) UV absorption spectra and (b) Raman spectra of AuNPs and Au@NT@Ag tags by adding different volumes of AgNO3 solution Au@NT@50Ag, Au@NT@100Ag, Au@NT@300Ag, Au@NT@500Ag, Au@NT@700Ag and Au@NT@1000Ag were tags by adding 50, 100, 300, 500, 700 and 1000 μL of AgNO3 solution (10 mmol/L), respectively.

實驗比較了內(nèi)標化Au@NT@Ag和外標化Au@Ag@NT兩種探針的信號強度。以AgNO3加入體積300 μL為例,外標化Au@Ag@NT探針在1 328 cm-1特征峰處信號強度約為220,內(nèi)標化Au@NT@Ag探針的信號強度約為1 100,較前者顯著提高。內(nèi)標化探針的高靈敏度性質(zhì)為后續(xù)成像應用奠定了基礎。

2.2　Au@NT@Ag@BSA的表征

BSA生物相容性良好,并且分子結(jié)構中有二硫鍵和豐富的氨基、羧基等活性基團作為多價配體,具有比單價配體CTAB更強的金屬結(jié)合力[29-32],因此嘗試用其置換內(nèi)標化Au@NT@Ag SERS探針表面的CTAB。首先將探針離心,用pH 7去離子水分散,使粒子表面CTAB濃度降至臨界膠束濃度以下。然后采用pH 7和pH 12的BSA溶液各進行一次置換后,再用pH 12的去離子水清洗并濃縮至原濃度。

第一次置換過程中選擇高濃度BSA是十分必要的,整個過程中高BSA-CTAB濃度比率有利于平衡向著BSA包覆納米粒子的方向轉(zhuǎn)移[33]。實驗中將濃度為0.147 mmol/L的BSA與探針溶液按體積比1∶1和2∶1混合,探針會發(fā)生不同程度的團聚,探針粒子Zeta電位依然表現(xiàn)為CTAB的正電荷(35.5 mV和11.4 mV)。將二者體積比提高至3∶1,混合體系中粒子分散性良好,Zeta電位下降至BSA的負電位(-25.7 mV),表明粒子表面CTAB被BSA大量置換。第二次置換過程將BSA溶液的pH調(diào)節(jié)至12,主要原因是BSA等電點為4.8,在pH 12時呈現(xiàn)明顯負電荷(約-35 mV)[30],有利于提高置換后粒子的單分散性。此外,游離態(tài)BSA易與帶正電的CTAB通過靜電結(jié)合作用形成復合物,便于在后續(xù)離心過程中將CTAB去除。

通過多種手段對置換過程進行驗證。冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示,BSA均勻包覆于Au@NT@Ag SERS探針表面且未造成納米粒子團聚(見圖4a)。水合粒徑及電位分布測定結(jié)果顯示,BSA置換使探針粒子的水合粒徑由79 nm增大到88 nm,電位由28.9 mV轉(zhuǎn)變?yōu)?25.7 mV。傅里葉變換紅外光譜表明,BSA包覆的Au@NT@Ag粒子出現(xiàn)了1 450、1 392和1 245 cm-1等BSA的紅外特征吸收峰(見圖4b)。以上結(jié)果均表明BSA被成功包覆于內(nèi)標化Au@NT@Ag SERS探針表面。

圖 4　(a)Au@NT@Ag@BSA探針的掃描電子顯微鏡圖和(b)BSA、Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探針的紅外光譜圖　Fig. 4　(a) SEM image of Au@NT@Ag@BSA tags and (b) FT-IR spectra of BSA, Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags

圖 5　Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探針的(a)紫外吸收光譜圖及實物圖和(b)拉曼光譜圖Fig. 5　(a) UV absorption spectra, photographs and (b) SERS spectra of Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags

進一步對BSA包覆的內(nèi)標化SERS探針進行光譜性質(zhì)表征。圖5a顯示,BSA包覆前后二者的紫外-可見吸收光譜的峰強度沒有發(fā)生明顯變化,包覆BSA探針的紫外峰形略微變寬且紅移,這可能是由于納米粒子界面折射系數(shù)發(fā)生了改變[34,35]。激光共聚焦顯微拉曼光譜測定結(jié)果顯示,BSA包覆過程未對探針的拉曼光譜強度及特征峰位造成明顯改變(見圖5b)。

2.3　SERS探針的穩(wěn)定性和細胞毒性考察

圖 6　Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探針30 d內(nèi)的拉曼信號強度(n=3)Fig. 6　Raman intensity for the Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA tags within 30 d (n=3)

CTAB體系是Au@NT@Ag粒子中Ag層生長的必要條件,Au@NT@Ag粒子生成后表面包覆CTAB雙層結(jié)構。在近中性條件下,Ag+/Ag、AgBr/Ag和O2/H2O的條件氧化還原電勢分別為0.80、0.13和0.82 V,理論上講,Br-的存在會促進溶解氧將銀納米粒子氧化溶解并最終形成AgBr。而BSA修飾的體系中,氧氣和銀層的接觸概率較低,氧的條件氧化還原電位可能會低于0.80 V(Ag+/Ag)。溶解氧很難將銀單質(zhì)氧化溶解。為了驗證這一假設采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀監(jiān)測了Au@NT@Ag@BSA SERS探針30 d內(nèi)1 328 cm-1處特征峰的信號強度,并以CTAB穩(wěn)定的樣品作對照。如圖6所示,CTAB穩(wěn)定的Au@NT@Ag探針拉曼信號持續(xù)下降,直至難以測出。由于BSA對Ag層的穩(wěn)定和保護作用,Au@NT@Ag@BSA探針在30 d內(nèi)顯示了良好的穩(wěn)定性。

圖 7　與不同質(zhì)量濃度的Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA探針共培養(yǎng)24 h后SMMC7721細胞的存活率(n=5)　Fig. 7　Cell viability of SMMC7721 cells co-incubated with different mass concentrations of Au@NT@Ag and Au@NT@Ag@BSA SERS tags for 24 h (n=5)

進一步考察置換前后探針的細胞毒性。如圖7所示,CTAB穩(wěn)定的SERS探針Au@NT@Ag具有明顯的毒性,細胞存活率隨探針質(zhì)量濃度的增加而迅速下降,在Au@NT@Ag探針的質(zhì)量濃度為300 mg/L時細胞存活率已低于20%。BSA包覆后的SERS探針的細胞毒性明顯降低,當Au@NT@Ag@BSA探針的質(zhì)量濃度增加到300 mg/L時,細胞存活率仍維持在75%以上。上述結(jié)果表明,BSA置換可以有效消除Au@NT@Ag探針的急性毒性效應,但Ag殼的慢性毒性由于銀離子緩釋等原因難以避免。MTT比色法實驗結(jié)果顯示,在滿足成像的Au@NT@Ag@BSA探針使用劑量下(50 mg/L),細胞保持了80%以上的存活率,結(jié)果令人滿意。一定程度上解決了以往Au@Ag內(nèi)標化SERS探針生物相容性差這一瓶頸問題,為后續(xù)活細胞成像應用提供了前提。

2.4　細胞拉曼成像結(jié)果

分別將Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA SERS探針與SMMC7721細胞共培養(yǎng)3 h,采用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀50倍顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)及SERS探針分布情況,檢測SERS探針的拉曼信號強度。觀察結(jié)果表明,3 h后納米粒子經(jīng)吞噬作用進入細胞,如圖8a顯示,與Au@NT@Ag@BSA探針共同孵育的細胞狀態(tài)良好,細胞內(nèi)能夠清晰地觀察到大量的納米粒子分布。比較而言,由于CTAB的細胞毒性效應,與Au@NT@Ag探針共培養(yǎng)后,細胞數(shù)目明顯下降,且細胞內(nèi)部探針顆粒較少(見圖8b),表明該探針標記細胞的能力較弱。以上結(jié)果初步驗證了Au@NT@Ag@BSA探針在成像分析中的適用性。

本研究通過反射光斑的大小,粗略估計細胞不同位置處粒子的數(shù)目差別,進一步將其和該處的拉曼信號強度進行比較,通過拉曼強度驗證粒子分布的可行性和準確性。因此,進一步測定了單個細胞中不同位點的拉曼信號強度。如圖9a所示,Au@NT@Ag@BSA SERS探針信號集中在細胞質(zhì)區(qū)域,與明場照片(見圖9a內(nèi)插圖)中顆粒出現(xiàn)部位呈現(xiàn)明顯的對應;Au@NT@Ag探針在細胞中也顯示相同的結(jié)果,但整體拉曼強度降低近一個數(shù)量級(見圖9b)。與細胞共培養(yǎng)后采用激光共聚焦顯微拉曼儀對3個細胞進行成像結(jié)果顯示,Au@NT@Ag@BSA探針的攝取沒有影響細胞的形貌和生長狀態(tài)(見圖9c),通過基于1 328 cm-1特征信號強度的拉曼成像圖(見圖9d)可知,BSA包覆的探針對細胞具有良好的整體成像效果。

3　結(jié)論

本研究設計合成了BSA包覆的內(nèi)標化SERS探針Au@NT@Ag@BSA,該探針具有良好的信號穩(wěn)定性和生物相容性。研究借助激光共聚焦顯微拉曼光譜儀的采集和成像功能,實現(xiàn)了探針對SMMC7721肺癌細胞的定位和標記。研究結(jié)果表明,內(nèi)標化Au@NT@Ag@BSA SERS探針在活體生物成像等方面展示了良好的應用潛力。

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