陳泓序,　屈　鋒(北京理工大學生命學院, 北京 100081)

隨著單克隆抗體技術近40年的發(fā)展,其在生物醫(yī)學研究和生物制藥以及臨床治療中的應用發(fā)展迅速,已占有重要地位。單克隆抗體藥物是通過基因工程生產的蛋白質藥物,具有特異性高、作用機制明確、效果顯著、經濟效益大等優(yōu)勢,成為近年來生物醫(yī)藥產業(yè)的重要增長點。2017年全球銷量排名前十位的處方藥中有5個為單克隆抗體藥物,艾伯維公司的阿達木單抗(Humira)更是連續(xù)6年蟬聯(lián)全球最暢銷藥第一名。因歐美發(fā)達國家具有技術和投資優(yōu)勢,目前它們已壟斷了大多數(shù)上市的單克隆抗體藥物的生產。2020年,全球排名前6的單抗藥物的專利均將到期[1],因此,目前國內外藥企都掀起了生物類似藥的研發(fā)熱潮,以搶占單克隆抗體藥物的巨大市場。為確保單抗產品的安全有效、質量可控,各國的藥監(jiān)部門都在不斷地完善和提升生物類似藥的質量控制要求[2]。我國《國家藥品安全“十二五”規(guī)劃》中也明確了藥物一致性評價的質量要求,即仿制藥品要與原研藥質量和療效一致。與小分子藥物不同,抗體類藥物不僅分子質量大,結構復雜,而且可經糖基化或其他翻譯后修飾,導致其結構具有高度不均一性(異質性)。傳統(tǒng)藥物分析方法已無法滿足對其純度分析、等電點測定及電荷異質性分析和N-寡糖分析等需求。對單克隆抗體類藥物的表征分析和質量控制提出了新的要求和挑戰(zhàn)[3]。

毛細管電泳技術(capillary electrophoresis, CE)特別適合蛋白質等極性分子的分析,它具有分離效率高、模式多、分析速度快等優(yōu)勢。近年來已發(fā)展成為單克隆抗體藥物多項表征中不可或缺的技術[4,5]。與傳統(tǒng)分離技術如HPLC技術相比,CE在單抗藥物的多項分析中有著獨特的優(yōu)勢(見表1)。在CE的多種分離模式中,依靠相對分子質量大小分離的毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis, CGE)、依靠等電點分離的毛細管等電聚焦(capillary isoelectric focusing, CIEF)和依靠電荷/質量比分離的毛細管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE)是單抗藥分析中常見的3種模式。CGE用于還原和非還原單抗藥物的純度分析和N-寡糖分析,CIEF用于等電點及電荷異質性分析,CZE用于快速電荷異質性分析(見表2)。這些CE技術已經被全球大部分生物制藥公司作為常規(guī)方法用于單克隆抗體藥物的質量控制、藥品生產質量管理規(guī)范(good manufacturing practice, GMP)條件下的產品放行和穩(wěn)定性研究、配方開發(fā)中的過程表征和過程驗證等環(huán)節(jié)。CE用于單克隆抗體藥物的分析已被歐洲藥典、美國藥典等多國法規(guī)機構所認可。《中國藥典》(2015版)三部單抗藥物總論中也收錄了毛細管電泳方法。本文綜述了單克隆抗體藥物質控和生產中的純度分析、等電點及電荷異質性分析和N-寡糖分析的方法及應用進展。

表 1　CE與HPLC技術在單克隆抗體藥物分析中的比較Table 1　Comparison of CE and HPLC for therapeutic monoclonal antibody (mAb) analysis

表 2　單克隆抗體藥物分析中的CE方法Table 2　CE methods for therapeutic mAb analysis

*PDA: photo-diode array; UV: ultraviolet-visible; LIF: laser-induced fluorescence.

1　單克隆抗體藥物的純度分析

傳統(tǒng)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PACE)可對10～220 kDa范圍內的變性蛋白質單體、聚合體及片段進行分離,是基于相對分子質量大小分離蛋白質的常規(guī)技術。在SDS-PAGE方法中,SDS與蛋白質分子具有特定的結合比(1.4 g SDS/1 g蛋白質)。蛋白質分子與SDS結合后變性而形成不同相對分子質量的帶負電荷的SDS-蛋白質復合物,它們在電泳條件下沿電場的反方向泳動。因不同相對分子質量的SDS-蛋白質復合物在凝膠篩分介質中的纏繞和作用力不同而遷移速度不同,其遷移時間與相對分子質量的對數(shù)值成正比,進而可以估算蛋白質藥物的相對分子質量。此外SDS-PAGE還用于表征蛋白質藥物的一致性和純度。常用的SDS-PAGE方法采用考馬斯亮藍染色法和銀染法來檢測蛋白質復合物。其中考馬斯亮藍法的檢出限約為1 μg/mL,銀染法靈敏度更高,檢出限可達10 ng/mL。雖然SDS-PAGE是蛋白質分離中的常規(guī)技術,在實驗室廣泛使用,但其方法需要制膠、染色、脫色等繁瑣的人工操作,且具有耗時長,重復性差,只能進行半定量等局限性。

1987年,Karger等[6]報道了使用交聯(lián)聚丙烯酰胺作為篩分介質的毛細管凝膠電泳,將傳統(tǒng)的平板凝膠轉移到毛細管中進行。由于在毛細管中填入固態(tài)凝膠容易造成堵塞和氣泡等問題。因此,1996年,Guttman等[7]開發(fā)了以線性聚合物取代交聯(lián)聚丙烯酰胺的無膠篩分毛細管電泳。目前單抗分析中的毛細管凝膠電泳也早已不再使用交聯(lián)的凝膠。由于樣品蛋白質需要與SDS結合形成復合物,這種模式也被稱為十二烷基硫酸鈉無膠篩分毛細管電泳(CE-SDS-NGS),簡稱CE-SDS。CE-SDS方法的出現(xiàn),解決了傳統(tǒng)SDS-PAGE面臨的問題,它具有明顯的優(yōu)勢:(1)快速:30 min之內完成沖洗和分離過程;(2)自動化程度高:無需制膠、染色、脫色等人工操作,所有的沖洗、進樣、分離及檢測過程全部自動化完成;(3)分辨率高:商品化毛細管電泳儀可精確、有效控溫,使分離電壓可達30 kV,相比于最高幾百伏電壓的SDS-PAGE方法,分析速度加快,分辨率也有了極大的提高;(4)定量準確度高:根據(jù)待測蛋白質自身的紫外吸收或標記試劑的熒光信號強度實現(xiàn)準確定量,可避免SDS-PAGE檢測中染料和蛋白質嵌合程度不同引起的差異;(5)在線檢測:在毛細管出口端的窗口處進行光學檢測,提高了方法的準確度。(6)重復性好:全自動的操作提高了分離的重復性。

CE-SDS方法相對傳統(tǒng)SDS-PAGE的巨大優(yōu)勢使其成為生物制藥行業(yè)中蛋白質藥物純度(大小異質性)分析的最優(yōu)方法,逐漸被越來越多的國際知名制藥企業(yè)所采用,也得到包括中國在內的多國藥典的普遍認可[8]。目前大部分生物制藥公司廣泛采用貝克曼庫爾特公司的商品化試劑盒進行CE-SDS分析。Lin等[9]對CE-SDS和SDS-PAGE進行單抗藥物純度分析的結果進行了比較,CE-SDS不僅在耐用性、精密性、線性、重復性和分辨率等方面均遠遠優(yōu)于SDS-PAGE法,更重要的是它可以實現(xiàn)還原抗體的重鏈與非糖基化重鏈(non-glycosylated heavy chain, NGHC)的分離和準確定量(見圖1)。因抗體藥物的非糖基化重鏈直接影響藥物的生物學功能,如抗體依賴的細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)、半衰期、體內外穩(wěn)定性等,因此非糖基化重鏈信息是抗體藥物質控的關鍵指標,而CE-SDS方法是目前唯一能將抗體的非糖基化重鏈與重鏈分離、并能對非糖基化重鏈準確定量分析的技術,通過它能獲得SDS-PAGE無法得到的抗體關鍵信息。

圖 1　還原抗體藥物的CE-SDS分析電泳圖[9] Fig. 1　Electropherogram of mAb by reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate (CE-SDS)[9] Peak identifications: 1. internal standard (IS); 2. light chain (LC); 3. non-glycosylated heavy chain (NGHC); 4. heavy chain (HC).

圖 2　(a)不同培養(yǎng)基下還原抗體及(b)不同克隆中非還原抗體的CE-SDS分析電泳圖[11]Fig. 2　Electropherograms of (a) reduced CE-SDS for products from different cell culture and (b) non-reduced CE-SDS for products from different clone[11] The lowest trace in (a) was PNGase F-treated mAb produced in cell culture C.

強生公司的Zhang等[10]利用CE-SDS對單抗藥表征的方法進行了系統(tǒng)的優(yōu)化和方法驗證,包括對還原和非還原抗體所用的分離條件及樣品處理條件。還原抗體CE-SDS中,可采用巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)作為還原劑將單抗藥的二硫鍵斷裂,形成重鏈和輕鏈;在非還原抗體CE-SDS中,添加碘乙酰胺(IAM)或碘乙酸(IAA)封閉活性位點來減小蛋白質碎片的生成。默克公司的Rustandi等[11]報道了CE-SDS技術在單抗藥物生產的各個環(huán)節(jié)中的廣泛應用。它不僅可進行包括NGHC在內的產品相關雜質的定量分析,還可用于細胞培養(yǎng)和克隆篩選環(huán)節(jié)中對NGHC、抗體碎片和聚集體進行監(jiān)控,來進行培養(yǎng)基的優(yōu)化和克隆篩選(見圖2)。圖2a展示了用CE-SDS方法分析還原抗體來進行培養(yǎng)基優(yōu)化的結果。相比于培養(yǎng)基A,培養(yǎng)基B產生的抗體中所含非糖基化重鏈含量更少,因此B被選為最佳的培養(yǎng)基。C培養(yǎng)基中產生了額外的峰(HC+2 kD),將C培養(yǎng)基中的樣品經過肽-N-糖苷酶F(PNGase F)處理后的電泳圖(最下面的電泳圖)顯示,HC+2 kD中含有額外的N-糖基。因非還原抗體中二硫鍵并未斷裂,不應出現(xiàn)碎片峰,故分析結果常用來判斷樣品中的碎片雜質。例如,重鏈二聚體(P100,約100 kD)是克隆篩選中關注的重要雜質,而在體積排阻色譜(size-exclusion chromatography, SEC)中,P100和完整的抗體(P150,約150 kD)無法實現(xiàn)較好的分離。采用CE-SDS則可以對它們進行高效的分離。圖2b展示了用CE-SDS方法分析非還原抗體來進行克隆篩選的結果?？寺?因為產生最少的P100而被選中進行后續(xù)的開發(fā)。此實驗中,采用有效毛細管長度10 cm的快速分離模式,加快了分離速度,適合高通量的克隆篩選。另外,在產品穩(wěn)定性研究中,同樣可利用CE-SDS法分析不同條件下碎片雜質的生成情況,進而評估單抗藥的穩(wěn)定性。Li等[12]利用CE-SDS法對單抗藥在不同存儲條件下碎片的變化做了準確定量。在40 ℃下放置28天后,兩個碎片峰的總含量由1.1%增加至4.6%。雜質片段的鑒定是結合SEC-HPLC和RPLC-MS方法進行的。經鑒定,該碎片為重鏈決定簇互補區(qū)(CDR)上Ser-Ser鍵斷裂的產物。此外,王文波等[13]還使用還原和非還原抗體的CE-SDS法進行埃博拉復方抗體(包含3種單抗)的純度分析。李萌等[14]使用CE-SDS方法對抗體偶聯(lián)藥物(antibody-drug conjugates, ADC)進行大小異質性分析。

目前CE-SDS用于單抗藥的純度分析主要采用兩種檢測手段,紫外檢測(包含UV和PDA)和激光誘導熒光檢測(laser-induced fluorescence, LIF)[15]。與紫外檢測器相比,激光誘導熒光檢測器靈敏度高,在抗體藥物純度分析中,可以檢測到痕量的蛋白質雜質。而且,因激光誘導熒光檢測法可以消除背景膠中紫外吸收引起的基線波動,使得分析方法的基線更加平整,便于減小不同操作者的積分誤差,提高自動積分的準確性。基因泰克公司的Hunt等[16]最早報道了使用CE-SDS-LIF檢測的方法。他們以5-羧基四甲基羅丹明作為染料對單克隆抗體藥物進行標記,方法檢出限可達9 ng/mL,與SDS-PAGE的銀染法檢測靈敏度相當。他們又進一步對該CE-SDS-LIF方法中的樣品緩沖液pH值、染料和蛋白質樣品的比例、反應溫度等條件進行了考察和優(yōu)化,提出在蛋白質樣品與SDS預處理的過程中加入烷基化試劑,用于抑制非還原蛋白質在分離過程中蛋白質片段的形成。通過考查特異性、準確性、回收率、線性范圍、檢出限、精密性及重復性,對方法進行了詳細的驗證,進而將CE-SDS-LIF方法確定為基因泰克公司單抗藥物質量控制的放行標準[17]。之后,Michels等[18]用3-(2-呋喃)-2-甲?；?3-(2-furoyl)-quinoline-2-carboxaldehyde, FQ)染料標記蛋白質,使用CE-SDS-LIF方法進行單抗藥物的純度分析;染料FQ在氰基的作用下與蛋白質發(fā)生偶聯(lián)反應,偶聯(lián)之前FQ不具有熒光,而與蛋白質反應后才可發(fā)出熒光信號。因此標記過程中無需純化除去過量的熒光染料,大大簡化了蛋白質標記的過程。采用此法對單抗藥的雜質定量分析,檢出限達到10 ng/mL,可以檢測到0.02%的雜質蛋白質[19]。

為保證CE-SDS方法的穩(wěn)定和可靠,以安進公司為代表的抗體聯(lián)盟,對CE-SDS方法進行了更深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)如果凝膠產生氣泡,則會引起電流中斷等現(xiàn)象。為了解決這些問題,提高CE-SDS方法的重復性,他們提出了采用反吸法移取凝膠溶液和電泳過程中在毛細管兩端同時施加相同的壓力的方法[20],他們研究的這些技巧使CE-SDS方法更加穩(wěn)定,為其在生物制藥行業(yè)的廣泛應用奠定了重要基礎。為了評估CE-SDS方法作為單抗藥物質控標準的可行性,惠氏、安進、禮來、基因泰克、輝瑞等13家歐美制藥企業(yè)[21]對CE-SDS方法測定蛋白質相對分子質量和抗體純度分析進行了聯(lián)合驗證實驗。所有參加實驗室均使用貝克曼庫爾特公司的PA800儀器和CE-SDS試劑盒,多個不同實驗室的不同的操作者,采用同樣的分析方法對同一IgG標準品進行分析。統(tǒng)計結果顯示,還原IgG樣品的3個主要峰,重鏈、輕鏈和非糖基化重鏈的遷移時間RSD均小于2%,峰面積RSD均小于9%,說明該方法可滿足藥物質控的標準要求,可以作為抗體藥物的質控方法。

為了提高CE-SDS方法的分析通量,Guttman等[22]還嘗試使用多通道毛細管進行抗體藥物純度分析。其他基于毛細管電泳技術而進一步微型化的芯片電泳也已經出現(xiàn)[23-25]。芯片電泳具有速度更快,通量更高的特點和優(yōu)勢,可被用于抗體藥物生產過程中的克隆篩選、細胞培養(yǎng)以及下游純化過程的優(yōu)化等環(huán)節(jié)。然而,由于芯片電泳的分辨率和重現(xiàn)性相比于常規(guī)CE-SDS方法還有一定的差距,目前還僅限于過程監(jiān)控,而在單抗產品的質控時仍然需要采用CE-SDS的方法。

2　單克隆抗體藥物的等電點及電荷異質性分析

抗體的電荷異質性主要來源于氨基酸的修飾和變化,如去酰胺化產生羧基形成了抗體的酸性變異體;相反,天冬氨酸-甘氨酸容易形成琥珀酰胺而成為抗體的堿性變異體;其他修飾如谷氨酸環(huán)化形成焦谷氨酸、糖基的唾液酸化、C端賴氨酸的異質性、二硫鍵的氧化等都會影響抗體的電荷異質性及等電點。等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)電泳可以根據(jù)等電點的不同分離這些蛋白質變異體,給出蛋白質電荷異質性分布的信息。IEF方法原理復雜,技術難度高,現(xiàn)有的IEF方法也具有與SDS-PAGE相似的局限性,如自動化程度低,重復性差,分辨率有限,線性范圍窄,無法準確定量。離子交換色譜(ion exchange chromatography, IEC)是另一種蛋白質變異體分離的技術,它具有可直接收集組分,與MS結合可進行結構鑒定的優(yōu)勢。然而IEC方法的分辨率有限,無法保證各個變異體的高效分離。毛細管電泳技術具有分離效率高、模式多、適合蛋白質等極性物質分析的優(yōu)勢。目前,在生物制藥領域,主要有3種基于毛細管電泳的技術用于單抗藥物的等電點及電荷異質性分析,即毛細管等電聚焦法(CIEF)、全柱成像毛細管等電聚焦法(image-CIEF, iCIEF)和毛細管區(qū)帶電泳法(CZE)。

2.1　毛細管等電聚焦法

CIEF是在毛細管中進行的基于等電點差異分離蛋白質及其變異體的方法。為防止蛋白質吸附和產生電滲流影響聚焦,CIEF實驗需要使用中性涂層毛細管。具體過程為:將樣品和兩性電解質混合進樣,毛細管兩端分別放置在酸性和堿性溶液中。在電壓作用下,兩性電解質在毛細管內形成pH梯度,當樣品遷移到其等電點位置時停止遷移,由此產生非常窄的樣品聚集區(qū)帶。因不同等電點的蛋白質將聚集在不同的位置,故形成各個組分獨立的蛋白質區(qū)帶而彼此分離。經過上述進樣、聚焦后,再采用壓力遷移或化學遷移使各組分移動到檢測窗口,完成在線檢測。CIEF方法具有分辨率高、自動化、樣品和試劑消耗少、可準確定量等優(yōu)勢,是單抗以及其他蛋白質藥物電荷異質性分析和等電點測定的理想方法[26-29]。

1992年,羅氏制藥公司的Costello等[30]首次報道了采用CIEF技術對抗體藥物的表征。CIEF技術解決了IEF中預制聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠在pH 7～10范圍內不穩(wěn)定的問題,可對抗體藥物發(fā)生脫酰胺或脫糖基后產生的變異體進行準確的定量和pI測定。他們因此提出CIEF方法將會成為抗體藥物表征和穩(wěn)定性研究的標準方法。此后,基因泰克等公司及科研機構陸續(xù)發(fā)表了CIEF方法用于抗體藥物分析的研究工作[31-35]。Lin等[34]實現(xiàn)了對抗體藥物酸性和堿性變異體的分離及C端賴氨酸變異體和糖譜的分析。Cao等[35]對曲妥珠單抗的類似藥進行電荷異質性、穩(wěn)定性和批次一致性分析。雅培公司的Bonn等[36]通過使用再生沖洗液和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)涂層毛細管等優(yōu)化的條件,使CIEF方法能夠連續(xù)運行100針以上,并保持高度的重復性。Mack等[37]對CIEF方法的實驗參數(shù)進行了進一步優(yōu)化:如將窗口狹縫由8變成2,遷移方式由壓力遷移轉為化學遷移來提高分辨能力;在兩性電解質溶液中加入尿素來增加蛋白質的溶解性;提高入口和出口緩沖瓶中磷酸和氫氧化鈉的濃度和添加陽極穩(wěn)定劑(pI <3)、陰極穩(wěn)定劑(pI>10)來防止極端pI樣品的損失。經過優(yōu)化的CIEF方法可以在4

圖 3　單克隆抗體的典型CIEF電泳圖[37] Fig. 3　Typical electropherogram of mAb by CIEF[37]

2011年,美國和瑞士的10家生物制藥公司的12個實驗室[38]開展了對CIEF方法的國際聯(lián)合驗證。所有參加的實驗室均使用貝克曼庫爾特公司的PA800儀器、CIEF啟動試劑盒和兩個不同批次的兩性電解質。各實驗室對同一單抗樣品進行分析,考察6個變異體的pI值以及含量百分比。在不同實驗室、不同操作者、不同批次的兩性電解質的條件下,分析結果獲得高度的重復性。6個變異體pI值的RSD均小于0.5%,峰面積百分比的RSD均小于4.4%。且不同批次的兩性電解質分析得到的峰面積百分比結果高度一致。驗證結果支持使用CIEF方法作為生物藥質控的標準方法。2013年,美國藥典收錄CIEF方法作為曲妥珠單抗和利妥昔單抗電荷異質性分析的方法[39]。CIEF技術不僅可分析單抗,對ADC藥物進行高分辨的電荷異質性分析也已有報道[40]。

2.2　全柱成像毛細管等電聚焦法

iCIEF是分離、聚焦完成后,直接采集蛋白質峰位移圖像的實時檢測方法。該方法無需將蛋白質組分遷移至檢測窗口,且可使用短毛細管(5 cm有效長度),因此分析速度大大加快。

Zhang等[41]用iCIEF方法對來自美國、歐洲和印度市場上的利妥西單抗原研藥及類似藥進行分析對比,相比于美國和歐洲的原研藥,來源于印度市場的類似藥中,Fc/2(可結晶片段)的堿性變異體增多,輕鏈和Fd(Fab中抗原結合區(qū)的部分重鏈片段)的酸性變異體峰有缺失?；谏鲜鼋Y果分析得出,Fc/2中增加的堿性變異體為未切除的賴氨酸殘基,而輕鏈和Fd中缺失的酸性峰為去酰胺化程度低造成的?；蛱┛斯镜腒aschak等[42]采用iCIEF法對單抗藥堿性變異體進行分析,證明了培養(yǎng)基中銅離子與C端脯氨酸酰胺化引起的堿性變異體變化存在相關性。于傳飛等[43]使用iCIEF方法對單克隆抗體進行電荷異質性分析,配合恰當?shù)拿盖刑幚?可判斷單克隆抗體產品主要電荷異質性的來源。該方法為保證單克隆抗體藥物生產工藝的穩(wěn)定性及產品的質量控制提供了有效手段。近期,Goyon等[44]以美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)批準的23種單克隆抗體藥物(等電點在6.1～9.4范圍)作為研究對象,比較了iCIEF和陽離子交換色譜(cation-exchange chromatography, CEX)方法。結果顯示iCIEF方法分析結果中酸性變異體的含量均明顯高于CEX方法的分析結果。這是首次將色譜和毛細管電泳兩種技術同時應用于多種單抗的電荷異質性分析。

同時參與了CIEF方法聯(lián)合驗證的相同的12個實驗室也組織開展了對iCIEF方法的國際聯(lián)合驗證[45]。結果表明不同變異體的pI值的RSD均小于0.8%,峰面積百分比均小于11%。雖然iCIEF方法的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)比CIEF方法略差,但仍然可以滿足生物制藥分析的要求,可作為CIEF方法的補充,用于單抗藥物的過程分析和質量控制。

2.3　毛細管區(qū)帶電泳法

毛細管區(qū)帶電泳是最簡單、最常用的毛細管電泳模式。它使用自由溶液,根據(jù)分析物電荷/質量(荷質比)的差異進行分離。在單克隆抗體的電荷異質性分析中,由于抗體的變異體大多來源于氨基酸的修飾和變化,各個變異體間質量的差別不大,差異主要體現(xiàn)在表面電荷的不同,因此CZE分離模式的結果與基于等電點分離的等電聚焦模式具有相似性,但其較CIEF方法更簡單、方便。CZE方法用于抗體藥物電荷異質性分析的另一個優(yōu)勢在于它最容易實現(xiàn)與質譜檢測器的連接。CZE與MS聯(lián)用,可以依靠質譜對CE分離的各個電荷變異體進行結構分析,為變異體的鑒定提供重要的信息。自2010年起,CZE方法在生物制藥行業(yè)備受關注,輝瑞、羅氏等眾多制藥公司均采用CZE方法進行抗體藥物的快速電荷異質性分析。

圖 4　CZE和iCIEF方法分離5種單克隆抗體的電泳圖比較[46]Fig. 4　Comparison of electropherograms of five mAbs by CZE and iCIEF[46]A: acidic peak; M: main peak; B: basic peak; H: histidine in sample matrix.

輝瑞公司的He等[46,47]使用熔融石英毛細管,對CZE單抗藥電荷異質性分析的電泳條件進行了考察,指出緩沖液的種類和pH是變異體分離的關鍵因素。他們選擇pH 4.5～6.0的范圍進行優(yōu)化,以兩性電解質ε-氨基己酸(ε-aminocaproic acid, EACA)作為緩沖液,可以降低抗體在毛細管壁的吸附。通過添加三乙烯四胺(triethylenetetramine, TETA)和羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methyl cellulose, HPMC)作為動態(tài)涂層,可進一步降低管壁的吸附,改善分離效率和重現(xiàn)性。在400 mmol/L EACA、0.05% HPMC和適當?shù)膒H條件下,使用40 μm內徑、10 cm有效長度的毛細管,對多種抗體藥物均可在3～5 min內實現(xiàn)快速電荷異質性分析,圖4為CZE和iCIEF方法分析5種單抗藥物的比較。CZE方法的分離效率與iCIEF方法相當(CZE與iCIEF的峰鏡像對應),而分離的時間比iCIEF方法還要快一倍[46]。樣品緩沖液的選擇也會對分離結果產生影響,在IgG2的分離中,向樣品緩沖液中加入尿素,由于尿素打開了二硫鍵異構體的折疊,IgG2主峰出現(xiàn)分叉,二硫鍵異構體得以分離[47]。目前報道的針對各種單抗藥物的CZE電荷異質性分析方法中,大多基于He等報道的上述方法,采用pH 4.5～6.0范圍的EACA作為緩沖液這一基本條件。不同方法間的差別主要來自動態(tài)涂層試劑和添加劑(如TETA、HPMC及吐溫等)的選擇和濃度的不同。由于緩沖液EACA的紫外吸收低,允許使用214 nm波長檢測,相比使用280 nm檢測的CIEF和iCIEF方法,靈敏度有所提高。

Ed Garza等[48]基于He的上述工作建立了CZE方法平臺,選擇不同的緩沖體系對多種抗體藥物及其類似藥進行分析,并將此CZE平臺方法用于抗體藥物批放行及產品研發(fā)中。他們使用中性涂層毛細管,降低了抗體在毛細管壁的吸附。使用醋酸調節(jié)pH值、醋酸鋰平衡緩沖容量,增加電導率和離子強度、改善分離。最終確定利妥西單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、雷珠單抗(ranibizumab)及其類似藥分離的最佳緩沖條件為200 mmol/L EACA/HAc, 30 mmol/L LiAc, pH 4.8, 0.05% HPMC;貝伐單抗(bevacizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)及其類似藥分離的最佳緩沖條件為100 mmol/L EACA/HAc, 20 mmol/L LiAc, pH 5.5, 0.05% HPMC。方法穩(wěn)定性好,在優(yōu)化的條件下,一根中性涂層毛細管可以提供120～150次穩(wěn)定的分析結果。然而,如需獲得各變異體的結構信息以評價其生物相似性,仍需要采用其他技術的輔助。

Lin實驗室[49]報道了另外一種CZE緩沖液體系,20 mmol/L NaAc, 2 mmol/L TETA, pH 6.0, 0.3% PEO,該方法對IgG堿性變異體的分離優(yōu)于He的方法,可以分離出兩個堿性變異體。他還指出CZE方法除了可區(qū)分堿性端賴氨酸變異體,還可以快速分離Fab和Fc、完整抗體及相關物質。在其他相似的研究工作中,除了使用熔融石英毛細管和中性涂層毛細管,也有使用陽離子涂層毛細管進行抗體藥物的CZE電荷異質性研究的報道[50,51]。另外,由于CZE方法具有簡單快速、分辨率高的優(yōu)勢,故CZE方法也被用于抗體藥物的鑒別。郭瑋等[52]利用CZE方法對尼妥珠單抗進行了專屬性鑒別分析,證明該方法對于尼妥珠以及其他8種單克隆抗體的特異性鑒別有效。目前,尚無CZE電荷異質性分析的商品化試劑盒,我們對已報道的CZE方法的主要分離條件進行了總結(見表3)。

表 3　CZE電荷異質性分析的分離條件Table 3　CZE conditions for mAb charge variant analysis

與CIEF和iCIEF方法的多企業(yè)聯(lián)合驗證目的相似,為了評估CZE在生物制藥行業(yè)應用的可行性,羅氏制藥的Moritz等[53]組織來自美國、瑞士、德國的11家實驗室開展了CZE方法的聯(lián)合驗證。所有參加實驗室均使用貝克曼庫爾特公司的PA800 Plus或Enhanced儀器。他們先采用同一CZE條件對pH 7.4～9.5的23種單抗進行分析,結果表明該方法對多種單抗藥物具有普適性,結果見圖5。他們還對50 cm×50 μm和40 cm×30 μm兩種長度/內徑毛細管的分離條件進行了比較。結果顯示較長的毛細管對雜質分離的分辨率比短毛細管略好,而短毛細管則可以提供更好的穩(wěn)定性、更快的速度(3.5～7.5 min)和高通量分析的能力。在聯(lián)合驗證實驗中,選用了樣品中酸性最強(pI最小)、分離時間最長的單抗作為樣品。如圖6所示,將CZE方法的分析結果與iCIEF和IEC方法進行了對比,3種方法主峰區(qū)的CPA%(校準峰面積百分比)結果相似,分別為61.5%(11.1+28.6+21.8=61.5)、61.6%和64.7%。但CZE方法的分辨率最高,主峰區(qū)可分離出3個峰(CZE與iCIEF/IEC方法的峰鏡像對應)。特別指出的是,所有參加驗證的操作人員在此次驗證前均未接受額外的培訓,但卻獲得了非常好的重復性結果,RSD為1%左右。該驗證結果充分證明了CZE方法作為一種抗體藥物電荷異質性分析平臺方法的可行性。

圖 5　同一CZE方法對23種單抗藥物的電荷異質性分析[53]Fig. 5　Charge variant analysis of 23 mAbs by the same CZE condition[53]

圖 6　CZE、iCIEF和IEC方法分析同一單抗的電荷異質性[53]Fig. 6　Charge variant analysis of the same mAb by CZE, iCIEF and IEC[53]

盡管上述聯(lián)合驗證證實了CZE方法簡單可靠,然而使用同一個分離條件很難保證對所有的抗體藥物都達到最佳的分離效果。因此,Moritz等[54]又繼續(xù)展開了針對大量實驗參數(shù)的優(yōu)化研究,他們依據(jù)DoE(Design of Experiment)原則優(yōu)化參數(shù),選用分辨率、峰寬、峰個數(shù)等多項標準評判參數(shù)優(yōu)化的結果,提高了13種抗體及相關重組蛋白質的CZE分離效果。經過大量的研究得出結論,在CZE對抗體及其相關形式藥物(如雙特異性抗體和其他融合蛋白質)的電荷異質性分析中,TETA的濃度、pH值、聚合物添加劑(HPMC或羥丙基纖維素(HPC))和其他添加劑(乙腈或丁醇胺)這幾個參數(shù)為需要優(yōu)化的關鍵參數(shù)。帶正電荷的TETA與毛細管壁的負電荷相互作用,通過降低電滲流及分析物在管壁的吸附來提高分辨率。pH值通過影響電荷/質量比而直接影響分析物的遷移速度,對分離結果影響極大。HPMC的黏度大于HPC,會延長分離時間。作為溶劑的乙腈,當其含量適量時,可通過降低分析物之間的疏水相互作用而提高分離度;而當乙腈含量過高時,會使溶液的電導率和組分的溶解性改變而降低分離度。帶電添加劑(如丁醇胺)則通過降低電滲流、分析物與管壁的相互作用(改變分析物的電荷/質量)提高分離度。Moritz等的工作為不同樣品的CZE方法優(yōu)化提供了重要指導,也使得CZE電荷異質性分析方法的應用范圍由抗體藥物拓展到其他抗體相關的重組蛋白質。

3　單克隆抗體藥物的N-寡糖分析

單克隆抗體的重鏈Fc端在Asn297位置有一個糖基化位點,細胞培養(yǎng)過程中,會產生多種寡糖變異體。由于寡糖對藥代動力學、生物活性、穩(wěn)定性和免疫原型具有重要影響,法規(guī)機構將抗體中的寡糖視為關鍵質量屬性(critical quality attribute, CQA)。如核心巖藻糖缺失和雙分支N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)的存在會增加ADCC活性,降低唾液酸含量也會引起ADCC活性增加。雙天線糖鏈的末端半乳糖殘基會影響補體依賴的細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity, CDC)等?？贵w藥物中寡糖的異質性來源于表達體系、克隆、培養(yǎng)基、溫度和時間等生長條件。因此,在生產過程和批放行中對寡糖進行定量和監(jiān)控非常重要。單克隆抗體中寡糖譜圖分析的主要策略有:(1)對還原或非還原完整抗體自上而下的表征;(2)糖肽水平的表征;(3)對酶解釋放的寡糖鏈的表征。但是由于其他氨基酸修飾、氧化等異質性的干擾,寡糖異質性分析多采用把寡糖鏈酶解下來分析的方法?？捎糜诠烟欠治龅姆椒ㄓ蠳MR、MS、HPLC和CE,其中比較常用的是高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)[55,56]、HPLC-熒光檢測法[57-59]和毛細管電泳-激光誘導熒光檢測法(CE-LIF)[60-65]。這些方法均可以提供高分辨和高靈敏的分析。離子交換色譜方法的優(yōu)點在于無需衍生化,但其在特異性、定量和多功能性方面有一定局限。HPLC和CE技術則均需要對酶解釋放的寡糖進行衍生化。CE可以對寡糖的位置異構體和連接異構體進行高效分離,且在分析速度上比HPLC更具有優(yōu)勢[66]。生物制藥工業(yè)中對于產品質量屬性的評估通常會采取互相補充的多種技術,來避免單一技術檢測帶來的風險。

圖 7　APTS與寡糖的反應Fig. 7　Reaction between 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid, trisodium salt (APTS) and oligosaccharide

CE方法糖基分析的標記試劑需要滿足以下兩個條件:1.帶有一個或多個電荷,使得不易帶電的寡糖分子帶上電荷,有利于CE的分離;2.具有熒光發(fā)色基團,使標記后的寡糖可以在指定激發(fā)波長下具有熒光信號,提供高靈敏度的檢測?？捎糜贑E方法的熒光標記試劑有8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(APTS)、8-氨基萘磺酸-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(ANTS)和2-氨基苯甲酸(2-AA)等。2-AA所帶負電荷少、出峰時間慢,可以分離低豐度的唾液酸化和高甘露糖化的寡糖[67]。但因沒有對應波長的商品化激光器而使其應用受限。采用APTS標記糖時分離速度快、理論塔板數(shù)高,具有商品化的激光誘導熒光光源和檢測器(488 nm激發(fā)/520 nm發(fā)射),故APTS是單克隆抗體藥物寡糖分析最常用的標記試劑。APTS結構中的芘結構提供了熒光響應,3個磺酸基陰離子提高了CE分離的效率和速度,氨基與寡糖鏈末端的縮醛基在還原劑的作用下反應完成標記。標記反應過程見圖7。由于每個寡糖鏈只有末端的一個縮醛基,可以保證每個寡糖上只標記一個APTS,因此可根據(jù)熒光信號對寡糖進行定量分析,APTS標記的寡糖分析靈敏度可達0.4 nmol/L[62]。

1999年,基因泰克公司的Nashabeh和Ma[68]采用PNGase F酶酶解釋放寡糖鏈,再使用APTS標記后,對幾種主要的N-寡糖G0、G1、G1′和G2(結構見圖8)進行了CE-LIF分離檢測,以驗證CE-LIF方法作為利妥昔單抗藥常規(guī)放行檢測的可行性。結果表明,CE-LIF方法不僅可以實現(xiàn)不同鏈長的寡糖的分離,還可以分離G1和G1′兩種糖的位置異構體。其中位置異構體的鑒定是通過β-N-乙酰氨基己糖苷酶和α-1-2,3甘露糖苷酶逐級酶解進行驗證的。

圖 9　糖蛋白測試品中的N-寡糖經APTS標記后的CE-LIF分析電泳圖[70]Fig. 9　CE-LIF analysis trace of the APTS-labeled N-glycan profile of the protein test article[70]

繼貝克曼庫爾特公司推出基于APTS標記的CE-LIF糖分析試劑盒后,大部分生物制藥公司均采用商品化試劑盒進行抗體藥物中寡糖的檢測[69]。2013年,安進公司[70]組織了來自美國、歐洲和中國的20個生物制藥企業(yè)、大學及國家法規(guī)實驗室開展了抗體藥物中寡糖分析的多實驗室聯(lián)合驗證。所有參加實驗室均使用貝克曼庫爾特公司的PA800 Plus儀器和糖分析試劑盒。結果表明該方法的重現(xiàn)性好,顯示了在生物制藥工業(yè)的克隆篩選、過程開發(fā)和批放行中建立寡糖分析平臺的可行性。聯(lián)合驗證采用了預標記的同源寡糖梯度標準品、預標記的高甘露糖化的寡糖混合物、非巖藻糖化的寡糖混合物、巖藻糖化的寡糖混合物、預標記的寡糖測試品和糖蛋白測試品6個樣品?？疾炝嗽诓煌瑢嶒炇摇x器、操作者和日期下,方法的重復性和重現(xiàn)性。經過酶切和標記等前處理后,糖蛋白測試品中N-寡糖的CE分離結果見圖9。根據(jù)計算的糖單位(glucose unit, GU)值使用N-寡糖數(shù)據(jù)庫進行峰的指認。對豐度大于0.1%的20個糖型峰的重復性(實驗室內)和重現(xiàn)性(實驗室間)進行計算,其平均面積重復性為0.95%、重現(xiàn)性為4.60%。平均遷移時間重復性為0.06%,重現(xiàn)性為2.24%。結果表明,CE-LIF方法可以提供高通量和高靈敏度的寡糖鑒定和相對定量。但方法的不足是會有共洗脫的糖型,比如FA2和A2(6)G1同時出峰。

為解決部分寡糖共洗脫的問題,Guttman等[71]考察了毛細管溫度對各種寡糖分離的影響,發(fā)現(xiàn)對于不同寡糖,獲得最佳分離度所需的溫度可能不相同。因此為了增加CE-LIF方法寡糖分離的選擇性,他們建立了梯度升溫的分離方法。以生物制藥中很受關注的巖藻糖化寡糖、非巖藻糖化寡糖和高甘露糖化寡糖的混合物為樣品,進行了溫度梯度由15 ℃到45 ℃條件下的分離。結果顯示,通過溫度變化可以實現(xiàn)幾對共洗脫的寡糖的分離(如FA2和A2(6)G1,A2G2和FA2(3)G1)(見圖10)。

圖 10　梯度升溫CE方法對APTS標記的生物藥寡糖的分離[71]Fig. 10　Separation of APTS labeled glycans of bio-therapeutics interest by temperature gradient capillary electrophoresis[71]

2011年,瑞士藥監(jiān)局[72]使用CE-LIF方法對瑞士市場上的16種單克隆抗體藥物中的寡糖進行監(jiān)管檢測。結果顯示,同一廠家的藥物的批次一致性很好,說明廠家都對產品進行了嚴格的質控,但是不同廠家的藥物的寡糖差別較大,這些差別主要來源于細胞培養(yǎng)條件的影響。因此,在培養(yǎng)基的優(yōu)化、克隆篩選等生產過程中對寡糖的檢測越來越受到重視,這也意味著對高通量快速寡糖分析方法的需求日益增加。為此,Guttman等[73]發(fā)明了利用磁珠對糖分析樣品進行前處理的方法。使用磁珠進行酶切和標記,免除了所有前處理過程中的離心以及真空離心的操作,節(jié)省了大量的時間。文中以單克隆抗體等3種糖蛋白為模型,證明了該快速方法與傳統(tǒng)前處理方法在寡糖釋放和標記效率上具有相似的效率。方法具有高度的重復性,并且非常容易實現(xiàn)自動化分析。隨后Guttman等[74]在另一篇文章中報道了在自動化工作站中進行96個樣品的全自動前處理和CE分離的工作,并優(yōu)化了CE分離的條件,使分離時間進一步縮短至3 min?；贕uttman的上述工作,2017年Sciex公司(原貝克曼庫爾特公司)推出了快速糖分析試劑盒,該試劑盒采用磁珠輔助的前處理流程和快速分離的緩沖體系。酶切、標記和清洗等所有前處理過程所需的時間縮短至1 h(前處理流程見圖11),采用經過優(yōu)化的緩沖體系,使CE分離的時間縮短至5 min以內。

圖 11　磁珠輔助法進行N-寡糖分析的樣品前處理流程圖[73]Fig. 11　Full magnetic bead based sample preparation workflow for N-glycosylation analysis[73]

此外,基于毛細管電泳原理進行寡糖分離的芯片電泳也被用于抗體藥物的克隆篩選中,可提供快速(約1 min)和高通量的寡糖分析。但其樣品前處理仍需要3～4 h,且芯片技術的分辨率和重復性仍然低于常規(guī)毛細管電泳技術。

在CE-LIF方法中,通常根據(jù)熒光檢測得到的電泳峰的校準峰面積對各種寡糖的相對含量進行定量分析。若需對糖型進行鑒定,則需要借助其他手段,如(1)使用寡糖標準品鑒定;(2)根據(jù)寡糖梯度標準品計算待測寡糖的GU值來鑒定;(3)使用外切酶逐級酶解寡糖進行鑒定[68]; (4)使用制備型HPLC收集,再將收集得到的組分經MS鑒定后,作為CE的標準品進行鑒定[75]; (5)CE-MS聯(lián)用技術直接對CE分離得到的寡糖進行質譜鑒定[76]。其中計算GU值的鑒定方法最為簡單快速。最近,Guttman課題組[77]設計了基于3種內標糖計算GU值的方法。選用麥芽2糖、麥芽3糖和麥芽15糖3種糖作為內標物與被分析樣品混合后同時進樣,根據(jù)3個內標糖的遷移時間建立虛擬的寡糖梯度,用于計算待測寡糖的GU值。特別值得指出的是,這樣一套基于3個內標的GU值計算方法并不受毛細管長度、分離電壓以及進樣量等實驗條件變化的影響,避免使用寡糖梯度標準品單獨進樣,也節(jié)省了分析時間。在Sciex公司的快速糖分析試劑盒中,使用了該快速GU值鑒定的方法。

4　總結與展望

在單克隆抗體藥物的分析和質控中,毛細管電泳技術已經成為不可或缺的必要手段。利用毛細管凝膠電泳進行純度(或大小異質性)分析和N-寡糖分析,利用毛細管等電聚焦/全柱成像毛細管等電聚焦/毛細管區(qū)帶電泳進行等電點及電荷異質性分析,這些方法已經廣泛用于單克隆抗體的產品質控、過程開發(fā)及批放行中。隨著越來越多種類的蛋白質藥物的出現(xiàn),相關分析的技術開發(fā)熱點將集中在以下幾個方面:(1)快速、高通量分析技術的開發(fā),以滿足大量樣品的檢測和克隆篩選等生產環(huán)節(jié)的需求。(2)建立針對其他蛋白質藥物(抗體片段、雙特異性抗體、抗體聚合體、抗體偶聯(lián)藥物及其他融合蛋白質)的分析方法。例如開發(fā)適合相對分子質量更小的或更大的蛋白質藥物分析的凝膠緩沖液、適合高糖基化蛋白質藥物分析的凝膠緩沖液、適合極度酸性蛋白質和高度修飾蛋白質分析的CIEF方法等。(3)CE-SDS/CIEF/CZE與MS技術離線或在線聯(lián)用方法的開發(fā),以解決經電泳分離得到的雜質、電荷變異體和寡糖的鑒定問題。其中CE-MS聯(lián)用技術對單抗藥物的肽譜序列、翻譯后修飾、糖肽和完整蛋白質電荷異質性等多水平表征的應用已有報道,我們將另外對這部分進展進行綜述。

致謝感謝麗珠醫(yī)藥的鄧欽培博士在文章撰寫過程中的建議和指導。

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