王　婷,　姚二民,　鄧　楠,　邊陽(yáng)陽(yáng),　劉萍萍,　張　柯,　陳千思,　李　斌(. 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院, 河南 鄭州 45000; . 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心, 河南 鄭州 45005; . 鄭州輕工業(yè)學(xué)院, 河南 鄭州 45000)

4-甲基亞硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)是煙草制品中一類非常重要的化合物。它是尼古丁亞硝基化或微量煙堿亞硝基化形成的一種煙氣致癌物[1-4],主要通過(guò)生物降解和動(dòng)物體內(nèi)的DNA及血紅蛋白發(fā)生鍵合,產(chǎn)生致癌性[5]。在細(xì)胞色素P450酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶調(diào)控下的體內(nèi)代謝產(chǎn)物4-甲基亞硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇(NNAL)及其糖苷化衍生物(NNAL-Glucs)是研究NNK在人體內(nèi)代謝過(guò)程中致毒與解毒機(jī)制的非常有價(jià)值的接觸生物標(biāo)志物[6]。游離態(tài)NNAL及NNAL-Glucs的含量總和與游離態(tài)NNAL含量的比值可用于評(píng)估與NNK有關(guān)的癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[7]。對(duì)人體體液內(nèi)NNK代謝物的研究主要包括對(duì)游離NNAL、NNAL的O-糖苷化合物(NNAL-O-Gluc)及N-糖苷化合物(NNAL-N-Gluc)的分析與研究[7-10]。

目前,NNAL-O-Gluc的前處理方法主要是通過(guò)水解法去糖基化,從而得到游離的NNAL。該過(guò)程可以通過(guò)酶水解方式進(jìn)行,其中通過(guò)β-葡萄糖醛酸酶水解的方式應(yīng)用較多。但傳統(tǒng)的酶水解反應(yīng)具有耗時(shí)較長(zhǎng)(16-24 h)、水解效率較低等缺點(diǎn)[11],嚴(yán)重制約煙氣體內(nèi)代謝物的高通量分析。針對(duì)上述缺點(diǎn),固定化酶反應(yīng)器應(yīng)運(yùn)而生[12-16]。在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域,袁輝明等[13]通過(guò)制備有機(jī)-硅膠雜化整體柱基質(zhì)的胰蛋白酶反應(yīng)器,將蛋白質(zhì)水解時(shí)間從常規(guī)的16 h縮短到2.5 min,為實(shí)現(xiàn)大分子的高通量分離分析提供了必要條件。宋佳一等[16]通過(guò)DNA鏈置換反應(yīng)制備了重復(fù)性好、酶切效率高的固定化胰蛋白酶反應(yīng)器。但是,到目前為止,尚未有β-葡萄糖醛酸酶固定化酶反應(yīng)器的報(bào)道。在本研究中,我們制備了基于有機(jī)-硅膠雜化整體柱基質(zhì)的β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器,并結(jié)合LC-MS/MS檢測(cè)手段用于NNAL-O-Gluc的水解與分析。旨在發(fā)展一種新型的有機(jī)-硅膠雜化整體柱基質(zhì),建立NNAL-O-Gluc快速酶解方法,為進(jìn)一步研究NNK的體內(nèi)代謝機(jī)制提供技術(shù)方案。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器、試劑與材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀和Agilent 6490三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司);超純水儀(美國(guó)Millipore公司);掃描電鏡(日本日立公司);光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司);電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);真空凍干機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司);低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。

尿素、聚乙二醇(PEG)、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、偶氮二異丁腈(AIBN)、β-葡萄糖醛酸酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;硅酸甲酯(TMOS)、丙烯酰胺(AAM)、氰基硼氫化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、乙腈、甲醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、戊二醛均購(gòu)自中國(guó)阿拉丁試劑公司;NNAL、NNAL-O-Gluc、NNAL-d3均購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals公司。

1.2　有機(jī)-硅膠雜化整體柱基質(zhì)的制備及表征

毛細(xì)管預(yù)處理:為了提高整體材料在毛細(xì)管內(nèi)壁上的聚合程度,預(yù)先使用鹽酸溶液(1 mol/L)、水、氫氧化鈉溶液(1 mol/L)和甲醇依次處理毛細(xì)管,最后使用氮?dú)鈱⒚?xì)管吹干備用。

有機(jī)-硅膠雜化整體柱基質(zhì)的制備:將5.0 mL醋酸溶液(0.01 mol/L)、800 mg尿素、540 mg PEG(Mr10 000)、1.8 mL TMOS和0.5 mLγ-MAPS加入圓底燒瓶中,渦流攪拌2 min至澄清后,在0 ℃水浴條件下磁力攪拌水解2.5 h,形成均勻透明的混合液。之后將1 mg AIBN及15 mg AAM加入0.5 mL上述混合液,經(jīng)30 min超聲脫氣并混合均勻后,將聚合液灌入預(yù)先經(jīng)酸堿處理過(guò)的毛細(xì)管中,兩端用硅膠塞封閉,置于40 ℃水浴中反應(yīng)16-20 h。結(jié)束后,利用乙腈及高純水洗去毛細(xì)管內(nèi)殘留的PEG和其他未反應(yīng)的有機(jī)物,得到AAM整體柱。使用光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡對(duì)制備的整體柱內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.3　固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器的制備

采用戊二醛交聯(lián)法將β-葡萄糖醛酸酶共價(jià)鍵合到AAM整體柱基質(zhì)上。具體制備過(guò)程如下。

(1)將體積分?jǐn)?shù)為10%的戊二醛水溶液連續(xù)通入有機(jī)-硅膠雜化整體柱1.5 h;然后采用磷酸鹽緩沖液(PBS，磷酸根離子濃度為0.05 mol/L, pH 7.0)洗去殘余的戊二醛,制得接有戊二醛的有機(jī)-硅膠雜化整體柱。

(2)在4 ℃下將含有2 500 U/mL的β-葡萄糖醛酸酶溶液(0.05 mol/L PBS,pH 7.0,含有5 mg/mL的氰基硼氫化鈉)循環(huán)通入步驟(1)制得的20 cm整體柱中24 h;用PBS將未鍵合的β-葡萄糖醛酸酶沖出,制得固定化的β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器;最后，在制備好的酶反應(yīng)器中注入Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L, pH 7.1),于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　NNAL-O-Gluc標(biāo)準(zhǔn)品的酶解及分析

采用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液制備不同質(zhì)量濃度的NNAL-O-Gluc標(biāo)準(zhǔn)溶液:100、50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05 ng/mL。在室溫條件下,以0.3 μL/min的流速將30 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液通入固定化酶反應(yīng)器進(jìn)行酶解,收集酶解產(chǎn)物,并將2 ng (100 ng/mL)的內(nèi)標(biāo)溶液加入酶解產(chǎn)物中,經(jīng)真空凍干,利用0.1%(v/v)甲酸水溶液進(jìn)行復(fù)溶,最后經(jīng)LC-MS/MS分析。

色譜柱:Waters C18 Silica柱(100 mm×3.0 mm, 300 μm),柱溫30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.3 mL/min;流動(dòng)相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液,B: 0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液。洗脫梯度如下:0～3 min, 50%B～90%B; 3～4 min, 90%B～100%B; 4～5 min, 100%B; 5.0～5.5 min, 100%B～50%B; 5.5～6.0 min, 50%B。離子源:電噴霧離子(ESI)源;掃描模式:正離子模式;監(jiān)測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧電壓:4 000 V;離子源溫度(TEM): 390 ℃。表1列出了底物、酶解產(chǎn)物及內(nèi)標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)。

表 1　底物、酶解產(chǎn)物及內(nèi)標(biāo)物的MRM參數(shù)Table 1　MRM parameters of the substrate, product and internal standard

NNAL-O-Gluc:O-glucuronides of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol; NNAL: 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol.

1.5　NNAL標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

利用0.05 mol/L PBS制備NNAL標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度分別為100、50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05 ng/mL；以及100 ng/mL的NNAL-d3標(biāo)準(zhǔn)溶液。將5 ng(100 ng/mL)NNAL-d3分別加入1 mL NNAL標(biāo)準(zhǔn)溶液中。以NNAL的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物NNAL-d3峰面積之比對(duì)目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度之比進(jìn)行線性回歸分析,得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及相關(guān)系數(shù)(R2)。

1.6　酶反應(yīng)器酶解檢出限的測(cè)定

分別取100、50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05 ng/mL的NNAL-O-Gluc標(biāo)準(zhǔn)溶液30 μL進(jìn)行水解。向不同質(zhì)量濃度的酶解產(chǎn)物中加入2 ng(100 ng/mL)內(nèi)標(biāo)NNAL-d3,按照上述1.4節(jié)方法進(jìn)行酶解與液相色譜-質(zhì)譜分析,將信噪比S/N=3時(shí)產(chǎn)物NNAL的峰面積與內(nèi)標(biāo)NNAL-d3的峰面積比值代入NNAL標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,獲得固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器的檢出限。

1.7　酶反應(yīng)器酶活性的測(cè)定

以對(duì)硝基酚-β-D-醛酸苷作為酶反應(yīng)器底物,利用紫外吸收光譜法檢測(cè)酶解產(chǎn)物對(duì)硝基酚,以測(cè)定β-葡糖糖醛酸酶反應(yīng)器的酶活性,檢測(cè)波長(zhǎng)為405 nm。

對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制:稱取1.391 1 g對(duì)硝基苯酚,用50 mmol/L的PBS定容至100 mL,獲得100 mmol/L的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,利用此溶液配制1 mmol/L對(duì)硝基苯酚溶液。采用50 mmol/L的PBS將上述溶液配制成10～500 μmol/L的對(duì)硝基酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線,空白對(duì)照樣品為50 mmol/L的PBS。

底物溶液的配制:稱取25 mg的對(duì)硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷,利用50 mmol/L的PBS定容至50 mL,其濃度為3.60 mmol/mL。

β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器酶活性的測(cè)定:首先取30 μL底物溶液,使用注射泵以0.3 μL/min的流速通入β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器,接取流穿液。其次,將30 μL 50 mmol/L的PBS以相同流速通入固定化酶反應(yīng)器中,接取流穿液作為空白。最后,使用紫外吸收光譜法測(cè)定樣品的吸光度,進(jìn)而計(jì)算對(duì)硝基酚的釋放量(μmol)。

1.8　回收率的測(cè)定

在50 mmol/L的PBS中加入NNAL-O-Gluc標(biāo)準(zhǔn)品,制備10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取30 μL,加入2 ng的NNAL-d3,采用β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器進(jìn)行酶解與液相色譜-質(zhì)譜分析。利用上述NNAL標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算同批次制備的酶反應(yīng)器酶解產(chǎn)物NNAL的濃度。根據(jù)產(chǎn)物NNAL與底物NNAL-O-Gluc的濃度比值得到酶反應(yīng)器的回收率。

2　結(jié)果與討論

2.1　有機(jī)-硅膠雜化整體柱基質(zhì)制備方法的優(yōu)化及表征

如圖1所示,“一鍋法”制備有機(jī)-硅膠雜化整體柱基質(zhì)分為兩步,首先是γ-MAPS與TMOS的縮聚反應(yīng),其次是有機(jī)功能單體AAM與預(yù)縮合硅氧烷的自由基聚合反應(yīng)。制備整體柱的過(guò)程中,反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、單體AAM和致孔劑的用量等因素會(huì)影響基質(zhì)的形貌、孔隙尺寸及通透性。

為了優(yōu)化整體柱的制備條件,設(shè)計(jì)了4個(gè)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。(1)保持尿素、TMOS及PEG的用量不變,只改變?chǔ)?MAPS的用量,以考察硅烷試劑使用比例對(duì)整體柱基質(zhì)材料通透性的影響。(2)保持尿素、TMOS及γ-MAPS的用量不變,改變致孔劑PEG的用量,以考察致孔劑對(duì)整體柱基質(zhì)材料通透性的影響。(3)保持其他條件不變,改變有機(jī)功能單體AAM的用量,以考察其對(duì)整體柱基質(zhì)材料通透性的影響。為避免TMOS和γ-MAPS在縮聚反應(yīng)過(guò)程中直接與AAM聚合,在灌入毛細(xì)管之前,將其醋酸溶液放置在冰水浴(0 ℃)中。以上優(yōu)化過(guò)程中聚合反應(yīng)溫度統(tǒng)一為40 ℃。(4)保持其他條件不變,改變自由基聚合反應(yīng)溫度,考察其對(duì)整體柱基質(zhì)材料通透性的影響。

具體實(shí)驗(yàn)條件及每種條件下毛細(xì)管整體柱的光學(xué)成像結(jié)果如表2所示。

圖 1　“一鍋法”制備有機(jī)-硅膠雜化整體柱反應(yīng)過(guò)程Fig. 1　Schematic preparation of the organic-silica hybrid monolith by “one-pot” processHAc: acetic acid; PEG: polyethylene glycol; AIBN: azobisisobutyronitrile.

表 2　制備參數(shù)對(duì)雜化整體柱形貌的影響Table 2　Effect of synthesis parameters on the morphology of hybrid monoliths

γ-MAPS: 3-(trimethoxysilyl)-propyl methacrylate; AAM: acrylamide.

硅烷試劑比例過(guò)高或過(guò)低對(duì)整體柱的滲透性均有影響[17,18]。通過(guò)控制γ-MAPS用量可調(diào)控反應(yīng)體的相分離溶膠-凝膠過(guò)程,從而改變固定相的骨架結(jié)構(gòu)。在表2的B、D、E實(shí)驗(yàn)中,TMOS與γ-MAPS的配比分別為18∶5、18∶3、18∶7(v/v)。從光學(xué)顯微鏡表征圖像中可以看出,當(dāng)γ-MAPS的用量較少時(shí),整體柱基質(zhì)呈現(xiàn)半透明狀態(tài),滲透性差(D);而γ-MAPS量較多時(shí),雖然整體柱基質(zhì)均勻,但結(jié)構(gòu)密實(shí),通透性較差(E);相比之下,當(dāng)兩種單體的體積比為18∶5時(shí)(B),整體柱基質(zhì)材料均勻,且通透性良好。

選擇適當(dāng)?shù)闹驴讋┯昧坑兄诟纳普w柱的滲透性[17]。在實(shí)驗(yàn)中控制尿素與TMOS的用量為800 mg和1.8 mL,改變PEG的用量,結(jié)果如表2中A、B和C所示。通過(guò)比較可以看出,A實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件下,整體柱基質(zhì)未完全聚合,機(jī)械強(qiáng)度較差。當(dāng)PEG用量為540 mg時(shí)(B),整體柱表現(xiàn)出更好的通透性,與A、C相比也更加均勻。

在整體柱制備反應(yīng)中,控制自由基聚合反應(yīng)溫度可調(diào)節(jié)整體柱基質(zhì)材料孔隙的大小。當(dāng)澄清透明的預(yù)聚液在較低水浴溫度下反應(yīng)16～20 h后,其整體柱基質(zhì)通透性好,但孔隙大,結(jié)構(gòu)疏松并且干燥的基質(zhì)與毛細(xì)管內(nèi)壁有輕微的脫壁現(xiàn)象(H)。聚合反應(yīng)溫度過(guò)高時(shí),整體柱基質(zhì)呈現(xiàn)半透明狀,滲透性差(I)。自由基聚合反應(yīng)水浴溫度為40 ℃時(shí),整體柱基質(zhì)材料空隙均勻,通透性良好,機(jī)械強(qiáng)度高(B)。

通過(guò)B、F和G實(shí)驗(yàn)考察了15、10和30 mg AAM對(duì)于整體柱形貌的影響。結(jié)果顯示,AAM用量較多時(shí)(G),整體柱基質(zhì)材料呈半透明狀態(tài)且通透性差;減少AAM用量,滲透性大為改善,但干燥的整體柱基質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)出現(xiàn)裂痕(F)。圖2為條件B下的掃描電鏡表征結(jié)果,可以看到,整體柱內(nèi)部孔隙均勻,與毛細(xì)管內(nèi)壁結(jié)合牢固,未出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象。該條件下的整體柱結(jié)構(gòu)最為理想,將其作為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件用于以下所有實(shí)驗(yàn)。

圖 2　有機(jī)-硅膠雜化整體柱掃描電鏡圖Fig. 2　Scanning electron microscope (SEM) images of the organic-silica hybrid monolithic column

2.2　固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器的制備及優(yōu)化

2.2.1戊二醛體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

戊二醛作為常用的交聯(lián)劑,其體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶反應(yīng)器水解效果影響較大[19]。因此對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。分別將體積分?jǐn)?shù)為1%、5%、10%、25%的戊二醛水溶液連續(xù)通過(guò)有機(jī)-硅膠雜化整體柱1.5 h,之后修飾β-葡萄糖醛酸酶,制備酶反應(yīng)器。酶反應(yīng)器水解質(zhì)譜圖如圖3所示。不同條件下,NNAL-O-Gluc均發(fā)生水解,說(shuō)明所制備的β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器均具有一定的反應(yīng)活性。但從圖4結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同戊二醛體積分?jǐn)?shù)條件下,酶解產(chǎn)物與殘留底物的峰面積比值存在明顯不同。戊二醛為10%時(shí)最高,說(shuō)明此時(shí)的酶解效果最好。這可能是由于戊二醛體積分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí),酶的鍵合量偏少,底物水解不完全;而體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí),對(duì)酶活性有一定的抑制作用,導(dǎo)致底物水解不完全。因此,戊二醛的最優(yōu)體積分?jǐn)?shù)為10%。

圖 3　不同戊二醛體積分?jǐn)?shù)條件下固定化酶反應(yīng)器水解產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig. 3　Mass spectra of the product ion generated by immobilized enzyme reactor (IMER) with different volume percentages of glutaraldehyde a. 1%; b. 5%; c. 10%; d. 25%.

圖 4　不同戊二醛體積分?jǐn)?shù)時(shí)制備的酶反應(yīng)器水解效率Fig. 4　Hydrolysis efficiency of IMER prepared with different volume of glutaraldehyde

2.2.2水解流速的選擇

水解流速不同會(huì)使水解效率產(chǎn)生差異,因此將水解流速分別設(shè)定為0.2、0.3和0.4 μL/min,考察不同流速條件對(duì)底物水解效率的影響。利用注射泵將30 μL 0.1 mg/mL的底物通入酶反應(yīng)器,收集流穿液進(jìn)行LC-MS/MS分析。通過(guò)比較各個(gè)流速下底物的酶解情況,選擇最適流速。結(jié)果如圖5所示,各個(gè)流速下固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器對(duì)底物均有一定的酶解效果,其中酶解產(chǎn)物與殘留底物的峰面積比值在0.3 μL/min時(shí)最高。這主要是由于隨著流速增大,底物在酶反應(yīng)器內(nèi)的湍流加劇,擴(kuò)散速度增加,從而有利于提高酶解效率,但是當(dāng)流速過(guò)大時(shí),底物與酶的接觸時(shí)間減小,導(dǎo)致酶切效率降低[20]。因此,將流速設(shè)定為0.3 μL/min。

圖 5　不同流速下酶反應(yīng)器的水解效果Fig. 5　Hydrolysis results of IMER under different flow rates

2.3　固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器的性能評(píng)價(jià)

2.3.1水解性能的評(píng)價(jià)

由2.2.1和2.2.2節(jié)的結(jié)果可以看到,所制備的酶反應(yīng)器在室溫條件下對(duì)NNAL-O-Gluc具有較好的酶解效果,而且整個(gè)水解與液相色譜-質(zhì)譜分析可以在2 h內(nèi)完成(而自由溶液水解需要24 h)。對(duì)比分析酶解產(chǎn)物中m/z210.1的二級(jí)質(zhì)譜圖,并與標(biāo)準(zhǔn)品NNAL的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比。如圖6所示,酶解產(chǎn)物的MS/MS譜圖中均含有NNAL特征碎片離子:m/z93.0、122.0和180.1,該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器的有效性。

圖 6　(a)酶反應(yīng)器酶解產(chǎn)物與(b)NNAL標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 6　MS/MS spectra of (a) product ions generated from IMER and (b) NNAL standard

2.3.2檢出限

利用內(nèi)標(biāo)法得到NNAL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y=57.284x+0.566 9 (R2=0.999 7),其中x為NNAL與NNAL-d3的質(zhì)量濃度比,y為NNAL和NNAL-d3的色譜峰面積比。NNAL標(biāo)準(zhǔn)品在0.05～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好?；谠摴ぷ髑€計(jì)算得到固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器的酶解檢出限為0.28 ng/mL。Delshanee等[21]利用β-葡萄糖醛酸酶對(duì)吸煙者的尿樣進(jìn)行酶解分析,得到吸煙者尿液內(nèi)總NNAL的平均水平在0.336 ng/mL左右。該結(jié)果與本固定化酶反應(yīng)器檢出限相當(dāng),說(shuō)明我們制備的固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器有望用于復(fù)雜樣品中目標(biāo)物的分析。

2.3.3回收率

為得到固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器對(duì)底物的回收率,在10 ng/mL的30 μL底物樣品中加入2 ng內(nèi)標(biāo)物NNAL-d3,按照上述優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行酶解和分析,計(jì)算回收率為87.52%。該結(jié)果與周廉淇等[22]利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合修飾銀絲制備的固定化胰酶反應(yīng)器的回收率(87.67%)接近,證明該固定化β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器具有較好的回收率。

2.3.4酶活性的測(cè)定

將β-葡萄糖醛酸酶的一個(gè)酶活性單位(1 U)[23]定義為,在pH 7.0及一定酶解溫度下,每小時(shí)對(duì)硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷釋放1 μmol對(duì)硝基酚所需酶量。酶活性計(jì)算公式如下:酶活性(U/L)=對(duì)硝基酚釋放量(μmol)/反應(yīng)時(shí)間(h)/被檢測(cè)液量(L)。在10-500 μmol/L的濃度范圍內(nèi),對(duì)硝基酚濃度與吸光度值呈正比例關(guān)系,對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.005 9x-0.015 2(R2=0.999 8),其中x為溶液濃度(μmol/L),y為吸光度。將質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的底物溶液通過(guò)酶反應(yīng)器,收集洗脫液,以PBS作為空白對(duì)照,產(chǎn)物的吸光度值為2.489。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定產(chǎn)物對(duì)硝基酚的濃度為424.47 μmol/L。經(jīng)過(guò)計(jì)算得知β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器的酶活性為707.45 U/L。

3　結(jié)論

本文制備了一種新型的有機(jī)-硅膠雜化整體柱基質(zhì),發(fā)展了可用于水解NNAL-O-Gluc的β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器,實(shí)現(xiàn)了NNAL-O-Gluc的快速高效水解,檢出限0.28 ng/mL,回收率87.52%。后期將進(jìn)一步優(yōu)化液相色譜-質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件,以降低β-葡萄糖醛酸酶反應(yīng)器的檢出限,并將發(fā)展的酶反應(yīng)器應(yīng)用于尿液、血漿樣品體系,為實(shí)現(xiàn)體液內(nèi)煙氣代謝產(chǎn)物的高效水解與分析提供可靠方法。

參考文獻(xiàn):

[1]Hoffmann D, Hoffmann I, El-Bayoumy K. Chem Res Toxicol, 2001, 14(7): 767

[2]Khariwala S S, Scheuermann T S, Berg C J, et al. Nicotine Tob Res, 2013, 16(5): 600

[3]Pleasance E D, Stephens P J, O’Meara S, et al. Nature, 2010, 463(7278): 184

[4]Kassem N O F, Kassem N O, Liles S, et al. Am J Health Behav, 2015, 39(5), 680

[5]Zhang H, Liu M. Journal of Baoji University of Arts and Sciences (Natural Science Edition), 2007, 27(4): 287

張紅, 劉銘. 寶雞文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 27(4): 287

[6]Schrader E, Hirsch-Ernst K I, Scholz E, et al. Drug Metab Dispos, 2000, 28(2): 180

[7]Lu W Y, Ferguson S G, Nichols D S, et al. J Pharmaceut Biomed, 2016, 131: 327

[8]Chung C J, Lee H L, Yang H Y, et al. Sci Total Environ, 2011, 409 (9): 1638

[9]Kotandeniya D, Carmella S G, Ming X, et al. Anal Chem, 2015, 87(3): 1514

[10]Carmella S G, Le K, Upadhyaya P, et al. Chem Res Toxicol, 2002, 15(4): 545

[11]Homaei A A, Sariri R, Vianello F, et al. J Chem Biol, 2013, 6(4): 185

[12]Ma J F, Zhang L H, Liang Z, et al. TrAC-Trends Anal Chem, 2011, 30(5): 691

[13]Yuan H M, Zhang L H, Zhang Y K. J Chromatogr A, 2014, 1371: 48

[14]Valikhani D, Bolivar J M, Viefhues M, et al. ACS Appl Mater Inter, 2017, 9(40): 34641

[15]Naldi M, Cernigoj U. Talanta, 2017, 167: 143

[16]Song J Y, Su P, Yang Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(3): 260

宋佳一, 蘇萍, 楊燁, 等. 色譜, 2017, 35(3): 260

[17]Lin H, Ou J J, Zhang Z B, et al. Anal Chem, 2012, 84: 2721

[18]Lin Z, Tan X Q, Yu R F, et al. J Chromatogr A, 2014, 1355: 228

[19]Liu Z, Lin Y B, Lv H D. Int Mater Rev, 2006, 20(12): 137

[20]Hu J W, Shen Y H, Qin W J, et al. Chemical Journal of Chinese University, 2012, 33(2): 268

胡佳薇, 申燁華, 秦偉捷, 等. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2012, 33(2): 268

[21]Kotandeniya D, Carmella S G, Ming X, et al. Anal Chem, 2015, 87(3): 1514

[22]Zhou L Q, Zhang J, Tian F, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 31(4): 355

周廉淇, 張姣, 田芳, 等. 色譜, 2012, 31(4): 355

[23]Wang Z Q, Wang Z W, Zhang Y G. Food Research and Development, 2011, 32(7): 148

王振強(qiáng), 王振偉, 張耀光, 食品研究與開發(fā), 2011, 32(7): 148