葉濤　孫東亮　翁希里　張勉　楊鴻旭　劉沂朝　于世賓

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorder, TMD)的具體病因及發(fā)病機制尚不明確[1]。其重癥表現(xiàn)形式是顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular, TMJ)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)[2]，發(fā)病部位同時涉及下頜髁突軟骨和軟骨下骨，早期的主要病理學(xué)特征為下頜髁突軟骨基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨下骨吸收等退行性變[3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示TMD的發(fā)病具有明顯的女性傾向，前來就診的TMD患者約80%為中青年女性[4]。研究表明部分TMD患者的血清和關(guān)節(jié)液中的雌激素水平明顯高于對照組[5-6]；不同劑量外源性雌激素對體外培養(yǎng)的髁突軟骨細(xì)胞(MCC)增殖、代謝活動具有雙向調(diào)節(jié)作用[7]，提示雌激素與TMD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，有關(guān)雌激素如何影響TMD發(fā)生過程中下頜髁突軟骨、軟骨下骨退行性變的轉(zhuǎn)歸至今鮮有報道。本研究擬依托本課題組獨創(chuàng)的大鼠單側(cè)前牙反致TMJOA樣變模型[8～9]，探討外源性雌激素對下頜髁突軟骨和軟骨下骨退行性變轉(zhuǎn)歸的影響，以期為今后TMD的臨床治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實驗動物及分組

6 周齡雌性SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供，體重160～180 g)18 只，隨機分為對照組(C)、單側(cè)前牙反模型組(UAC)、單側(cè)前牙反+雌激素補充組(UAC+E)，每組6 只。

1.2　動物模型的建立及取材

按照前期報道的方法[9]，制備統(tǒng)一規(guī)格的金屬不良修復(fù)體，實驗動物1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，UAC和UAC+E組大鼠隔濕條件下分別在左側(cè)上、下前牙粘接套筒冠，人為造成左側(cè)前牙反， 每天檢查以確保其不脫落，直至實驗結(jié)束。

17β-雌二醇(17β-E2)晶體(Abcam，ab120657)按說明書配制成溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。每日清晨，每只UAC+E組大鼠腹腔注射80 μg E2(雌性大鼠血液雌激素的平均生理水平約為45～250 pg/ml[10]，而懷孕期間可以達(dá)到5 000 pg/ml甚至更高[11]。注射80 μg E2可以使大鼠血液雌激素水平達(dá)到400 pg左右[12]，既高于生理水平，又不會對機體產(chǎn)生病理影響)，C組、UAC組注射同等劑量的生理鹽水，直至實驗結(jié)束。

動物模型建立4 周后，深度麻醉下脫頸處死法處死大鼠，整體取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定過夜，左側(cè)TMJ用于micro-CT掃描檢測下頜髁突軟骨下骨相關(guān)指標(biāo)，右側(cè)TMJ 10%EDTA中脫鈣4 周，脫水、 包埋、 切片(厚度約5 μm)，以備后續(xù)檢測。取各組大鼠子宮，隔濕后稱重，以評估雌二醇補充的效果。

1.3　Micro-CT掃描

利用Micro-CT掃描儀(Inveon，西門子，德國)，參考以往報道的方法和條件[8]進(jìn)行掃描、重建，分析軟骨下骨骨質(zhì)變化。分析參數(shù)主要包括骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV，the ratio of bone volume to tissue volume)、骨表面積比骨體積(BS/BV，the ratio of bone surface area to bone volume)、骨小梁厚度(Tb.Th，trabecular thickness)、骨小梁間隙(Tb.Sp，trabecular separation)和骨小梁數(shù)目(Tb.N，trabecular number)、骨礦物密度(BMD，bone mineral density)。

1.4　蘇木素-伊紅(Hematoxylin & eosin staining，HE)染色及軟骨厚度測量

常規(guī)HE染色，采集圖像。將髁突等分為前、中、后三部分，應(yīng)用Leica Q-win軟件測量中、后部全層軟骨厚度(圖 2A)，求各部分厚度平均值用于統(tǒng)計分析。

1.5　番紅-O-固綠染色

常規(guī)方法進(jìn)行番紅-O-固綠染色，采集圖像。每個樣本隨機選取5 個高倍視野(×100)，計算番紅-O著色面積百分比，取平均值用于統(tǒng)計分析。

1.6　免疫組化染色

參考免疫組化試劑盒說明(中衫金橋，PV-9003)進(jìn)行常規(guī)免疫組化染色，COL2A1多克隆抗體(Santa Cruz，sc-7763)以1∶100稀釋， 4 ℃孵育過夜。Leica DM2500 顯微鏡下采集圖像。每個樣本隨機選取5 個高倍(×100)視野，計算Ⅱ型膠原染色陽性面積百分比，取平均值用于統(tǒng)計分析。

1.7　TUNEL染色

按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行TUNEL染色(Roche，11684795910，USA)，DAPI染色(Bioworld Technology，BD5010，USA)。熒光共聚焦顯微鏡(BX-60, Olympus，Tokyo， Japan)×400視野下成像，TUNEL為綠色熒光(激發(fā)波長范圍為450～500 nm，發(fā)射波長范圍為515～565 nm)，DAPI為藍(lán)色熒光(激發(fā)波長范圍為340～364 nm，發(fā)射波長范圍為454～488 nm)。隨機選取5 個高倍(×400)視野，計算TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)，取平均值用于統(tǒng)計分析。

1.8　TRAP染色

按照產(chǎn)品說明書行TRAP染色(Sigma，387-A，USA)。 Leica DM2500 顯微鏡下采集圖像。隨機選取5 個高倍(×400)視野，計算TRAP染色陽性且細(xì)胞核≥3 個的細(xì)胞總數(shù)。

1.9　統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)　果

2.1　體重及子宮質(zhì)量變化

C組大鼠體重與UAC組和UAC+E組差異無顯著性(圖 1A，P>0.05)。 UAC+E組大鼠子宮重量顯著高于C組與UAC組(圖 1B，P<0.01)， C組與UAC組大鼠子宮重量差異無顯著性(圖 1B，P>0.05)。

圖 1各組大鼠的體重及子宮質(zhì)量

Fig 1Body and uterus weight of the rats

2.2　髁突軟骨組織形態(tài)學(xué)及軟骨厚度的變化

C組軟骨表面完整平滑，可清晰的分為纖維層(F)、增殖層(Pro)、前肥大層(Pre)、肥大層(Hyp)四部分，各層細(xì)胞分布整齊、均勻(圖 2A-b，2 B-a)。UAC組和UAC+E組髁突軟骨則表現(xiàn)出軟骨各層細(xì)胞層次紊亂，分布不均，增殖層細(xì)胞分散排列，且與前肥大層界限消失，前肥大層與肥大層部分出現(xiàn)細(xì)胞稀疏區(qū)域甚至無細(xì)胞區(qū)域(圖 2B-b、 2B-c)。軟骨前、中、后帶的劃分以及軟骨厚度的測量點如圖(圖 2A-a)所示。UAC組和UAC+E組髁突軟骨中、后部厚度均顯著低于對照組，但UAC組和UAC+E組的髁突軟骨中、后部厚度未見明顯差異(圖 2C，P>0.05)。

圖 2SD大鼠TMJ組織形態(tài)學(xué)改變

Fig 2Histomorphological changes of rat TMJ

2.3　軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的變化以及軟骨細(xì)胞的凋亡

如圖 3A-a所示，C組髁突軟骨番紅-O著色的蛋白聚糖均勻、規(guī)則地分布于前肥大層與肥大層中，與固綠著色的纖維層、 增殖層及軟骨下骨界限清晰。而UAC組和UAC+E組的番紅-O著色區(qū)域面積明顯減少，基本局限于肥大層范圍內(nèi)，且著色、分布不均勻，還可見既無細(xì)胞又無蛋白聚糖的區(qū)域(圖3A-b、3A-c)。且與UAC組相比，UAC+E組蛋白聚糖分布更加局限，僅限于肥大層深部，且更不均勻，在全層軟骨中所占面積比例更小(圖3A-b； 3B，P<0.05)。

Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的另一種主要成分，Ⅱ型膠原免疫組化染色同樣可見，C組軟骨中Ⅱ型膠原均勻、規(guī)則地分布于前肥大層與肥大層中(圖 3A-d)。而UAC和UAC+E組髁突軟骨中Ⅱ型膠原的分布區(qū)域不均勻、不連續(xù)，且分布面積明顯少于對照組，且與UAC組相比，UAC+E組髁突軟骨中Ⅱ型膠原分布區(qū)域面積占全層軟骨面積比例更小(圖 3A-e、 3A-f； 圖B，P<0.01)。

TUNEL及DAPI染色結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞的凋亡大部分發(fā)生在軟骨肥大層。與C組相比，UAC和UAC+E組中的凋亡數(shù)目顯著增多(圖 4A、 4B，P<0.05)，且UAC+E組中的軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著多于UAC組(圖 4A、 4B，P<0.01)。

2.4　軟骨下骨的變化

Micro-CT結(jié)果顯示，UAC組大鼠髁突軟骨下骨骨小梁密度明顯低于C組和UAC+E組(圖 5A)。骨超微結(jié)構(gòu)參數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，UAC組大鼠髁突軟骨下骨的骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨礦物密度(BMD)顯著低于C組和UAC+E組(圖 5B，P<0.01)，骨表面積和骨體積比(BS/BV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著高于C組和UAC+E組(圖 5B，P<0.01)。UAC組和UAC+E組的各項指標(biāo)之間無顯著差異(P>0.05)(圖 5B)。

2.5　軟骨下骨中破骨細(xì)胞的數(shù)量變化

TRAP染色結(jié)果如圖 5A所示，破骨細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，與C組相比，UAC組大鼠髁突軟骨下骨中的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖 6B，P<0.01)，而UAC+E組軟骨下骨中破骨細(xì)胞數(shù)量相比于UAC組明顯減少(圖 6B，P<0.01)， 恢復(fù)到C組水平(圖 6B，P>0.05)。

3　討　論

TMD是指累及TMJ和/或咀嚼肌的一類口腔常見疾病，發(fā)病率高達(dá)20%～40%[13]，主要臨床表現(xiàn)為頜面部疼痛、關(guān)節(jié)雜音和下頜運動受限，該病的發(fā)生將嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1]。下頜髁突軟骨和軟骨下骨是TMD累及的主要部位，二者雖然形態(tài)結(jié)構(gòu)、血供、神經(jīng)支配迥異，但二者在潮標(biāo)線兩側(cè)相依而居，更重要的是軟骨下骨的形成源于軟骨的不斷終末分化、降解，在承載生物力學(xué)方面二者更是相互支撐、互為表里。近年來，有學(xué)者提出應(yīng)該將軟骨和軟骨下骨視為一個復(fù)合體來看待[14]。然而，以往的研究中，很少有學(xué)者同時關(guān)注下頜髁突軟骨和軟骨下骨的生物學(xué)反應(yīng)。

圖 3番紅-O-固綠、免疫組化染色(×100)

Fig 3Safranin O and immunohistochemical staining(×100)

圖 4TUNEL染色(×400)

Fig 4TNUEL staining(×400)

大量流行病學(xué)調(diào)查顯示TMD女性高發(fā)，且高發(fā)于中青年女性[14]，這一發(fā)病特點與全身大關(guān)節(jié)的OA高發(fā)于絕經(jīng)后女性不同[15]，因此雌激素在TMJOA發(fā)生發(fā)展中的作用可能與大關(guān)節(jié)OA不同。近年來盡管不少學(xué)者圍繞不同來源(血液來源、外源性、軟骨自身合成)雌激素水平對TMD發(fā)生發(fā)展的影響等方面展開了大量研究，但極少有研究關(guān)注雌激素對TMD轉(zhuǎn)歸的影響[4,16-18]。本課題組前期發(fā)表在國內(nèi)外研究中的咬合紊亂致大鼠、小鼠TMJOA樣變的動物模型，與其他的外科手術(shù)、注射化學(xué)藥物或基因敲出等模型相比，該動物模型具有創(chuàng)傷小、臨床仿真度高等優(yōu)點[8]。本研究結(jié)果表明大鼠單側(cè)前牙反模型建立4 周后，大鼠的髁突軟骨和軟骨下骨都出現(xiàn)了明顯的TMJOA樣退行性變，這些結(jié)果與我們以往報道的結(jié)果一致，也進(jìn)一步證明了該模型的可靠性。研究表明卵巢切除(血液來源雌激素顯著減少)后，大鼠TMJ可以出現(xiàn)髁突軟骨基質(zhì)降解減少(軟骨層顯著增厚)、軟骨細(xì)胞層次紊亂等變化，雌激素替代治療可以恢復(fù)TMJ的大部分組織形態(tài)參數(shù)[17]。Ng MC利用體外器官培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)成年大鼠髁突軟骨發(fā)現(xiàn)，加入高水平(10-8mol/L～10-6mol/L)雌激素刺激后，相比于對照組，髁突軟骨厚度會明顯下降，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖含量也會明顯下降，而軟骨細(xì)胞肥大化標(biāo)志物X型膠原的表達(dá)會明顯增多，提示軟骨發(fā)生了退行性改變。邵樂南 等[7]在體外髁突軟骨細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，一定濃度(10-11～10-8mol/L)的雌激素可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長以及蛋白多糖的合成，但進(jìn)一步增加雌激素濃度這種促進(jìn)作用會逐漸減弱，而且過量的雌激素(10-6mol/L)具有明顯的抑制作用?？梢姡萍に貪舛冗^高或過低都不利于髁突軟骨穩(wěn)態(tài)的維持。本研究結(jié)果表明，盡管實驗4 周時，UAC和UAC+E組的髁突軟骨中后部厚度差異不顯著，但相比于UAC組，注射高水平雌激素的UAC+E組髁突軟骨中的細(xì)胞外基質(zhì)(蛋白聚糖和Ⅱ型膠原)含量更少，且軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，這都提示高水平的雌激素補充加重了髁突軟骨的退行性變程度。該結(jié)果與Wang 等[12]的研究結(jié)果相似，他們依托關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉致TMJOA的大鼠模型，通過卵巢切除之后再補充外源性雌激素(0～80 μg/d)的方法改變雌激素水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素可以劑量依賴性加重大鼠髁突軟骨的退行性變(軟骨細(xì)胞外基質(zhì)丟失，軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Fas、FasL表達(dá)的上調(diào)，軟骨厚度下降)。

圖 5SD大鼠髁突軟骨下骨micro-CT結(jié)果

Fig 5Results of micro-CT scanning of subchondral bone

圖 6軟骨下骨TRAP染色

Fig 6TRAP staining of subchondral bone

髁突軟骨下骨作為TMJ另一個重要的組成部分，大量研究證明，在OA的發(fā)展過程中，雌激素可以調(diào)節(jié)軟骨下骨的生長和改建，促進(jìn)基質(zhì)的生成和鈣化，影響成骨、破骨之間的平衡[19]。卵巢切除后大鼠TMJ髁突軟骨下骨中的骨量和骨小梁厚度均會顯著下降[17]。外源性補充雌激素可以恢復(fù)小鼠膝關(guān)節(jié)OA模型導(dǎo)致的脛骨軟骨下骨骨量破壞和骨皮質(zhì)變薄[20]，抑制大鼠骨質(zhì)疏松模型中股骨的吸收[21]。另外，當(dāng)給予軟骨細(xì)胞ATDC5細(xì)胞系雌激素干預(yù)后(10-11mol/L)，軟骨細(xì)胞分泌的骨保護(hù)素(OPG)水平會明顯上升，而破骨細(xì)胞標(biāo)志物RANKL的表達(dá)量會發(fā)生明顯的下降[22]。本研究結(jié)果表明，建模4 周后，與C組相比，UAC組髁突軟骨下骨中的破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，骨量明顯減少，這都提示髁突軟骨下骨發(fā)生了退行性變，與我們以往報道的結(jié)果一致[8]。而高水平雌激素的補充后破骨細(xì)胞數(shù)量及骨超微參數(shù)恢復(fù)到了與C組相當(dāng)?shù)乃?，這提示高水平雌激素可以逆轉(zhuǎn)單側(cè)前牙反所致導(dǎo)致的髁突軟骨下骨退行性變。這一結(jié)果與Wang 等[12]所報道的高水平雌激素會劑量依賴性加重TMJOA(碘乙酸鈉關(guān)節(jié)腔注射)進(jìn)程中髁突軟骨下骨的破壞不一致，這種結(jié)果的不一致可能與TMJOA的造模方法不同、大鼠的卵巢切除手術(shù)等因素有關(guān)，相比較而言，本研究的操作與疾病天然的發(fā)病模式更相近。當(dāng)然，今后還需更進(jìn)一步深入的研究來確定雌激素對于髁突軟骨下骨的作用機制。

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