顧文婷，劉福民，韓秋峪

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2. 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 徐州 221000)

稽留流產(chǎn)是因各種因素使胚胎停止發(fā)育或死亡滯留宮腔的一種自然流產(chǎn)形式。目前稽留流產(chǎn)在我國的發(fā)生率高達(dá)13.4%，并且呈逐年增加的趨勢(shì)。盡管已有許多相關(guān)研究，但稽留流產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制尚不十分明確。血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶-1(serum-and glucocorticoid-regulated kinase，SGK1)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的亞家族成員，已被證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多種系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。其參與子宮內(nèi)膜容受性的維持，與人類妊娠有密切關(guān)系。Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是機(jī)體內(nèi)重要的免疫受體。TLR4(Toll-like receptor 4)是第一個(gè)在人類中被發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體家族成員，其不僅介導(dǎo)先天性免疫，還介導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答，并參與妊娠的維持和妊娠疾病的發(fā)生。研究顯示TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)來自革蘭陰性菌毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的信號(hào)，隨后激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，不利于妊娠[1]。而SGK1活化可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)了母胎界面的Th2反應(yīng)[2]。目前SGK1與稽留流產(chǎn)相關(guān)性的研究少有報(bào)道，其機(jī)制亦不清楚。因此，本研究旨在通過檢測稽留流產(chǎn)患者血清SGK1與TLR4的水平，同時(shí)檢測絨毛和蛻膜組織中SGK1、TLR4和NF-κB的表達(dá)，探討SGK1與稽留流產(chǎn)的相關(guān)性及其與流產(chǎn)發(fā)生的可能機(jī)制。

1資料與方法

1.1臨床資料

選擇2017年2至7月期間于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院行清宮術(shù)的稽留流產(chǎn)患者及正常早孕婦女為研究對(duì)象，患者年齡18～46歲，平均29.66±5.91歲?；袅鳟a(chǎn)組入組條件：①孕8～12周通過超聲發(fā)現(xiàn)胚胎停止發(fā)育，無心管搏動(dòng)；②夫婦雙方和(或)胚胎染色體正常；③月經(jīng)周期正常；④性激素、甲狀腺功能、血糖、胰島素等內(nèi)分泌檢查均正常；⑤排除生殖道感染性疾病，如霉菌、支原體、衣原體等感染；⑥巨細(xì)胞病毒、弓形蟲等病原體檢查IgM均為陰性；⑦檢查抗磷脂抗體為陰性排除抗磷脂綜合征。正常早孕組入組條件：①此次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產(chǎn)癥狀和體征；②超聲證實(shí)胚胎發(fā)育正常，有心管搏動(dòng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史；②有家族遺傳病史；③婦科檢查、超聲檢查器質(zhì)性病變和生殖器官解剖畸形遺傳；④有與入組條件不符合的情況。經(jīng)嚴(yán)格納入排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后留取稽留流產(chǎn)組32例、正常早孕組30例，兩組患者間年齡、停經(jīng)天數(shù)、孕次、產(chǎn)次比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。患者均知情同意，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1. 2研究方法

1.2.1標(biāo)本制備

所有研究對(duì)象入院24h內(nèi)空腹采集其肘靜脈血3mL，室溫靜止1h后，3 000 r/min離心10min，取上清，-80℃冰箱保存。所有研究對(duì)象在清宮術(shù)后取新鮮蛻膜及絨毛組織置于10%中性甲醛固定24～48h后常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片，切片厚度4μm，進(jìn)行免疫組化染色。

1.2.2 血清中 SGK1、TLR4表達(dá)檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(試劑購自武漢華美生物工程公司)檢查研究對(duì)象血清中SGK1與TLR4的水平，所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3絨毛及蛻膜組織中 SGK1、TLR4和NF-κB的表達(dá)檢測

采用免疫組化方法(SGK1免疫組化試劑盒購自Abcam公司，TLR4和NF-κB免疫組化試劑盒購自武漢華美生物工程公司)，具體方法為：石蠟切片脫蠟至水，加入500mL檸檬酸鹽緩沖液，置于微波爐加熱修復(fù)抗原，PBS沖洗，室溫冷卻；加入3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育20min，PBS沖洗；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗(SGK1 1：100，TLR4 1：150，NF-κB 1:150)，4℃孵育過夜，PBS沖洗，滴加適量二抗，PBS沖洗DAB，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)中用PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定

1.3.1 ELISA結(jié)果判定

每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD值與空白孔的OD值相減后作圖，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)樣品OD值的大小，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對(duì)應(yīng)的濃度，再乘以稀釋之后的倍數(shù)即是樣品實(shí)際的濃度。

1.3.2免疫組化結(jié)果判定

每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)400倍視野，采用染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分率法相結(jié)合的方法來判讀結(jié)果，二者相乘的結(jié)果作為最后得分：A.陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度按照著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無著色、淡黃色、棕黃色以及棕褐色分別計(jì)分為 0～3分；B.染色細(xì)胞的數(shù)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)染色結(jié)果為陽性的細(xì)胞數(shù)<5%時(shí)為 0分；5%～25%時(shí)為1分，>25%～50% 時(shí)為2分，>50% 為3分。A×B得分結(jié)果判斷：0～3分為陰性，4分及以上為陽性，計(jì)算每組切片的陽性率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組實(shí)驗(yàn)對(duì)象臨床資料的比較

對(duì)正常早孕組及稽留流產(chǎn)組的臨床一般資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組患者在年齡、停經(jīng)天數(shù)、孕次及產(chǎn)次均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 正常早孕組和稽留流產(chǎn)組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data of normal pregnancy group and missed abortion group

2.2 SGK1和TLR4在患者血清中的表達(dá)

SGK1和TLR4兩種蛋白在正常早孕婦女血清中的表達(dá)量分別為(54.20±15.92)pg/mL和(8.31±2.75)ng/mL，在稽留流產(chǎn)患者血清中的表達(dá)量分別為(25.23±7.78)pg/mL和(15.88±6.11)ng/mL。與正常早孕組相比，SGK1在稽留流產(chǎn)組中的表達(dá)量顯著降低(t=8.145，P<0.05)；TLR4在稽留流產(chǎn)組中的表達(dá)量顯著升高(t=4.919，P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3血清中SGK1和TLR4表達(dá)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在稽留流產(chǎn)組的血清中，SGK1和TLR4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.358，P= 0.016<0.05)。

2.4 SGK1、TLR4和NF-κB在絨毛和蛻膜組織中的表達(dá)部位

免疫組化結(jié)果顯示，SGK1主要表達(dá)于絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞核。TLR4主要表達(dá)于絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和絨毛間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)，少數(shù)見于細(xì)胞核。NF-κB主要表達(dá)于絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，少數(shù)見于細(xì)胞核，見圖1、圖2。

2.5 SGK1、TLR4和NF-κB在絨毛和蛻膜組織中的表達(dá)水平

在32例稽留流產(chǎn)中，SGK1表達(dá)陽性者11例，陽性率為34.38%(11/32)。30例正常早孕中，SGK1表達(dá)表達(dá)陽性者21例，陽性率為70.00%(21/30)。稽留流產(chǎn)組中SGK1表達(dá)陽性率明顯低于正常妊娠組，兩組SGK1表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.869，P<0.05)。

在32例稽留流產(chǎn)中，TLR4表達(dá)陽性者20例，陽性率為62.50%(20/32)。30例正常早孕中，TLR4表達(dá)陽性者6例，陽性率為20.00%(6/30)?；袅鳟a(chǎn)組中TLR4表達(dá)陽性率明顯高于正常妊娠組，兩組TLR4表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.486，P<0.05)。

在32例稽留流產(chǎn)中，NF-κB表達(dá)陽性者23例，陽性率為71.88%(23/32)。30例正常早孕中，NF-κB表達(dá)陽性者7例，陽性率為23.33%(7/30)。稽留流產(chǎn)組中NF-κB表達(dá)陽性率明顯高于正常妊娠組，兩組NF-κB表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.609，P<0.05)。

注：1A正常早孕組絨毛中SGK1的表達(dá)；1B稽留流產(chǎn)組絨毛中SGK1的表達(dá)；1C正常早孕組絨毛中TLR4的表達(dá)；1D稽留流產(chǎn)組絨毛中TLR4的表達(dá)；1E正常早孕組絨毛中NF-κB的表達(dá)；1F稽留流產(chǎn)組絨毛中NF-κB的表達(dá)。

圖1 SGK1、TLR4、NF-κB在正常早孕組和稽留流產(chǎn)組絨毛組織中的表達(dá)(免疫組化×400)
Fig.1 The expressions of SGK1, TLR4 and NF-κB in villi(免疫組化×400)

注：2A正常早孕組蛻膜中SGK1的表達(dá)；2B稽留流產(chǎn)組蛻膜中SGK1的表達(dá)；2C正常早孕組蛻膜中TLR4的表達(dá)；2D稽留流產(chǎn)組蛻膜中TLR4的表達(dá)；2E正常早孕組蛻膜中NF-κB的表達(dá)；2F稽留流產(chǎn)組蛻膜中NF-κB的表達(dá)。

圖2 SGK1、TLR4、NF-κB在正常早孕組和稽留流產(chǎn)組(免疫組化×400)
Fig. 2 The expressions of SGK1, TLR4 and NF-κB in decidua (免疫組化×400)

2.6絨毛蛻膜組織中SGK1、TLR4和NF-κB三者的相關(guān)性分析

Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示：在稽留流產(chǎn)組的絨毛蛻膜組織中，SGK1和TLR4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= -0.527，P=0.003)，SGK1與NF-κB的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.662，P=0.000)，TLR4與NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.520，P=0.002)。

3討論

3.1 SGK1與母胎界面免疫微環(huán)境

SGK1參與妊娠的多個(gè)過程，包括維持子宮內(nèi)膜容受性、促進(jìn)囊胚植入與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、調(diào)節(jié)母胎界面細(xì)胞分化和增殖與存活等[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，與月經(jīng)期子宮內(nèi)膜相比，在人類早期妊娠蛻膜中，SGK1濃度明顯升高[4]。也有研究表明，在早期自然流產(chǎn)患者的蛻膜中，SGK1的表達(dá)減少[5]。本研究結(jié)果顯示稽留流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織中SGK1的表達(dá)均明顯低于正常早孕組，提示SGKl低表達(dá)與胚胎停止發(fā)育有關(guān)。

妊娠期母胎界面的免疫細(xì)胞與細(xì)胞因子參與免疫網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成,維持免疫微環(huán)境的平衡。其中Thl/Th2平衡是維持正常妊娠的重要因素之一。早期適量的 Th1 類細(xì)胞因子如干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等有利于滋養(yǎng)細(xì)胞形成, 并在著床期促進(jìn)血管生成，但Th1 類細(xì)胞因子也為促炎性細(xì)胞因子，可介導(dǎo)細(xì)胞免疫、急性排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等，過度表達(dá)時(shí)則會(huì)影響胚胎的存活，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[6]。

SGK1在免疫與炎癥反應(yīng)中具有重要的作用。研究顯示SGK1能夠誘導(dǎo)分化和穩(wěn)定Th2細(xì)胞,抑制 Th1 細(xì)胞的分化[7]。殷輝等[8]在研究小鼠膿毒血癥時(shí)，用脂多糖刺激SGKl抑制劑預(yù)處理過的小鼠，發(fā)現(xiàn)白介素-12(interleukin -12，IL-12)和TNF-α的表達(dá)較未使用SGKl抑制劑預(yù)處理的小鼠明顯升高，說明SGK1能夠抑制Th1類細(xì)胞因子的表達(dá)。

3.2 SGK1參與稽留流產(chǎn)發(fā)生的可能機(jī)制

國內(nèi)外已有多項(xiàng)研究證明TLR4參與妊娠的維持和妊娠疾病的發(fā)生[9]。TLR4被激活后，通過一系列跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB，誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子分泌增加，抑制Th2型細(xì)胞因子分泌，破壞Thl/Th2平衡[10]，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[11]。本研究中稽留流產(chǎn)組絨毛和蛻膜組織中TLR4、NF-κB的表達(dá)水平均高于正常早孕組，相關(guān)性分析顯示TLR4與NF-κB的表達(dá)成正相關(guān)，與以往結(jié)果研究一致。Zhou等[12]研究內(nèi)毒素所致器官衰竭時(shí)提出SGK1可能通過抑制TLR4下游的轉(zhuǎn)化生長因子β激酶1(transforming growth factor β kinase 1，TAK1)，阻止I-κB激酶(I- kappa B kinase，IKK)磷酸化，抑制NF-κB活性，負(fù)調(diào)控TLR4介導(dǎo)的炎性活動(dòng)。本研究中稽留流產(chǎn)患絨毛蛻膜組織中SGK1的表達(dá)均明顯低于正常早孕組，并與TLR4、NF-κB的表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān),提示SGK1低表達(dá)可能通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化，導(dǎo)致母胎界面Th1/ Th2平衡向Th1偏倚，參與了流產(chǎn)的發(fā)生。

本研究同時(shí)檢測了稽留流產(chǎn)患者血清中SGK1和TLR4的表達(dá)及其相關(guān)性，結(jié)果顯示血清中SGK1的表達(dá)與絨毛和蛻膜組織一致，較正常早孕組明顯下降(P<0.05)，而TLR4的表達(dá)較正常早孕組明顯上升(P<0.05)，且二者在血清中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示稽留流產(chǎn)患者血清中SGK1與母胎界面的表達(dá)具有一致性。檢測孕婦血清中SGK1的水平可能成為判斷流產(chǎn)的指標(biāo)。但本研究樣本量較小，仍需大樣本研究來證實(shí)其實(shí)用性。

綜上所述，與正常早孕組相比，稽留流產(chǎn)患者的血清、絨毛和蛻膜組織中SGK1表達(dá)均降低，提示SGK1與稽留流產(chǎn)的發(fā)生具有相關(guān)性，其機(jī)制可能與SGK1表達(dá)減少，對(duì)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)減弱，母胎界面免疫微環(huán)境失衡有關(guān)。SGK1有可能成為臨床檢測流產(chǎn)的指標(biāo)或治療靶點(diǎn)。

[1]Xue P,Zheng M,Gong P,etal.Single administration of ultra-low-dose lipopolysaccharide in rat early pregnancy induces TLR4 activation in the placenta contributing to preeclampsia[J].PLoS One,2015,10(4):e0124001.

[2]Lou Y,Hu M,Wang Q,etal.Estradiol suppresses TLR4-triggered apoptosis of decidual stromal cells and drives an anti-inflammatory TH2 shift by activating SGK1[J].Int J Biol Sci,2017,13(4):434-448.

[3]Lou Y,Hu M,Mao L,etal.Involvement of serum glucocorticoid-regulated kinase 1 in reproductive success[J].FASEB J,2017,31(2):447-456.

[4]Lv Y,Gao S,Zhang Y,etal.miRNA and target gene expression in menstrual endometria and early pregnancy decidua[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2016,197:27-30.

[5]Wang Y,Lv Y,Wang L,etal.MicroRNAome in decidua: a new approach to assess the maintenance of pregnancy[J].Fertil Steril,2015,103(4):980-989.

[6]李莉,喬杰,王海燕.不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華生殖與避孕雜志,2017, 37(2):160-165.

[7]Heikamp E B,Patel C H,Collins S,etal.The AGC kinase SGK1 regulates TH1 and TH2 differentiation downstream of the mTORC2 complex[J].Nat Immunol,2014,15(5):457-464.

[8]殷輝,寧會(huì)彬,曾艷麗,等.血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1通過核因子-κB抑制Toll樣受體4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[J].中華傳染病雜志,2016,34(4):242-247.

[9]Koga K,Izumi G,Mor G,etal.Toll-like receptors at the maternal-fetal interface in normal pregnancy and pregnancy complications[J].Am J Reprod Immunol,2014,72(2):192-205.

[10]Wei C B,Tao K,Jiang R,etal.Quercetin protects mouse liver against triptolide-induced hepatic injury by restoring Th17/Treg balance through Tim-3 and TLR4-MyD88-NF-κB pathway[J].Int Immunopharmacol,2017,53:73-82.

[11]趙先蘭,李莎.稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中TLR4、NF-κB和HBD2的表達(dá)及其相關(guān)性[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2011,46(11):864-866.

[12]Zhou H,Gao S,Duan X,etal.Inhibition of serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 enhances TLR-mediated inflammation and promotes endotoxin-driven organ failure[J].FASEB J,2015,29(9):3737-3749.

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