谷雷 林靜 王永春 劉瑋 文文 賴(lài)國(guó)祥 柳德靈 劉月彬 陳津 楊忠

臍帶血（umbilical cord blood，UCB）、成人骨髓（bone marrow，BM）和外周血（peripheral blood，PB）來(lái)源的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）可分化成各種血細(xì)胞，但HSCs的先天缺陷可導(dǎo)致某些血液病。眾所周知，BM移植在治療血液系統(tǒng)疾病上發(fā)揮著重要作用，這主要依賴(lài)于HSCs的再生能力。然而，自體患者或同種異體供者來(lái)源的HSCs嚴(yán)重不足，且缺乏有效擴(kuò)增HSCs的方法，制約了HSCs的臨床應(yīng)用。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的出現(xiàn)，有望解決這些問(wèn)題。

一、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的缺點(diǎn)及iPSCs的誕生

ESCs和iPSCs等多能干細(xì)胞均可分化成所有三胚層細(xì)胞[1]。ESCs來(lái)源于哺乳動(dòng)物囊胚階段胚胎的內(nèi)部細(xì)胞群，人ESCs（human ESCs，hESCs）的研究和應(yīng)用受到兩方面的限制。第一，來(lái)源于卵母細(xì)胞和胚胎的hESCs涉及倫理問(wèn)題；第二，來(lái)自hESCs的細(xì)胞移植是同種異體移植，具有不同抗原，免疫排斥不可避免[2]。為解決上述問(wèn)題，ESCs樣的iPSCs應(yīng)運(yùn)而生。

體細(xì)胞與ESCs雜交后，有能力分化成所有的細(xì)胞類(lèi)型，表明體細(xì)胞的多能性可由在ESCs中表達(dá)的一些重編程因子引起。2006年，Takahashi等[3]使用 Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc等4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程生成了一種干細(xì)胞，即iPSCs。次年，Takahashi[4]和Yu等[5]成功將人體細(xì)胞重編程產(chǎn)生了人iPSCs（hiPSCs）。hiPSCs在分子和功能上與ESCs非常相似，可分化產(chǎn)生人體中的所有細(xì)胞類(lèi)型。

二、iPSCs的定向分化

若iPSCs能高效分化成HSCs，BM移植和輸血治療將不再受血液來(lái)源和免疫排斥的制約，對(duì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用都大有裨益。誘導(dǎo)HSCs生成的主要方法包括形成擬胚體和與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)。然而，擬胚體卻很難將iPSCs誘導(dǎo)成特定的造血細(xì)胞[6]。iPSCs與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)分化出造血細(xì)胞[7-9]。造血細(xì)胞來(lái)源的iPSCs較易重新分化成造血細(xì)胞[10]。然而，目前干細(xì)胞定向分化效率仍較低。DNA甲基化在干細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中起重要作用[11]，干細(xì)胞的多向分化潛能也與DNA甲基化水平有關(guān)。在分析RefSeq啟動(dòng)子的DNA甲基化狀態(tài)后發(fā)現(xiàn)，未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞甲基化水平普遍較低[12]。Broeske等[13]發(fā)現(xiàn)低活性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1（DNMT1）小鼠的HSCs不能生成粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，提示異常的DNA甲基化會(huì)影響HSCs和祖細(xì)胞的分化潛能。此外，內(nèi)皮細(xì)胞特殊基因的甲基化，如CD31和CD144，可限制人脂肪干細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞[12]。DNA去甲基化是由染色體10和11之間的基因轉(zhuǎn)位而得名的Ten- eleven轉(zhuǎn)位（TET）蛋白介導(dǎo)的[14-15]，且5-甲基胞嘧啶去甲基的關(guān)鍵酶已確定。去甲基化機(jī)制的研究將對(duì)iPSCs定向分化成HSCs起重要作用。

三、iPSCs在血液病中的應(yīng)用

目前，iPSCs主要用于3個(gè)領(lǐng)域，即建立疾病模型、藥物篩選和細(xì)胞治療（圖1）。通過(guò)建立特定疾病模型，可解決實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源問(wèn)題，特別是特定疾病相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型可在體外產(chǎn)生?；颊咛禺愋詉PSCs可觸發(fā)藥物的個(gè)體反應(yīng)，用于高效篩選相關(guān)藥物。許多疾病癥狀可在移植患者特異性iPSCs后得以緩解。hiPSCs可生成功能成熟的紅細(xì)胞（red blood cells，RBCs），用于輸血治療；iPSCs來(lái)源的神經(jīng)嵴細(xì)胞已用于家族性自主神經(jīng)異常的治療[16]。

圖1 iPSCs在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

（一） 疾病模型

iPSCs可分化成所有細(xì)胞類(lèi)型，能產(chǎn)生種系傳遞，其分化細(xì)胞可用于疾病研究和治療。對(duì)于許多遺傳病，由于缺乏疾病模型，相關(guān)研究受阻。X型慢性肉芽腫病[17]、范科尼貧血[18]、鐮狀細(xì)胞病[19]和真性RBCs增多癥[10]等疾病可由患者特異性iPSCs建立相關(guān)模型。然而，任何iPSCs模型都要基于以下幾點(diǎn)：體外表型可代表體內(nèi)病理生理學(xué)，但需考慮克隆變異性。此外，原始細(xì)胞的“表觀遺傳記憶”可被早期iPSCs部分保留[20]。

（二） 藥物篩選

建立iPSCs疾病模型可幫助理解發(fā)病機(jī)制，大規(guī)模篩選藥物并促進(jìn)新藥開(kāi)發(fā)。iPSCs具有無(wú)限復(fù)制能力和克隆性，可提供足夠細(xì)胞用于復(fù)雜的分子分析。因從體細(xì)胞重編程的iPSCs系中存在致病突變，故iPSCs來(lái)源細(xì)胞可誘發(fā)疾病相關(guān)表型。通過(guò)對(duì)化學(xué)庫(kù)進(jìn)行篩選，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)有效治療某些疾病的藥物。

（三）輸血治療

RBCs為組織供氧，白細(xì)胞防御病原體入侵，血小板控制凝血。RBCs和血小板臨床應(yīng)用最廣泛。為恢復(fù)免疫功能，增強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)，BM抑制患者還需有足夠數(shù)量的白細(xì)胞。其中，臨床對(duì)RBCs和血小板需求最大。

1.RBCs：臨床上，輸注RBCs可挽救許多失血或血液病患者。然而，RBCs一直供不應(yīng)求。目前，輸血用RBCs主要依賴(lài)無(wú)償獻(xiàn)血，導(dǎo)致RBCs供應(yīng)極不穩(wěn)定且有感染各種病原體的風(fēng)險(xiǎn)。而諸如缺乏罕見(jiàn)表型的血細(xì)胞，MHC不相容等問(wèn)題也很難解決。因hiPSCs具有無(wú)限增殖特征，有望成為可輸注RBCs的可靠來(lái)源，且可解決罕見(jiàn)血型短缺問(wèn)題。

hiPSCs的體外擴(kuò)增潛能比BM、PB或UCB大得多，其衍生的EBs與干細(xì)胞因子（SCF）、Fms-樣酪氨酸激酶3（Flt3）配體、白細(xì)胞介素-3（IL-3）、IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）共培養(yǎng)可加速造血祖細(xì)胞生成[21]，且擬胚體紅系克隆數(shù)量和頻率在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作用下也會(huì)提高[22]。Lapillonne等[23]在細(xì)胞因子和人血漿共存條件下通過(guò)形成擬胚體來(lái)分化hiPSCs，獲得早期RBCs系，然后在造血細(xì)胞因子作用下獲得成熟RBCs。Dias等[24]通過(guò)hiPSCs與OP9基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法來(lái)生成RBCs，并發(fā)現(xiàn)每個(gè)iPSCs均可與OP9共培養(yǎng)生成20萬(wàn)個(gè)RBCs。Kattman等[25]發(fā)現(xiàn)ESCs和iPSCs分化成中胚層的培養(yǎng)條件并不一致，所以即使胚體是ESCs分化為RBCs的最佳培養(yǎng)環(huán)境，但并不代表其是iPSCs分化為RBCs的最佳環(huán)境。為此，Kobari等[26]提出先在體外微環(huán)境中將iPSCs分化為有核的網(wǎng)織RBCs，再在體內(nèi)環(huán)境中誘導(dǎo)其繼續(xù)分化成成熟RBCs。因體內(nèi)微環(huán)境因素未能在體外完全模擬成功，體內(nèi)仍有一些對(duì)促進(jìn)RBCs成熟的因素未被發(fā)現(xiàn)，體外誘導(dǎo)分化RBCs的方案有待進(jìn)一步探究。

目前距臨床應(yīng)用hiPSCs分化的RBCs仍長(zhǎng)路漫漫。首先，要確定最佳的無(wú)血清良好生產(chǎn)規(guī)范條件，以生成安全的臨床級(jí)RBCs。其次，臨床對(duì)RBCs的需求量巨大。雖然RBCs可大量生成，但生成的RBCs是有核的，主要表達(dá)胚胎和胎兒血紅蛋白，極少表達(dá)成人血紅蛋白，且去核效率低下。研究發(fā)現(xiàn)SH2B3基因與健康個(gè)體血紅蛋白水平和RBCs計(jì)數(shù)增加有關(guān)，通過(guò)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的SH2B3基因編輯可成功提高h(yuǎn)ESCs分化培養(yǎng)的RBCs產(chǎn)量[27]，但需考慮iPSCs生成RBCs的工業(yè)成本。

2.血小板：血小板在止血、血栓形成和傷口修復(fù)中起重要作用[28]。輸注血小板已成為治療血小板相關(guān)疾病的重要組成部分，因此血小板的需求正在增加。然而，供者來(lái)源的血小板滿足不了臨床需要，且保質(zhì)期短，還存在輸血相關(guān)感染風(fēng)險(xiǎn)和對(duì)儲(chǔ)存室溫的要求，細(xì)菌可能會(huì)繁殖。此外，通過(guò)hiPSCs生成血小板優(yōu)勢(shì)之一在于可對(duì)其進(jìn)行基因操控，用于存在同種異體免疫的患者以及作為運(yùn)載凝血因子等藥物至血管損傷部位的載體[29]。因此，hiPSCs來(lái)源的血小板可成為輸血的潛在來(lái)源。

hiPSCs可分化成基于OP9和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞和外造血細(xì)胞組成的iPS細(xì)胞囊，這些細(xì)胞囊在TPO、IL-6、IL- 11、肝素和SCF的作用下進(jìn)一步分化形成MKs，產(chǎn)生的血小板可附著并生長(zhǎng)在纖維蛋白原、vWF和I型膠原-涂板上，且可聚集，在試管中收縮纖維蛋白凝塊，并且能形成一個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)，此系統(tǒng)可從hiPSCs生成MKs前體和功能性血小板。c-MYC的激活可導(dǎo)致超倍體MKs生成增加，且MKs從成血管細(xì)胞中產(chǎn)生，避免使用血清（動(dòng)物）飼料層細(xì)胞在分化hiPSCs的過(guò)程中所面臨的問(wèn)題。經(jīng)過(guò)輻射介導(dǎo)除去多余多能細(xì)胞后血小板移植很安全，且不存在畸形風(fēng)險(xiǎn)。因此，在治療許多血液病如血小板減少癥的過(guò)程中，hiPSCs分化產(chǎn)生的臨床級(jí)、功能性可輸注血小板將起重要作用。

然而，hiPSCs來(lái)源的MKs和血小板產(chǎn)生效率低且生物活性不穩(wěn)定限制其發(fā)展[30]。Nakamura等[30]用hESCs/ hiPSCs來(lái)產(chǎn)生永生的巨核細(xì)胞祖細(xì)胞株（imMKCL），可低溫保存并可在試管中擴(kuò)增，誘導(dǎo)血小板釋放。然而，從imMKCL和人-多能干細(xì)胞-來(lái)源的MKs中血小板的產(chǎn)量只有3 ～ 10個(gè)細(xì)胞[31]，而正常的內(nèi)源性MKs可在體內(nèi)釋放2 000 ～ 10 000個(gè)血小板[32]。而且從imMKCL中生成的血小板更小，含顆粒更少，與正常捐贈(zèng)者來(lái)源的血小板相比，其基線激活程度增加，對(duì)體外激動(dòng)劑的反應(yīng)也減少。通過(guò)模擬正常MKs的條件和細(xì)胞微環(huán)境，可以提高imMKCL來(lái)源的血小板的數(shù)量和質(zhì)量[33]。為生成更多數(shù)量的MKs和血小板，Moreau等[34]使人多能干細(xì)胞過(guò)表達(dá)FLI1，GATA1和TAL1等轉(zhuǎn)錄因子，使其更易生成MKs。該方法利用106個(gè)iPSCs分化成2×1011個(gè)MKs，這些MKs釋放出1×1012個(gè)血小板。

四、挑戰(zhàn)及展望

（一）挑戰(zhàn)：iPSCs誘導(dǎo)分化成造血細(xì)胞

1.在iPSCs中觀察到許多基因組變化，可能對(duì)重編程過(guò)程不利：在原始成纖維細(xì)胞中，可通過(guò)PCR檢測(cè)到至少50﹪的點(diǎn)突變。Gore等[35]發(fā)現(xiàn)在22個(gè)人類(lèi)iPS細(xì)胞系的外顯子組測(cè)序中有124個(gè)點(diǎn)突變，但在親代細(xì)胞中沒(méi)有突變。對(duì)hiPS細(xì)胞系和小鼠iPS細(xì)胞系進(jìn)行全基因組測(cè)序，評(píng)估重編程過(guò)程對(duì)基因突變的影響，結(jié)果提示重編程本身并不會(huì)導(dǎo)致iPSCs的基因變異，而基因組異常來(lái)自克隆iPSCs的突變史[36-37]。當(dāng)不同的體細(xì)胞被重編程時(shí)，也應(yīng)該研究染色體異常的原因。因此，解決iPSCs中基因組變化的問(wèn)題應(yīng)該是一個(gè)重點(diǎn)。

2.iPSCs保留了其親代細(xì)胞的表觀遺傳記憶[38-41]，而iPSCs的分化潛力將受到表觀遺傳記憶的影響：研究發(fā)現(xiàn)，與非β-細(xì)胞來(lái)源的iPSCs相比，β-細(xì)胞來(lái)源的iPSCs有更好的分化成胰島分泌細(xì)胞的能力[38]。iPSCs和ESCs的差異在持續(xù)的傳代中越來(lái)越小，而在iPSCs的后期傳代細(xì)胞中未觀察到親本細(xì)胞系特征[40,42]。即使帶有表觀遺傳的特征，不同來(lái)源的iPSCs也可在一定條件下分化成不同的功能細(xì)胞類(lèi)型[43-44]。表觀遺傳記憶的基本生物學(xué)特征還不清楚，對(duì)表觀遺傳記憶及其對(duì)細(xì)胞分化影響的研究仍應(yīng)繼續(xù)。

3.iPSCs分化的細(xì)胞移植到體內(nèi)后，腫瘤發(fā)生機(jī)率高，而宿主致癌基因的再激活是主要原因：c-MYC是致癌基因中最經(jīng)典的重編程因子之一，其嚴(yán)重制約了iPSCs的臨床應(yīng)用。因此，其他因子如LIN28已被用于降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。利用含有LIN28的游離基因載體和非轉(zhuǎn)化性的L-MYC而非c-MYC與p53抑制劑聯(lián)合，可成功獲得高產(chǎn)的iPSCs[45]。

4.產(chǎn)生iPSCs的效率很低：為提高生成效率，在培養(yǎng)過(guò)程中可加入一些分子，維生素C是其中一種[46]。在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，還可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNAs水平來(lái)提高重編程效率[47]。miRNAs可上調(diào) OCT-4、SOX-2、KLF-4和 MYC 等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)體細(xì)胞重編程生成iPSCs，miRNAs在缺乏外源性轉(zhuǎn)錄因子情況下亦可將體細(xì)胞重編程生成iPSCs，比如miR-302，其通過(guò)上調(diào)OCT-4水平促進(jìn)細(xì)胞多能性[48-49]，而miR-29a的下調(diào)卻可提高鼠成纖維細(xì)胞重編程效率，提示miR-29a的缺失會(huì)改變體細(xì)胞的DNA甲基化譜并可影響細(xì)胞重編程相關(guān)基因的表達(dá)[50]。然而，生成iPSCs的重編程過(guò)程會(huì)受到某些疾病的影響。此外，目前還不清楚iPSCs在體內(nèi)的分化過(guò)程。

5.iPSCs分化成功能性細(xì)胞困難重重：對(duì)血液病而言，產(chǎn)生HSCs及其功能前體細(xì)胞至關(guān)重要。然而，目前在培養(yǎng)皿中研究造血過(guò)程非常困難，也無(wú)法利用iPSCs來(lái)生成HSCs。因此，需進(jìn)一步研究iPSCs生成功能性造血細(xì)胞的過(guò)程和iPSCs再分化的分子機(jī)制。

（二）展望：體細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化成造血細(xì)胞

目前人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成iPSCs的機(jī)制尚不完全清楚，細(xì)胞介質(zhì)使這一轉(zhuǎn)化過(guò)程更加復(fù)雜，因不能建立理想的重組因子表達(dá)環(huán)境來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞多能性，故難以形成穩(wěn)定的多能干細(xì)胞狀態(tài)。在特定條件下，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向特定譜系分化。成纖維細(xì)胞已能轉(zhuǎn)變成神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞等單細(xì)胞類(lèi)型[51-53]。已有研究揭示人成纖維細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)化成髓系、紅系、巨核系造血祖細(xì)胞，而不需先將體細(xì)胞誘導(dǎo)成干細(xì)胞[54]。

雖然iPSCs在治療血液病的過(guò)程中面臨許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)，但iPSCs的優(yōu)勢(shì)不可否認(rèn)，未來(lái)前景可期。隨著iPSCs技術(shù)的改進(jìn)和iPSCs在血液疾病中的研究進(jìn)展，iPSCs來(lái)源的血細(xì)胞未來(lái)有望廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病。