尹楠 嚴恩石 劉莉 孫強

隨著宮內(nèi)胎兒治療技術(shù)的發(fā)展，麻醉藥物對胎兒及新生兒中樞神經(jīng)功能的影響也越來越引起更多的關(guān)注和研究。七氟醚作為臨床常見的吸入麻醉藥物，通常在2﹪的吸入濃度就可以達到維持孕期手術(shù)的最低濃度劑量，一旦吸入濃度超過3.5﹪就會對母體的血液循環(huán)產(chǎn)生影響，進而影響胎兒的血供和健康[1-2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)：在大腦早期發(fā)育階段接觸麻醉藥物會引起神經(jīng)的退行性改變和學習能力的受損，進而出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育損傷和嬰兒出生后的認知功能障礙[3-4]。因此七氟醚作為臨床中最為常見的吸入麻醉藥物，也是孕期手術(shù)患者首選的麻醉維持藥物，但是七氟醚對胚胎神經(jīng)干細胞生長發(fā)育的研究卻十分有限。

神經(jīng)干細胞是一類具有高度的自我更新、增殖和多項分化潛能的細胞，因此中樞發(fā)育的窗口期神經(jīng)干細胞的數(shù)量和功能狀態(tài)會直接影響大腦的發(fā)育以及胎兒出生后的認知學習功能[5-6]。最新的研究也證實了體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細胞接受七氟醚的刺激后會影響其自我更新能力，但其潛在的分子機制尚不清楚[7-8]。

在本研究中，通過孕中期母鼠暴露于不同濃度七氟醚后，研究出生后小鼠的行為認知功能以及神經(jīng)干細胞的凋亡情況，探索孕中期七氟醚暴露誘導神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡的具體潛在分子機制。

材料與方法

一、實驗動物及儀器

實驗動物選擇SPF級雌性孕14 d的SD大鼠，購自南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院實驗動物中心，相關(guān)實驗內(nèi)容獲得醫(yī)院倫理委員會批準[CZEC（2017）-09]。MP150電生理記錄儀（美國Biopac公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

二、方法

1.分組方式：實驗前動物自由飲水攝食，自然光照明。以計算機生成隨機數(shù)字的方法將所有孕中期大鼠隨機分為3組，對照組，低濃度七氟醚組，高濃度七氟醚組，每組48只孕鼠。

2.建模方法：將14 d孕期的SD大鼠放入配有麻醉氣體檢測儀的麻醉箱內(nèi)，高濃度組吸入七氟醚濃度為3.5﹪，持續(xù)2 h；低濃度組吸入七氟醚濃度為2﹪，持續(xù)2 h，吸入氧濃度均為30﹪，對照組大鼠吸入30﹪濃度的氧氣，持續(xù)2 h。整個實驗過程中大鼠始終保持自主呼吸，監(jiān)測大鼠脈搏、血壓、呼吸、心率，麻醉過程發(fā)生低血壓時進行鼠尾靜脈注射0.3 mg/kg的腎上腺素。麻醉結(jié)束后將所有孕鼠放回飼養(yǎng)環(huán)境待特定時間點取胎鼠或子代大鼠腦組織進行冰凍切片備用，時間點包括七氟醚吸入后6、24和 48 h，出生當天（P 0），出生后 14 d（P 14），出生后28 d（P 28），每個時間點設(shè)置8只孕鼠以備實驗取材。

3.免疫印跡法檢測胎鼠和新生小鼠海馬組織中Nestin及腦組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），磷 脂 酰 肌 醇 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，pi3k），蛋 白 激 酶B（AKT）和p-AKT的蛋白含量：檢測七氟醚麻醉后6 h胎鼠大腦組織中的VEGF，PI3K，p-AKT和AKT水平以及麻醉后6、24和48 h和出生后P 0、P 14、P 28幼鼠海馬組織中Nestin的表達水平，每只母鼠取3只胎鼠作為重復。

每組稱取0.1 g的組織樣品，加入500 μl蛋白裂解液處理組織后采用組織勻漿機充分粉碎勻漿，4℃，8 000×g，離心10 min，保留上清液以BAC 蛋白定量每個樣品的蛋白濃度，配平和煮樣變性后，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5﹪脫脂牛奶封閉2 h，抗VEGF、抗PI3K、抗p-AKT和抗 AKT 抗體分別以 1:1 000，1:200，1:200，1:200和1:100稀釋，并在4℃孵育過夜，以GAPDH作為內(nèi)參。隔天棄掉一抗，以TBST洗膜3次，每次10 min，后室溫孵育二抗2 h（1:10 000稀釋），重復TBST洗膜3次后，以天能ECL顯影系統(tǒng)進行曝光，采用Image-Pro Plus6.0軟件測定條帶的灰度值，以目標蛋白與GAPDH條帶的灰度值之比表示目標蛋白的表達水平。

4.Nestin / TUNEL免疫熒光雙標染色：選取麻醉后6、24和48 h以及在出生后P 0、P 14、P 28的胎鼠或幼鼠腦組織進行免疫熒光染色（n= 8只妊娠母鼠，每只母鼠取3只胎鼠作為重復），采用4﹪多聚甲醛進行組織固定后切成8 mm的冠狀腦切片，每只大鼠使用3個腦切片，與10﹪牛血清白蛋白在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育30 min進行封閉，與抗Nestin抗體（1:100）于4 ℃冰箱孵育過夜。次日PBS沖洗3遍后，避光滴加兔抗鼠的二抗、TUNEL試劑（1:10）和 TRITC（1:50），37℃避光孵育 2 h，然后用 PBS洗滌3次，加入DAPI染色液孵育5 min后，用封固劑覆蓋載玻片，熒光顯微鏡下讀片。Nestin陽性為紅色，代表神經(jīng)干細胞特異性標志，鑒定為NSCs。DAPI陽性為藍色，標記細胞核。TUNEL陽性為綠色，代表凋亡細胞。

5.細胞計數(shù)：在熒光顯微鏡上讀取免疫熒光圖像，并使用Image J軟件進行圖像分析，計數(shù)海馬組織中神經(jīng)干細胞和凋亡神經(jīng)干細胞的數(shù)量，每只幼鼠以5個隨機切片進行陽性細胞的定量分析。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，免疫熒光染色圖像統(tǒng)計陽性著色細胞數(shù)量，免疫印跡圖像進行灰度值掃描后行半定量分析數(shù)據(jù)以± s表示。對照、低劑量和高劑量3組間比較進行單因素方差分析，然后進行Bonferroni事后檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、妊娠中期七氟醚暴露對孕鼠生命體征的影響

記錄七氟醚暴露過程中孕鼠的生命體征及低血壓等不良事件的發(fā)生情況證實，高濃度和低濃度的七氟醚暴露均會增加孕鼠術(shù)中低血壓事件的發(fā)生，其中對照組低血壓事件0，低濃度七氟醚暴露組低血壓事件2例，高濃度七氟醚暴露組低血壓事件3例，均以鼠尾靜脈注射0.3mg/kg的腎上腺素進行糾正后恢復，但是不同濃度七氟醚暴露組之間低血壓事件的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義。

二、妊娠中期七氟醚暴露對胎兒及新生兒海馬組織中Nestin表達的影響

進行Nestin的免疫染色證實：與對照組相比，低濃度七氟醚組的Nestin陽性細胞在任何時間點差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。相反，在全部的6個時間點，高濃度七氟醚組中Nestin陽性細胞的數(shù)量減少（P＜0.05，圖 1、2，表 1）。Western Blot結(jié)果證實，高濃度七氟醚組Nestin蛋白水平在所有時間點均低于對照組（P＜0.05，圖3）。這些結(jié)果均表明，妊娠中期高濃度的七氟醚暴露會抑制子代小鼠大腦中神經(jīng)干細胞的發(fā)育。

圖1 熒光顯微鏡下觀察各組胎鼠大腦神經(jīng)干細胞（Nestin染色，×400）

圖2 熒光顯微鏡下觀察出生后各組小鼠大腦神經(jīng)干細胞（Nestin染色，×400）

表1 在不同時間點Nestin染色陽性細胞所占比例的定量分析（x± s）

圖3 免疫印跡檢測不同時間點大腦組織中Nestin蛋白的表達水平

三、妊娠中期七氟醚暴露對子代小鼠神經(jīng)干細胞凋亡情況的影響

Nestin / TUNEL雙標染色陽性被認為是發(fā)生凋亡的神經(jīng)干細胞，從圖4、5的免疫熒光染色可見，在七氟醚暴露后的所有時間點，低濃度七氟醚組合對照組之間發(fā)生凋亡的神經(jīng)干細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義，但是高濃度七氟醚組小鼠在暴露后的6、24和48 h以及出生后的P 0、P 14發(fā)生凋亡的神經(jīng)干細胞數(shù)量高于對照組（P＜ 0.05，表2）。表明妊娠中期暴露于高濃度七氟醚會誘導胚胎及新生小鼠大腦的神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡。

四、妊娠中期七氟醚暴露對胎兒大腦中BAX，BAD，VEGF，PI3K，AKT和p-AKT蛋白水平的影響

Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，高濃度七氟醚組VEGF，PI3K和p-AKT蛋白表達水平低于對照組，但是AKT總蛋白的表達在3組之間差異無統(tǒng)計學意義，與此同時PI3K-AKT信號通路下游的凋亡相關(guān)蛋白BAX和BAD在高濃度組的表達高于對照組和低濃度組，證實妊娠中期暴露于高濃度的七氟醚會降低VEGF，PI3K和p-AKT蛋白水平，抑制EGFR-PI3K-AKT信號通路并誘導凋亡信號通路的活化，促使神經(jīng)干細胞發(fā)生早期凋亡。（圖6）

討 論

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)妊娠中期進行高濃度七氟醚的暴露會降低胎鼠及子代小鼠腦組織中VEGF，PI3K和p-AKT蛋白水平并誘導神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡，從而對子代的神經(jīng)干發(fā)育及認知功能產(chǎn)生負作用，但是對于妊娠期七氟醚暴露造成的中樞功能障礙發(fā)生的具體機制一直不清楚。有學者認為海馬組織中神經(jīng)干細胞數(shù)量的減少是子代動物發(fā)生認知功能障礙發(fā)生的基礎(chǔ)[9-10]。

圖4 熒光顯微鏡下觀察各組妊娠中期七氟醚暴露后胎鼠大腦神經(jīng)細胞（Nestin和TUNEL免疫熒光雙標染色，×400）

圖5 熒光顯微鏡下觀察出生后各組七氟醚暴露后小鼠大腦神經(jīng)細胞（Nestin和TUNEL免疫熒光雙標染色，×400）

表2 不同時間點Nestin和TUNEL染色雙陽性細胞定量分析（± s）

表2 不同時間點Nestin和TUNEL染色雙陽性細胞定量分析（± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05，與低濃度組比較，bP ＜ 0.01

分組 動物數(shù) 6 h 24 h 48 h P 0 P 14 P 28對照組 8 0.91±0.07 0.96±0.04 0.95±0.05 0.97±0.03 0.96±0.03 0.95±0.05低濃度組 8 1.01±0.08 1.09±0.13 1.24±0.11a 1.01±0.09 1.22±0.12a 1.09±0.13高濃度組 8 2.62±0.21ab 2.49±0.17ab 2.51±0.13ab 2.21±0.15ab 1.89±0.14ab 1.69±0.19ab F值 399.00 364.37 524.52 378.31 158.33 66.83 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖6 妊娠中期七氟醚暴露6 h后，免疫印跡檢測胎鼠腦組織中BAX，BAD，VEGF，PI3K，p-AKT和AKT的表達水平

妊娠中期是胚胎神經(jīng)發(fā)育的重要時期，在此期間，大腦中神經(jīng)前體細胞通過增殖、凋亡、遷移和分化逐漸形成海馬組織[11]。因此，在此期間接觸麻醉藥物會影響神經(jīng)干細胞的數(shù)量和功能，從而導致中樞認知功能障礙[12]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在妊娠中期接觸高濃度七氟醚可以使胎兒大腦以及出生后子代的海馬組織中的神經(jīng)干細胞數(shù)量減少，由于神經(jīng)干細胞數(shù)量的減少會影響后續(xù)海馬發(fā)育并導致學習和記憶功能障礙。TUNEL和Nestin的免疫熒光染色顯示高濃度七氟醚所引起神經(jīng)干細胞凋亡作用會持續(xù)到出生后的第14天。這提示保護性或代償性機制可能在出生后第28天能在一定程度上減少凋亡神經(jīng)干細胞的數(shù)量。然而，這種保護機制并不能逆轉(zhuǎn)高濃度七氟醚的神經(jīng)損傷效應。同時本研究觀察到在高濃度七氟醚組中，與七氟醚暴露后的6、24和48 h的胎鼠相比，出生后第0天的幼鼠的細胞凋亡降低，因此推測隨著時間的推移，胎兒會啟動某種類型的補償機制。但是，由于妊娠中期對海馬組織發(fā)育至關(guān)重要，高濃度七氟醚造成的損害仍然存在。

VEGF對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要，由于VEGF介導的血管生成對胚胎發(fā)育非常重要，VEGF的缺失會引發(fā)神經(jīng)干細胞出現(xiàn)凋亡[13-14]。本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，暴露于高濃度七氟醚會下調(diào)胎鼠大腦中的PI3K和p-AKT蛋白水平。既往研究表明，激活PI3K / AKT途徑可減少麻醉誘導的神經(jīng)干細胞凋亡，增強學習和記憶能力，例如采用米諾環(huán)素預處理激活PI3K / AKT途徑以減少因接觸氯胺酮引起的神經(jīng)損傷并改善成年期的行為表現(xiàn)[15]；利用右美沙芬通過激活PI3K / AKT信號通路減少異丙酚誘導的細胞凋亡和認知障礙[16]，綜合以上結(jié)果，認為高濃度七氟醚可通過抑制VEGF / PI3K / AKT通路從而誘導神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，本研究證實：臨床實踐中常用的低濃度七氟醚對神經(jīng)干細胞凋亡或數(shù)量不會造成影響，這表明它可以在妊娠期婦女的手術(shù)中安全的使用，但是，高濃度七氟醚會導致神經(jīng)干細胞發(fā)生凋亡和數(shù)量的減少，從而打破了細胞增殖和細胞死亡之間的平衡，擾亂了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，導致后代的學習和記憶功能出現(xiàn)障礙。因此，應盡量避免在懷孕期間使用高濃度的七氟醚進行麻醉和手術(shù)。