解學(xué)軍 張冰

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的高致死率惡性腦部腫瘤，盡管手術(shù)切除、化療與放療等手段已經(jīng)極大地改善了患者的預(yù)后，但患者的生存期仍然較短[1-2]。預(yù)后較差的主要原因之一是膠質(zhì)瘤細(xì)胞常常會侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，給治療帶來很多困難[3-4]。近年來，大量研究已經(jīng)表明microRNA（miRNA）的異常表達(dá)在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中起到重要作用，miRNA通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，能夠極大地影響腫瘤的增殖與侵襲。

越來越多的研究表明，外泌體在細(xì)胞間起到了重要的通訊作用[5]。外泌體進(jìn)入血液循環(huán)后，其攜帶的miRNA等物質(zhì)會影響癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程[6]。細(xì)胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM1）介導(dǎo)細(xì)胞的接觸抑制作用，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖，因此是一種腫瘤抑制因子[7-8]。研究顯示，miRNA-1246可促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移與侵襲[9]，因此膠質(zhì)瘤的高侵襲性，是由miRNA-1246介導(dǎo)的CADM1表達(dá)水平變化導(dǎo)致。本研究旨在探究血液循環(huán)中膠質(zhì)瘤來源的外泌體，是否通過miRNA-1246作用于CADM1促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖與遷移，為膠質(zhì)瘤的早期診斷與治療提供新的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、實驗材料

1.組織樣本：從赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院2015至2017年住院的惡性膠質(zhì)瘤患者中隨機(jī)挑選30位與健康志愿者中隨機(jī)挑選30位納為本次研究對象。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟、肺功能不全；（2）合并感染、腫瘤、免疫性疾病；（3）合并血液系統(tǒng)疾病。該研究通過了赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者都簽署了知情同意書。所有組織在切除后立即冰凍并保存于-80℃，以備進(jìn)一步實驗。

2.細(xì)胞系：U-118 MG人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（北京北納生物公司）。

3.實驗試劑：DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen公司），外泌體分離試劑（美國Invitrogen公司），雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒，RIPA裂解液，PMSF，BCA蛋白濃度測定試劑盒，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，CCK8試劑盒，cDNA第一鏈合成試劑盒與Trizol（上海碧云天生物公司），CADM1一抗（武漢博士德公司），HRP標(biāo)記的二抗（武漢博士德公司）。

二、實驗方法

1.膠質(zhì)瘤細(xì)胞系培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：U-118 MG細(xì)胞培養(yǎng)于含10﹪胎牛血清與1﹪青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境37 ℃，含5﹪CO2。在細(xì)胞生長至90﹪密度時，以Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑按照操作說明將miRNA-1246模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，每孔加入50 μl培養(yǎng)基稀釋的 2 μl Lipofectamine 2000。

2.外泌體提取與鑒定：使用外泌體分離試劑從人血清中分離外泌體。500 μl血清2 000×g離心30 min 去除雜質(zhì)，吸取 300 μl與 60 μl分離試劑混合，4 ℃孵育30 min，室溫下10 000×g離心10 min，吸棄上清液，加入150 μl PBS重懸，4 ℃保存?zhèn)溆?。外泌體多聚甲醛固定后滴加到銅網(wǎng)上，乙酸雙氧鈾負(fù)染，使用透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)。

3.細(xì)胞侵襲實驗：使用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室測定U-118 MG細(xì)胞的侵襲遷移能力。實驗分為對照組、miRNA-1246抑制劑組與miRNA-1246模擬物組，各組設(shè)6個復(fù)孔。加100 μl無血清培養(yǎng)基細(xì)胞懸液至Transwell上室，600 μl培養(yǎng)基（10﹪血清）加入下室。24 h后取出小室，PBS溶液洗滌后甲醇固定30 min，0.1﹪結(jié)晶紫染色20 min，鏡下觀察。

4.細(xì)胞增殖檢測：使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖。實驗分為對照組、miRNA-1246抑制劑組與miRNA-1246模擬物組，各組設(shè)6個復(fù)孔。U-118 MG細(xì)胞貼壁于96孔板并培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值。

5.Western Blot：在冰上使用RIPA裂解液裂解組織標(biāo)本或U-118MG細(xì)胞，4 ℃條件下12 000×g離心20 min后收集上清液，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度?；旌系鞍着c上樣緩沖液后進(jìn)行SDS- PAGE電泳分離蛋白。隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液封閉，CADM1一抗4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光底物工作液處理后，置于Tanon-5200化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)內(nèi)顯影。使用GAPDH作為內(nèi)參。

6.RNA提取與定量RT-PCR：使用Trizol按照常規(guī)方式提取組織與細(xì)胞或外泌體中的RNA[10]。使用cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈。隨后使用SYBR Green I染料在CFX Connect 熒光定量 PCR檢測系統(tǒng)中進(jìn)行RT-PCR，以GAPDH做歸一化處理。使用2-ΔΔCt法對RNA水平進(jìn)行相對定量。miRNA的熒光定量使用miRNAqRT- PCR系列試劑盒進(jìn)行。引物序列如下：GAPDH上游引 物：5'-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3'，下游：5'-ATCGAGAGAAGGGAGGGCT-3'；CADM1上 游：5'-TCAACACGCCGTACTGTCTG-3'，下游：5'-GTGGGAGGAGGGATAGTTGTG-3'；miRNA-1246：5'-AATGGATTTTTGGAGCAGG-3'。

7.報告基因構(gòu)建與熒光報告實驗：包含CADM1 3'非翻譯區(qū)的報告基因pGL3載體質(zhì)粒由吉瑪基因合成（CADM1-WT）。同時也合成了結(jié)合位點(diǎn)突變的報告基因（CADM1-Mut）。細(xì)胞在24 孔板培養(yǎng)至貼壁后，以100 ng每孔的濃度轉(zhuǎn)染至U-118MG細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染的還有miRNA-1246模擬物和模擬物對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后使用雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光強(qiáng)度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，蛋白水平、RNA水平、侵襲細(xì)胞數(shù)量、450 nm吸光度和熒光強(qiáng)度以表示，兩組間比較采用t檢驗，CADM1蛋白與miRNA-1246含量的關(guān)系采用直線相關(guān)法分析多組間及兩兩比較采用方差分析和SNK-q檢驗，線性回歸分析檢測負(fù)相關(guān)性。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、惡性膠質(zhì)瘤患者血液外泌體中miRNA-1246含量檢測

從患者和健康志愿者血液中提取外泌體并進(jìn)行觀察。透射電子顯微鏡結(jié)果表明，外泌體呈球形，直徑約40 ～ 100 nm（圖1）。隨后使用Western Blot檢測了外泌體的特異性表面標(biāo)志蛋白CD63與HSG101（圖2）。定量RT-PCR檢測外泌體內(nèi)miRNA-1246水平，結(jié)果表明患者來源外泌體內(nèi)miRNA-1246 濃度高于對照組（P＜ 0.05，圖 3）。

圖1 透射電鏡觀察外泌體（×1000）

圖2 Western Blot檢測表面標(biāo)志蛋白CD63與HSG101

圖3 外泌體miRNA-1246水平檢測

二、U-118MG細(xì)胞增殖與侵襲檢測

圖4 普通顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

CCK-8實驗檢測了U-118 MG細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了miRNA-1246模擬物或抑制劑之后增殖能力，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了miRNA-1246模擬物的細(xì)胞增殖能力高于未轉(zhuǎn)染的對照組；相反，轉(zhuǎn)染抑制劑之后細(xì)胞增殖能力則降低（P＜ 0.01，表 1）。Transwell實驗結(jié)果也表明，miRNA-1246模擬物會提高U-118 MG細(xì)胞侵襲能力，miRNA-1246抑制劑則相反（P＜ 0.01，圖 4，表 1）。

表1 U-118 MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染后侵襲數(shù)量與CCK-8實驗（x± s）

三、熒光素酶報告實驗檢測

使用熒光素酶報告實驗檢測miRNA-1246是否作用于CADM1。將CADM1-WT或CADM1-Mut轉(zhuǎn)染至事先轉(zhuǎn)染了miRNA-1246模擬物或模擬物對照組的U-118 MG細(xì)胞48 h后檢測各組的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染CADM1-WT后，miRNA-1246模擬物組的細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度為4.98±1.86，低于miRNA-1246模擬物對照組10.34±2.60（t= 7.235，P= 0.006），而轉(zhuǎn)染了CADM1-Mut的細(xì)胞間比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（miRNA-1246模擬物對照組：9.71±1.62，miRNA-1246模擬物組：9.53±1.47）。為了檢測miRNA-1246是否會影響CADM1的表達(dá)，測定了U-118 MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-1246抑制劑前后CADM1的mRNA和蛋白水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-1246抑制劑后CADM1 mRNA水平?jīng)]有變化，miR-1246抑制劑對照組蛋白含量為1.17±0.11，低 于 miR-1246抑 制 劑 組 1.84±0.15（t= 11.68，P= 0.014）。

四、膠質(zhì)瘤樣本蛋白與基因水平檢測

檢測了膠質(zhì)瘤樣本與癌旁正常樣本中CADM1蛋白的含量，并研究其與對應(yīng)患者血液外泌體中miRNA-1246含量的關(guān)系。結(jié)果表明，相對于癌旁正常組織1.00±0.26，膠質(zhì)瘤組織中CADM1蛋白含量降低0.48±0.31（P= 0.004）。在膠質(zhì)瘤組織中，CADM1蛋白含量與miRNA-1246水平也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r= -0.88，P＜ 0.05，圖 5）。

圖5 質(zhì)瘤組織中CADM1蛋白含量與外泌體miRNA-1246水平的關(guān)系

討 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見的膠質(zhì)瘤，具有較高侵襲性，導(dǎo)致難以完全手術(shù)切除[11]。外泌體近年來成為研究熱點(diǎn)，許多研究已經(jīng)證明其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體攜帶特異性小分子或RNA，能夠影響其他細(xì)胞的生物學(xué)功能，從而調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)程[12]。miRNA作為一種長度不超過25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能夠參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[13]。研究表明，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中攜帶有各種miRNA，例如，非小細(xì)胞肺癌來源的外泌體攜帶miR-222-3p，會增強(qiáng)癌癥耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞的遷移侵襲能力[14]。miRNA-1246是一種促癌因子，研究表明其能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力[15]。結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的囊泡含有miRNA-1246，能夠促進(jìn)腫瘤部位的血管生成[16]。本研究通過實驗探究了膠質(zhì)瘤細(xì)胞外泌體中的miRNA-1246是否能夠抑制CADM1從而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖與侵襲活性，影響惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)展。

首先分離并分析了膠質(zhì)瘤患者與正常人血液的外泌體，RT-PCR結(jié)果證明了患者來源的外泌體包含有更多的miRNA-1246。隨后筆者用星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-118 MG進(jìn)行體外實驗。在U-118 MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-1246模擬物或者抑制劑后，使用Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell實驗檢驗其侵襲能力，結(jié)果表明miRNA-1246能夠增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，而抑制miRNA-1246后，細(xì)胞的侵襲能力減弱。CCK-8實驗結(jié)果也表明，miRNA-1246增強(qiáng)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性，抑制后則相反。為了驗證miRNA-1246作用于CADM1的機(jī)制，筆者進(jìn)行了熒光素酶報告基因?qū)嶒?，結(jié)果表明miRNA-1246能夠作用于CADM1的3'非翻譯區(qū)，從而抑制CADM1蛋白的表達(dá)。由于CADM1介導(dǎo)了細(xì)胞的接觸抑制作用，抑制了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖，因此CADM1蛋白表達(dá)被抑制后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移。隨后對膠質(zhì)瘤樣本的檢測也進(jìn)一步證明，患者膠質(zhì)瘤組織內(nèi)CADM1蛋白含量降低，與對應(yīng)的外泌體內(nèi)miRNA-1246含量成反比。

本文的研究證明，惡性星形膠質(zhì)瘤分泌的外泌體中miRNA-1246含量增多，其可作用于CADM1 mRNA的3'非翻譯端，抑制了CADM1蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)了惡性星形膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的早期診斷與治療提供新的靶點(diǎn)。