陳雪晴 周迎春

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致心腦血管疾病最重要的危險因素，但其發(fā)病機制尚不完全清楚。各種危險因素（如高脂血癥、高血壓病和糖尿病等）導致動脈內(nèi)膜受損時[1]，在活性氧、高血糖和脂多糖等活性因子的刺激下，血管壁產(chǎn)生炎癥反應，導致內(nèi)皮細胞、單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等表面特性發(fā)生改變，釋放大量炎性介質(zhì)和氧化代謝產(chǎn)物，加速AS的發(fā)展。而血管鈣化、斑塊破裂、管腔內(nèi)血栓形成和斑塊內(nèi)出血等則會導致嚴重的心血管事件[2]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有抑制炎癥反應，修復組織損傷的潛能，而各類干細胞技術的發(fā)展則為加速干細胞制劑的臨床應用提供了可能[3-4]。MSCs是人體內(nèi)來源較豐富的一類成體干細胞，廣泛存在于骨髓、脂肪、表皮和血液等組織，易于分離培養(yǎng)[5]；此外，MSCs還具有低免疫原性的特點，同種異體移植不容易引起免疫排斥反應[6-7]。將MSCs應用于AS，移植的MSCs可通過趨化因子梯度遷移至損傷區(qū)域，分化為內(nèi)皮細胞，修復損傷，抑制動脈狹窄的形成[8]。然而體外輸注的MSCs壽命相對短暫，只有少數(shù)會分化形成新的細胞或組織[9]，且分化機制尚不明確，分化過程難以控制；另一方面，血管內(nèi)膜損傷后，骨髓MSCs會歸巢到受損血管局部，分化為血管平滑肌細胞，參與再狹窄或動脈斑塊鈣化的形成，這些瓶頸促使研究者們把目光轉(zhuǎn)向了MSCs的替代治療。

研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠合成、分泌多種生長因子、細胞因子和趨化因子。在動物模型中，盡管體外輸注的MSCs遠離實際損傷部位，但仍可以促進傷口愈合[10]，提示MSCs可通過旁分泌發(fā)揮抗炎、抗凋亡和促進新生血管形成的治療作用[11]。Shabbir等[12]將MSCs注射至倉鼠腿肌腱內(nèi)，采用示蹤技術，雖然未在其它組織中發(fā)現(xiàn)移植細胞，但心肌梗死倉鼠的心室功能得到改善，多種生長因子表達增強，細胞凋亡和心肌纖維化程度減輕，出現(xiàn)心肌再生跡象。

由此，含有多種MSCs自體分泌因子的條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）引起了人們極大興趣。近年來，Timmers等[13]發(fā)現(xiàn)應用間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基（mesenchymal stem cell conditioned medium，MSC-CM）可改善大鼠心肌梗死后的心臟功能。Chen等[14]報道了MSC- CM通過抑制炎癥和保護竇內(nèi)皮細胞來預防放射性肝損傷。Tamari等[15]發(fā)現(xiàn)MSC-CM能夠加速傷口愈合。因此，應用MSC-CM既可避免直接輸注MSCs引起的不良反應，又可發(fā)揮MSCs分泌因子的治療作用。

隨著對MSC-CM的深入研究，越來越多的研究者們把目光轉(zhuǎn)向了MSC-CM對AS的治療作用。本文綜述了應用MSC-CM治療AS的最新進展，希望為深入研究MSC- CM的應用前景提供參考。

一、MSC-CM

MSC-CM是指將MSCs的培養(yǎng)基上清液，直接用于培養(yǎng)其他細胞或作為其他細胞培養(yǎng)基的添加成分，利用MSCs分泌的各類細胞因子達到影響待培養(yǎng)細胞生長、分化和功能發(fā)揮的目的。采用去血清的MSC-CM直接輸注于人體，是擬將MSC-CM用于臨床的新途徑。已有動物實驗證實，從人胎盤組織中提取的MSCs，使用無血清培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)，待細胞生長密度達80﹪時收集的培養(yǎng)基上清液具有穩(wěn)定的治療效果[16]。

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學技術的發(fā)展，MSC-CM的成分也逐漸被闡明[17]，包括各種細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白酶以及微小核糖核酸（microRNA，miRNAs）。這些活性成分促進細胞增殖、促進血管再生和減輕炎癥反應的作用為其臨床應用提供了理論依據(jù)。一方面，輸注含有自體分泌因子的條件培養(yǎng)基可降低移植干細胞帶來的致瘤風險，避開異體移植帶來的免疫相容等問題[18]；另一方面，通過體外干預，控制MSCs分泌因子的成分和含量為將MSC-CM應用于個體化精準治療開拓了新方向。

二、MSC-CM用于AS治療的研究基礎

MSCs是一群中胚層來源的具有自我更新及多向分化潛能的干細胞。在應用MSCs治療AS過程中，一方面，移植的MSCs能夠向血管損傷部位募集，分化為內(nèi)皮細胞，修復損傷；另一方面，MSCs亦可分化為平滑肌細胞，參與血管增生、再狹窄或者斑塊鈣化。AS是一種病因復雜的血管壁慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明，機體內(nèi)環(huán)境、免疫功能強弱、移植細胞量和移植方式等都會影響MSCs治療效果。

在AS模型小鼠中，Yoshimasa等[19]發(fā)現(xiàn)尾靜脈輸注脂肪來源的MSC-CM可以減少小鼠主動脈根部粥樣斑塊的面積，而將MSC-CM作用于內(nèi)皮細胞，可以降低細胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAM）的表達，抑制巨噬細胞募集，減輕單核細胞的黏附作用。Basmaeil等[20]則發(fā)現(xiàn)將胎盤來源的MSC-CM作用于內(nèi)皮細胞可以修復過氧化損傷內(nèi)皮細胞的增殖、分化、以及血管新生功能。而Alshabibi等[21]則發(fā)現(xiàn)蛻膜來源的MSC-CM可以增強內(nèi)皮細胞谷胱甘肽和硫氧還蛋白還原酶的活性，減輕單核細胞對內(nèi)皮細胞的損傷。Doherty等[22]發(fā)現(xiàn)在AS和糖尿病中，MSC-CM具有潛在的抗炎活性。而Frodermann等[23]則報道了輸注MSCs可以降低血中甘油三酯和膽固醇水平，提出使用“泵療法”持續(xù)輸注MSC-CM降低血脂的構想，解決輸注MSCs被攔截在肺、肝、腎的問題。國內(nèi)研究人員采用P3代MSC-CM作用于氧化損傷的肺臟上皮細胞，上皮細胞的凋亡促進基因Bax蛋白表達減弱,凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達增強，提示MSC-CM可以通過抑制細胞凋亡機制，發(fā)揮保護內(nèi)皮細胞免于AS進程中氧化損傷的作用[16]。

Chen等[24]發(fā)現(xiàn)骨髓MSC-CM中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、角質(zhì)細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）、促血管生成素 1（angiopoietin，Ang-1）、基質(zhì)細胞衍生因子（stromal cell-derived factor，SDF-1）、促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）等表達水平提高，提示MSC- CM中存在多種有益血管生長的活性物質(zhì)。Kim等[25]發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞條件培養(yǎng)基含有多種生長因子，具有再生功能，可以保護細胞免受化學物質(zhì)和輻射因素帶來的氧化損傷。在AS的進程中，氧化應激是血管損傷、斑塊形成的主要機制之一，而條件培養(yǎng)基中含有的營養(yǎng)物質(zhì)可以減輕氧化損傷，保護血管。Takanori等[26]證實了牙髓來源的干細胞條件培養(yǎng)基可以促進內(nèi)源性神經(jīng)元祖細胞的遷移和分化，誘導血管再生，改善大腦中動脈閉塞后的缺血性腦損傷，提示在動脈狹窄，缺血缺氧引起的心腦損傷中，條件培養(yǎng)基不僅可以用于治療AS，還可以促進心肌細胞和神經(jīng)元細胞的遷移，改善預后。浙江大學中心實驗室發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSC- CM可以通過阻斷BMP2-Smad1/5/8信號通路抑制血管鈣化[27]，提示MSC-CM可以作為治療AS晚期并發(fā)癥的新靶點。

三、MSC-CM治療AS的機制研究

AS病因復雜，發(fā)病機制尚不完全清楚。在AS起始階段，脂類沉積于內(nèi)膜，持續(xù)的免疫反應導致內(nèi)皮細胞、單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等表面特性發(fā)生改變，釋放大量炎性介質(zhì)和氧化代謝產(chǎn)物。內(nèi)皮細胞表達細胞黏附分子和炎癥介質(zhì)，促使單核細胞黏附于內(nèi)皮細胞，中膜平滑肌細胞遷入內(nèi)膜，單核細胞通過清道夫受體吞噬氧化修飾的低密度脂蛋白，并合成大量細胞外基質(zhì)和活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），形成 AS 斑塊。

隨著AS的發(fā)展，動脈內(nèi)-中膜增厚，管腔中的彌散氧相對不足，引起血管壁缺血、缺氧，進而觸發(fā)內(nèi)皮細胞釋放多種細胞因子，導致細胞增殖、遷移，重塑形成新生毛細血管。而動脈鈣化是晚期AS的并發(fā)癥，是引起心血管事件的重要原因。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨細胞的分化在動脈鈣化中起重要作用，產(chǎn)生的脂蛋白和磷脂復合物會加重血管損傷。衰老、慢性腎病、糖尿病、高血壓和高血脂會加速鈣化過程，減輕血管鈣化可以從根本上減少心血管惡性事件的發(fā)生。AS是多細胞，多因素參與的，伴隨著炎癥反應和內(nèi)皮細胞功能改變的血管損傷性疾病，應用MSC-CM治療AS的機制可以從改善內(nèi)皮細胞功能、抑制炎癥反應和減輕血管鈣化等方面來闡述。

（一）MSC-CM對內(nèi)皮細胞的抗氧化與抗凋亡作用

研究發(fā)現(xiàn)，當移植的MSCs進入機體后，會通過分泌抗炎因子及抗氧化酶類物質(zhì)，減輕炎癥及氧化刺激，從而減輕組織損傷。因此認為MSC-CM同樣可發(fā)揮抗氧化和組織修復能力[28-29]。研究也證實了MSC-CM具有一定的氧自由基清除能力，其抗氧化能力相當于100 μmol/L維生素C[16]。

MSC-CM不僅可通過提高內(nèi)皮細胞谷胱甘肽和硫氧還蛋白還原酶的活性來發(fā)揮抗氧化功能[21]，將MSC-CM作用于氧化損傷的肺上皮細胞，Nrf2-Keap1-ARE信號通路中Nrf2蛋白表達增強，Keap1分子表達減弱，提示MSCCM還可能通過激活Nrf2-Keap1-ARE信號通路發(fā)揮抗氧化作用[16]。

缺氧情況下得到的Akt-MSC條件培養(yǎng)基，可減少大鼠的心肌梗死面積，改善心室功能。其中表達上調(diào)的肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）VEGF、IGF-1等，可抑制低氧誘導的大鼠心肌細胞凋亡，并下調(diào)凋亡促進基因Bax的表達，上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達，提示MSCCM可通過自體細胞因子發(fā)揮抗凋亡作用[30-31]。

持續(xù)高糖環(huán)境可增加血管內(nèi)膜內(nèi)皮細胞的通透性使其易于凋亡[32]，而MSC-CM可通過下調(diào)內(nèi)皮細胞中促細胞通透性的基因，如ALOX5[33]和NPPB[34]的表達，同時上調(diào)抗細胞通透性的基因，如NPR1[35]的表達來逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境誘導的內(nèi)皮細胞凋亡。Xagorari等[36]發(fā)現(xiàn)MSC-CM可以通過激活FGL1來預防急性肝損傷后的肝細胞凋亡，而Huang等[37]則稱MSCs的旁分泌因子可以保護星形膠質(zhì)細胞免于凋亡。

（二）MSC-CM調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能基因的表達

糖尿病，高脂血癥，氧化損傷等會導致內(nèi)皮細胞活性下降、凋亡增多、遷移能力下降、增殖受損、血管新生能力下降和單核細胞浸潤增強等，而這些因素又促進了AS進程。MSC-CM通過旁分泌作用調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能基因的表達，從分子水平直接影響內(nèi)皮細胞功能，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞血管新生能力，減少炎癥細胞浸潤，減緩AS進程。

遷移是早期動脈硬化內(nèi)皮細胞損傷的重要標志，也是影響血管新生的初始階段。MSC-CM作用于內(nèi)皮細胞可下調(diào)增殖抑制基因CAV1[38]的表達，同時上調(diào)促增殖基因PLAT[39]和PDGFRA[40]的表達，提示MSC-CM可從分子水平提高內(nèi)皮細胞的生存率。MSC-CM作用于內(nèi)皮細胞后可 上 調(diào) EDN1[41]、PF4[42]、ICAM1[43]，SPHK1[44]等 基 因，而這些基因的表達產(chǎn)物可以促進內(nèi)皮細胞遷移。血管新生通常伴隨著細胞因子的趨化作用，將MSC-CM作用于內(nèi)皮細胞，白介素 -6（interleukin，IL-6）[45]、IL-8[46-47]、IL-10[48]、IL-11[49]、PDGF-Rβ[50]等細胞因子的表達增加。在葡萄糖誘導內(nèi)皮細胞損傷后加入MSC-CM，各種抗血管生成基因，包括AGT[50]和COL18A1[51]的表達下調(diào)；多種促血管生成基因，包括 F2R[52]、ICAM1[43,53]、PGF[54]、CCL2[55]的表達上調(diào)，為將MSC-CM應用于改善血管功能打下基礎。

另一方面，MSC-CM 對細胞凋亡（FASLG[56]），損傷（ENG[57]、CX3CL1[58]、F3[59]、THBD[59]、AGTR1[60]）， 炎 癥（IL3[61]、ALOX5[62]、FLT1[63]）也具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，MSC-CM可以逆轉(zhuǎn)葡萄糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷、凋亡并通過提高細胞生存率，促進細胞增殖、遷移和血管生成，降低葡萄糖對內(nèi)皮細胞通透性和單核細胞浸潤的刺激作用來修復葡萄糖誘導的內(nèi)皮細胞功能損傷（圖1）。流行病學調(diào)查顯示，高血脂誘發(fā)的AS人群中多數(shù)伴隨糖尿病，而MSC-CM對葡萄糖損傷的逆轉(zhuǎn)作用為將MSC-CM應用于AS的治療開辟了廣闊的前景。

圖1 MSC-CM逆轉(zhuǎn)葡萄糖對內(nèi)皮細胞功能的影響

（三）MSC-CM減少炎癥細胞的黏附及炎癥因子的表達

在AS中，氧化損傷會帶來持續(xù)性的炎癥反應，而MSC- CM的免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)揮了一定的代償作用。輸注MSC-CM至AS模型小鼠中，體循環(huán)中的單核細胞、巨噬細胞和T細胞的數(shù)量有所降低。

將MSC-CM作用于人主動脈內(nèi)皮細胞（human aortic endothelial cells，HAOECs），MSC-CM 中含有的 HGF 抑制了單核細胞對內(nèi)皮細胞的黏附。HGF可抑制NFκB通路，下調(diào)HAOECs中E-選擇素的表達，同時減弱外周血單核細胞系來源的單核-巨噬細胞（THP-1細胞）對內(nèi)皮細胞的黏附。HGF還可以抑制平滑肌細胞中的JNK通路的活化，抑制脂多糖誘導的血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1）表達，因此JNK（MAPK）和 NFκB 是HGF在內(nèi)皮細胞中發(fā)揮抗炎作用的下游靶點，除了HGF，MSC-CM還含有其他多種細胞因子，包括小分子化合物和細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs)，可能也發(fā)揮一定抗炎作用。

研究發(fā)現(xiàn)，MSC-CM和超濾MSC-CM后得到的EVs可以減少腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）誘導炎癥損傷內(nèi)皮細胞中黏附分子的表達。在TNF-α刺激下，內(nèi)皮細胞中JNK（MAPK）和NFκB信號通路被激活，而MSC- CM和EVs可以抑制JNK（MAPK）和NFκB的磷酸化，逆轉(zhuǎn)TNF-α對內(nèi)皮細胞的損傷。

另一方面，MSC-CM含有的腫瘤生長因子-β（tumor growth factor，TGF-β），IL-27，TNF-α 刺 激基因 6 和 IL-10也發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。MSC-CM中的IGF-1也可以抑制血管壁的炎癥反應，過氧化損傷以及斑塊的形成。然而IGF-1并不能減少VCAM-1和細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1）的表達，因此IGF-1在改善內(nèi)皮細胞功能中發(fā)揮的具體作用及其機制有待進一步研究。

MSC-CM還可增強M2型巨噬細胞活性，并減弱M1型巨噬細胞活性。AS小鼠主動脈弓的冰凍切片染色顯示，在斑塊形成最初4周，以單核細胞聚集為主，而在斑塊形成后，巨噬細胞增殖、聚集進一步加重了炎癥反應。在細胞因子和脂質(zhì)等因素的刺激下，巨噬細胞分化為不同的表型，M1型巨噬細胞分泌促炎細胞因子，M2型巨噬細胞分泌抗炎細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，將MSC-CM作用于刺激后的巨噬細胞，可下調(diào)M1型巨噬細胞表面標記物的表達，如TNF-α，IL-6和Arg-2，同時上調(diào)M2型巨噬細胞表面標記物的表達，如SRA1、MRC1和Arg-1。應用MSC-CM培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細胞，MSC-CM中的HGF通過激活轉(zhuǎn)錄激活因子3（activator of transcriptional，STAT3），抑制 JNK 和 NFκB 通路來調(diào)節(jié)巨噬細胞M1/M2之間的類型轉(zhuǎn)換，減輕炎癥反應。而對脂多糖活化的脾來源巨噬細胞，MSC-EVs可以下調(diào)TNF-α的表達，同時上調(diào)IL-10的表達。MSC-CM對內(nèi)皮細胞和巨噬細胞的影響是不同的，MSC-CM可以促進巨噬細胞對低密度脂蛋白的攝取，卻對內(nèi)皮細胞發(fā)揮保護作用，這可能是其減輕AS的作用機制之一，但闡明其中的具體機制還有待深入研究。

（四）MSC-CM抑制血管鈣化

隨著AS的發(fā)展，冠狀動脈中的鈣沉積，加重了AS斑塊的不穩(wěn)定性，常導致急性冠狀動脈綜合征的發(fā)生。VSMCs向骨（軟骨）細胞的轉(zhuǎn)化及其去分化是血管鈣化的重要環(huán)節(jié)，但其發(fā)生機制尚不明確。MSC-CM通過阻斷BMP2- Smad1/5/8信號通路抑制β-甘油磷酸（glycerol phosphate，β-GP）誘導的血管鈣化，發(fā)揮關鍵性的保護作用[27]。MSC-CM可降低VSMCs中的鈣含量和堿性磷酸酶活性，減少VSMCs表面成骨細胞標志物的表達，如：Msx2、Runx2和骨鈣蛋白（osteocalcin，OC），提示MSC-CM可被用于預防或治療血管鈣化。

炎癥是動脈鈣沉積的關鍵因素，鈣化本身已被確定為活躍的炎癥過程，在不同血管部位（內(nèi)膜，中膜，外膜），不同程度的鈣沉積是AS中非常普遍的現(xiàn)象[64-66]。研究也證實了血管鈣化是多種炎癥因子共同參與的過程：TNF通過促進骨形態(tài)蛋白-2（bone morphogenetic protein，BMP-2）的釋放、增強BMP-2的活性來加速VSMCs中的鈣沉積；IL-1可以增強非組織特異性堿性磷酸酶的活性，而IL-6可以通過抑制基質(zhì)γ羧基谷氨酸蛋白（matrix gamma carboxyglutamic acid protein，MGP）來增強BMP-2的活性。研究發(fā)現(xiàn)，MSC-CM中的TNF-α刺激基因-6，前列腺素E2，吲哚胺-2, 3-雙加氧酶，一氧化氮合酶和IL-10發(fā)揮了抗炎作用。同時MSC-CM下調(diào)了TNF、IL-1和IL-6的表達，這可能也是MSC-CM減輕鈣化的機制之一。而MSC-CM中含有的其他細胞因子，如IGF-1和VEGF可能也在減輕鈣化中發(fā)揮了重要作用。

四、結論

采用不同預處理方法得到的MSC-CM中可能含有不同的細胞因子，如低氧預處理MSCs，可提高MSC-CM中VEGF、IGF-1、HGF 和 Ang-1的含量[67]；以細胞因子預處理MSCs，也可以誘導MSC-CM中活性成分的改變，如VEGF的表達上調(diào)[68]；而采用三維球體技術培養(yǎng)MSCs，可上調(diào) MSC-CM 中趨化因子（CXCR4）、抗癌蛋白（TRAIL、IL- 24、CD82）和抗炎蛋白（TSG-6）的表達[69]。

將MSC-CM作為干細胞治療的替代療法應用于臨床，有助于克服干細胞治療帶來的致瘤隱患?，F(xiàn)階段，應用干細胞治療疾病的前提是干細胞在移植后依然保持其移植前的特性，然而考慮到機體環(huán)境復雜，疾病成因的“土壤學說”，很難確保干細胞在不同土壤中的最終結局。應用條件培養(yǎng)基，不僅過程可控，結果也是可以預期的，并在劑量和給藥方式上有更大的靈活性。然而，輸注MSC-CM確實難以模擬移植MSCs對活性因子持續(xù)、動態(tài)的分泌。此外，條件培養(yǎng)基含有動物血清以及死細胞（凋亡細胞）釋放的蛋白質(zhì)[70]，直接輸注或有一定風險。因此，將MSC-CM治療AS真正用于臨床前，還需要更多的體內(nèi)（體外）實驗探究MSC-CM中具體的活性成分及其作用機制。