鄒慶寶 靳松 黃愛(ài)軍

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是人體內(nèi)重要的多能干細(xì)胞，廣泛存在與骨髓、脂肪和肌腱止點(diǎn)等結(jié)締組織中，除了具有支持造血干細(xì)胞的作用外，還具有對(duì)免疫系統(tǒng)多種細(xì)胞的抑制能力[1]。除此之外，MSC還具有強(qiáng)大的多向分化能力，可以在不同條件下分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞[2]。新近研究顯示，人體內(nèi)的成骨細(xì)胞主要由MSC分化而來(lái)[3]。由于具有體外易于擴(kuò)增、免疫原性低的特點(diǎn)，近年來(lái)MSC已在組織修復(fù)重建、生物醫(yī)學(xué)工程中廣泛使用，具有良好的臨床應(yīng)用前景[4]。

機(jī)械應(yīng)力，特別是牽張應(yīng)力，是影響人體內(nèi)骨骼形成與發(fā)育的關(guān)鍵原因之一，是維持骨組織應(yīng)力平衡的重要因素[5]。近年來(lái)，許多研究已經(jīng)證實(shí)牽張應(yīng)力可以通過(guò)改變MSC基因表達(dá)譜以影響其成骨分化能力，從而參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)的骨修復(fù)與重建平衡，但目前機(jī)制尚未完全闡明[6]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc- RNA）是一種長(zhǎng)度大于200 nt、不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA片段。既往認(rèn)為，非編碼RNA只是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過(guò)程中出現(xiàn)的無(wú)用物質(zhì)，然而新近的研究卻顯示lnc-RNA可以通過(guò)多種方式，參與細(xì)胞中各種功能的調(diào)控[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，lnc-RNA可以參與MSC成骨分化的調(diào)控，但lnc-RNA是否參與了牽張應(yīng)力介導(dǎo)的MSC成骨分化，目前尚沒(méi)有研究[8]。在本研究中，對(duì)牽張應(yīng)力刺激下的MSC成骨分化能力及其lnc-RNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、主要材料與儀器

1.主要材料：DMEM培養(yǎng)基、0.25﹪胰蛋白酶-EDTA（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；CBA蛋白定量試劑盒（康為公司）；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（南京建成公司）；PBS緩沖液、RIPA蛋白提取液、Percoll分離液、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、DEPC水、多聚甲醛溶液（碧云天公司）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、氯化十六烷基吡啶（CPC）、茜素紅染色試劑盒（美國(guó)Sigma公司）； Trizol提取液（美國(guó)Life公司）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA公司）；Affymetrix mRNA+長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜芯片（美國(guó)Life公司）；FlexCell 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)FlexCell公司）；離心 管（15 ml、50 ml）、25 cm2培養(yǎng) 瓶、96 孔板（美 國(guó)Corning公司）；移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

2.儀器：生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)、Nano分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；FlexCell細(xì)胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)（美國(guó)FlexCell公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；Hybridization Oven、Fluidics Station、GeneChip Scanner 3000 （美國(guó)Affymetrix公司）。

二、方法

1.正常MSC體外分離、培養(yǎng)：本研究獲得中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有骨髓捐獻(xiàn)志愿者均知曉本研究操作所具有的全部風(fēng)險(xiǎn)，并簽署知情同意書(shū)。

本研究共募集6名骨髓捐獻(xiàn)正常志愿者，其中男3人、女3人、年齡（25.6±3.4）歲，排除禁忌癥后按照標(biāo)準(zhǔn)方法行骨髓穿刺術(shù)。穿刺成功后抽取骨髓5 ml，加入50 ml離心管中，并加入10 ml PBS緩沖液充分混勻。隨后將稀釋的骨髓樣本用注射器緩慢加入等量Percoll分離液，保持兩者液面穩(wěn)定。以500×g離心10 min，離心后可見(jiàn)兩液相界面有白色膜狀層。用移液器吸取中間白膜層，加入10 ml PBS緩沖液充分混勻，以500×g離心10 min，離心后可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)塊沉淀于離心管底部。用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后以2×106個(gè)/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放置于37 ℃、5﹪CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕搖晃，洗去未貼壁細(xì)胞，加入新的含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80﹪～ 90﹪融合時(shí)，0.25﹪胰蛋白酶-EDTA消化傳代，第3代細(xì)胞用于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。MSC分為應(yīng)力組與非應(yīng)力組，應(yīng)力組為接受應(yīng)力刺激的MSC，無(wú)應(yīng)力組為未接收應(yīng)力刺激的對(duì)照MSC。

2.成骨分化誘導(dǎo)與牽張應(yīng)力刺激：第3代MSC培養(yǎng)達(dá)90﹪融合時(shí)，按上述方法進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)/孔的密度接種于FlexCell 6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10﹪胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松的DMEM），放置于37℃、5﹪CO2環(huán)境下的FlexCell細(xì)胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，牽張應(yīng)力設(shè)置條件為5﹪形變、頻率0.1 Hz、作用時(shí)間為每天4 h。此后每3天全量更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基至相應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

3.茜素紅染色與定量：MSC在牽張應(yīng)力刺激下進(jìn)行成骨誘導(dǎo)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，棄去上清液，用PBS緩沖液輕輕清洗3次，隨后用4﹪多聚甲醛溶液在室溫下孵育固定5 min。棄去多聚甲醛溶液，用PBS緩沖液清洗3次，每孔加入茜素紅染色液2 ml，于室溫下染色10 min。染色完成后加入PBS緩沖液3 ml，于搖床上緩慢清洗5 min（3次），洗去非特異性染色與雜質(zhì)，于倒置相差顯微鏡下拍照記錄。拍照完成后，每孔加入1 ml的氯化十六烷基吡啶萃取液，于搖床上室溫孵育1 h，充分萃取染色。用移液器吸取200 μl萃取液加入96孔板中，于酶標(biāo)儀下測(cè)定吸光度。

4.堿性磷酸酶活性測(cè)定：MSC誘導(dǎo)至10 d后，棄去上清液，用PBS緩沖液輕輕清洗3次每孔加入RIPA蛋白裂解液100 μl，冰上放置30 min。隨后吸取蛋白裂解液，于4℃下以3 000×g離心10 min。按照試劑盒方法配置堿性磷酸酶反應(yīng)液，于96孔板中每孔加入反應(yīng)液100 μl，同時(shí)加入蛋白上清30 μl，37 ℃孵育 15 min。隨后每孔加入顯色液 150 μl，充分混勻后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)吸光度。部分離心后的蛋白上清通過(guò)BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度，對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量。

5.RNA提?。籂繌垜?yīng)力刺激下MSC成骨誘導(dǎo)至第7天，用PBS緩沖液輕輕清洗3次。每孔加入Trizol提取液1 ml，充分混勻后于冰上裂解5 min。將裂解液轉(zhuǎn)移至無(wú)酶EP管中，每管加入三氯甲烷200 μl，劇烈震蕩混勻后靜置 5 min，隨后 3 000×g離心10 min。離心后吸取上層水相液體并轉(zhuǎn)移入新的無(wú)酶EP管中，每管加入等量異丙醇，室溫靜置10 min后于3 000×g離心10 min。離心后可見(jiàn)RNA團(tuán)塊沉淀于EP管底部，棄去上清液，加入75﹪乙醇1 ml充分混勻進(jìn)行洗滌，以1 500×g離心10 min。棄去75﹪乙醇，加入20 μl無(wú)酶滅菌水。于Nanodrop紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)RNA濃度與純度。

6.cDNA逆轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法，取無(wú)酶 EP 管，每管加入逆轉(zhuǎn)錄試劑 2 μl、RNA 8 μl，于PCR儀中以37 ℃孵育15 min。逆轉(zhuǎn)錄后cDNA加入40 μl DEPC水進(jìn)行稀釋備用。

7.表達(dá)譜芯片檢測(cè)：逆轉(zhuǎn)錄完成的cDNA經(jīng)過(guò)標(biāo)記、芯片雜交、清洗、染色、掃描，收集數(shù)據(jù)后采用AGCC等軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)方法按照既往文獻(xiàn)報(bào)道方案進(jìn)行[8]。實(shí)驗(yàn)完成后使用Agilent Feature Extraction（v10.7）軟件對(duì)雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)，然后使用 Agilent GeneSpring 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析。

8.生物信息學(xué)分析：對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行 KEGG（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）信息學(xué)分析匯總，篩查差異表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路。根據(jù)序列相似性和表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定lnc-RNA與mRNA共表達(dá)子集。通過(guò)NCBI-Blast程序比對(duì)共表達(dá)子集的lnc-RNA和mRNA的序列相關(guān)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，茜素紅定量、堿性磷酸酶活性結(jié)果以表示，成骨 0天、14天應(yīng)力組與無(wú)應(yīng)力組的茜素紅定量、堿性磷酸酶定量結(jié)果采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、牽張應(yīng)力促進(jìn)MSC成骨分化

將MSC接種于膠原I孵育的6孔板中，置于FlexCell細(xì)胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)，在5﹪形變、0.1 Hz、4 h/d條件下進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)力刺激下的MSC在成骨誘導(dǎo)第10天堿性磷酸酶活性達(dá)（265.3±31.2） U/L，而無(wú)應(yīng)力組MSC成骨誘導(dǎo)第10天堿性磷酸酶活性僅為（121.2±21.2） U/L，應(yīng)力組高于無(wú)應(yīng)力組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。此外，成骨誘導(dǎo)第14天應(yīng)力組MSC茜素紅染色較無(wú)應(yīng)力組MSC加深，應(yīng)力組MSC茜素紅定量OD值達(dá)1.46±0.19，無(wú)應(yīng)力組MSC茜素紅定量為0.62±0.08，應(yīng)力組高于無(wú)應(yīng)力組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。這提示牽張應(yīng)力可以促進(jìn)MSC成骨分化（圖 1）。

圖1 應(yīng)力刺激下MSC成骨分化能力觀察（茜素紅染色，×40）

二、牽張應(yīng)力刺激下MSC成骨分化mRNA和lnc-RNA表達(dá)譜

在成骨誘導(dǎo)第7天，分別提取無(wú)應(yīng)力組與應(yīng)力刺激組MSC的RNA進(jìn)行全基因組mRNA+lnc-RNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的mRNA共有598個(gè)，其中上調(diào)的mRNA有313個(gè)、下調(diào)的mRNA有285個(gè)（圖2A），差異表達(dá)的前5 位的mRNA詳見(jiàn)表1。此外，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的lnc-RNA有329個(gè)，其中上調(diào)lnc-RNA有151個(gè)，下調(diào)的lnc-RNA有178個(gè)（圖2B），差異表達(dá)的前5位的lnc-RNA詳見(jiàn)表2。對(duì)差異表達(dá)的lnc-RNA進(jìn)行分類，其中基因間lnc-RNA有92個(gè)、內(nèi)含子lnc-RNA有64個(gè)、正義鏈lnc-RNA有84個(gè)、反義鏈lnc-RNA有61個(gè)，雙向lnc-RNA有28個(gè)。這些結(jié)果提示應(yīng)力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，從而影響其成骨分化能力。

表1 差異表達(dá)的前5位的mRNA

表2 差異表達(dá)的前5位的lnc-RNA

三、差異mRNA和Lnc-RNA的生物信息學(xué)分析

為了探討差異mRNA相關(guān)的信號(hào)通路及其對(duì)應(yīng)功能，進(jìn)行KEGG生物信息學(xué)分析。通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)信號(hào)通路的表達(dá)變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為WNT/β信號(hào)通路、Cytokine-Cytokine receptor信號(hào) 通路、Cell Cycle信號(hào) 通 路、Focal Adhesion信號(hào)通路和Lipoic acid metabolism 信號(hào)通路。WNT信號(hào)通路是差異表達(dá)最顯著的信號(hào)通路，共有11個(gè)差異表達(dá)基因，其中WNT5a上調(diào)最為明顯（6.74倍）（表 3）。

圖2 應(yīng)力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表達(dá)譜

為了探討WNT5a表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，以WNT5a的表達(dá)和序列為基礎(chǔ)，與差異表達(dá)的329個(gè)lnc-RNA進(jìn)行共表達(dá)相關(guān)性分析和序列比對(duì)分析。通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)差異表達(dá)的lnc-RNA與WNT5a具有共表達(dá)相關(guān)性，分別為 ENSG00000237298.2、ENSG00000241956.5 和ENSG00000187229.3（表4）；通過(guò)序列對(duì)比分析，結(jié)果提示ENSG00000237298.2序列中與WNT5a的編碼序列有部分結(jié)合位點(diǎn)，提示W(wǎng)NT5a可能是受到ENSG00000237298.2表達(dá)調(diào)控的靶基因，將ENSG00000237298.2命 名 為lnc-RNA-SSR（long non-coding RNA Strain Stimulation Related）。 這 些結(jié)果提示在應(yīng)力刺激下，lnc-RNA-SSR的表達(dá)增加，從而上調(diào)WNT5a表達(dá)、促進(jìn)MSC成骨分化。

表3 KEGG分析差異表達(dá)信號(hào)通路

表4 與WNT5a共表達(dá)的lnc-RNA分析

討 論

1974年，國(guó)外學(xué)者Friedenstein等[9]首次證實(shí)在骨髓微環(huán)境中存在成纖維細(xì)胞樣、長(zhǎng)梭型細(xì)胞，并將其命名為間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），這些細(xì)胞作為骨髓微環(huán)境壁龕細(xì)胞，具有支持造血干細(xì)胞的重要功能。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，MSC廣泛存在于人體多種組織中，除了在骨髓中含量豐富之外，還存在于脂肪、臍帶等多種結(jié)締組織和外周血循環(huán)中[1]。新近研究顯示，MSC不僅具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力和較低的免疫原性，還具有多項(xiàng)分化的功能，可以分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。近年來(lái)，一系列的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，MSC是人體內(nèi)成骨細(xì)胞的主要來(lái)源[3]。MSC強(qiáng)大的成骨分化功能使其可以廣泛應(yīng)用于骨折修復(fù)、損傷重建等組織再生工程中，具有廣泛的應(yīng)用前景[4]。

機(jī)械應(yīng)力是一種廣泛存在于人體中的物理刺激信號(hào)，而牽張應(yīng)力是其中最重要的一類機(jī)械應(yīng)力刺激。牽張應(yīng)力存在于所有細(xì)胞微環(huán)境中，主要由肌肉產(chǎn)生并直接作用于骨骼，直接對(duì)骨骼相關(guān)細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等功能產(chǎn)生重要影響，從而影響局部骨組織骨量[10]。當(dāng)人體處于低牽張應(yīng)力情況下（失重、長(zhǎng)期臥床），則會(huì)導(dǎo)致骨量降低；而當(dāng)人體處于高牽張應(yīng)力、骨組織載荷增加情況下（運(yùn)動(dòng)員），則會(huì)增加機(jī)體骨量[11]。這主要是由于牽張應(yīng)力影響MSC成骨分化所決定的。MSC的成骨分化能力受到環(huán)境刺激、炎癥因子等多種因素的影響。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)增加牽張應(yīng)力刺激可以促進(jìn)MSC成骨分化，牽張應(yīng)力預(yù)刺激下MSC移植后組織修復(fù)能力增強(qiáng)，大大提高了其在組織工程修復(fù)中的作用[12]。進(jìn)一步深入探討牽張應(yīng)力刺激調(diào)控MSC成骨分化功能的機(jī)制，對(duì)于推動(dòng)MSC臨床應(yīng)用意義重大。

在本研究中，通過(guò)茜素紅和堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)5﹪形變、0.1 Hz、4 h/d條件下?tīng)繌垜?yīng)力刺激可以促進(jìn)MSC的成骨分化能力，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[12]。此外，筆者也對(duì)不同牽張應(yīng)力刺激條件進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)過(guò)強(qiáng)的牽張應(yīng)力刺激會(huì)大量誘導(dǎo)MSC凋亡，從而影響其成骨分化。這與臨床觀察中，適當(dāng)?shù)膽?yīng)力或受力可以促進(jìn)骨折愈合，但是過(guò)大過(guò)強(qiáng)的應(yīng)力刺激則會(huì)導(dǎo)致骨折延遲愈合的現(xiàn)象一致。此外，筆者進(jìn)一步對(duì)成骨誘導(dǎo)分化后、牽張應(yīng)力刺激下的MSC進(jìn)行全基因組表達(dá)譜芯片分析。經(jīng)過(guò)分析，共發(fā)現(xiàn)對(duì)比無(wú)應(yīng)力組，牽張應(yīng)力刺激下MSC共有598個(gè)基因差異表達(dá)，其中上調(diào)的有313個(gè)、下調(diào)285個(gè)。筆者進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因匯聚后共有5個(gè)信號(hào)通路存在異常表達(dá)，分別為WNT信號(hào)通路、Cytokine-Cytokine receptor信號(hào)通路、Cell Cycle信號(hào)通路、Focal Adhesion信號(hào)通路和Lipoic acid metabolism 信號(hào)通路，提示這些信號(hào)通路是牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化能力增強(qiáng)的關(guān)鍵。

WNT信號(hào)通路是介導(dǎo)MSC成骨分化的重要通路之一。已有研究證實(shí)，WNT信號(hào)通路激活可以促進(jìn)MSC成骨分化[13]。WNT5a是WNT家族的一員，作為外分泌分子，WNT5a主要發(fā)揮激活WNT通路的作用，廣泛調(diào)控機(jī)體內(nèi)的多種細(xì)胞，參與組織發(fā)育、腫瘤生長(zhǎng)等多種生理和病理過(guò)程[14]。既往已有研究提示W(wǎng)NT5a可以促進(jìn)MSC成骨分化[12]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)WNT5a上調(diào)達(dá)6.74倍，為差異表達(dá)倍數(shù)最明顯的第二位基因。筆者推測(cè)，牽張應(yīng)力刺激導(dǎo)致MSC自分泌WNT5a增加，從而激活WNT信號(hào)通路，導(dǎo)致MSC成骨分化能力增強(qiáng)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，是一種長(zhǎng)度大于200 nt、不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA片段。lnc-RNA包括基因間、內(nèi)含子等多種類型，存在于細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中，可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種細(xì)胞的功能[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)lnc-RNA對(duì)MSC成骨分化的功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[8]，但在牽張應(yīng)力下MSC的lnc-RNA表達(dá)是否發(fā)生改變、是否參與了對(duì)MSC成骨分化功能的調(diào)控，目前尚未見(jiàn)研究。在本研究中，對(duì)成骨誘導(dǎo)分化后、牽張應(yīng)力刺激下的MSC進(jìn)行l(wèi)nc-RNA表達(dá)譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)牽張應(yīng)力刺激后MSC的lnc-RNA表達(dá)譜發(fā)生差異改變，差異表達(dá)lnc-RNA達(dá)329個(gè)，提示lnc-RNA參與了牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化的過(guò)程。

lnc-RNA可以通過(guò)多種方式參與基因表達(dá)調(diào)控，但是發(fā)揮調(diào)控功能需具備2個(gè)前提：一是lnc-RNA與靶基因具有表達(dá)相關(guān)性，即具有共表達(dá)關(guān)系；二是lnc-RNA需存在與靶基因可能結(jié)合的位點(diǎn)[15]?；谏鲜鰞蓚€(gè)條件，筆者對(duì)以目標(biāo)基因WNT5a作為核心進(jìn)行共表達(dá)分析和序列比對(duì)分析，以進(jìn)一步明確具體調(diào)控牽張應(yīng)力刺激下MSC成骨分化的關(guān)鍵lnc-RNA。本研究發(fā)現(xiàn)lnc-RNASSR在牽張應(yīng)力刺激下上調(diào)達(dá)4.11倍，且其表達(dá)與WNT5a的表達(dá)具有相關(guān)性，這說(shuō)明2個(gè)分子之間存在明顯的表達(dá)聯(lián)系。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)lnc-RNA-SSR與WNT5a編碼序列有部分預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)結(jié)果提示lnc-RNASSR可能與WNT5a的mRNA序列結(jié)合。已有許多研究發(fā)現(xiàn)，lnc-RNA可與基因的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行結(jié)合，對(duì)其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后修飾與調(diào)控作用，從而影響其表達(dá)水平[15]。筆者推測(cè)，lnc-RNA-SSR可能通過(guò)直接結(jié)合WNT5a編碼序列，以調(diào)控其表達(dá)水平改變，這需要在未來(lái)的研究中通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。此外，本研究雖還發(fā)現(xiàn)ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3與WNT5a有共表達(dá)關(guān)系，但由于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)提示二者之間不存在結(jié)合位點(diǎn)，提示 ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3僅僅是成骨過(guò)程中伴隨出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本，不對(duì)WNT5a進(jìn)行調(diào)控。

綜上所述，在本研究中進(jìn)一步證實(shí)牽張應(yīng)力刺激下MSC的lnc-RNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)明顯變化、成骨分化能力顯著增強(qiáng)。這可能是由于lnc-RNA-SSR表達(dá)上調(diào)，通過(guò)特異性調(diào)控WNT5a自分泌增加，從而介導(dǎo)WNT信號(hào)通路激活，最終導(dǎo)致MSC成骨分化增強(qiáng)。本研究探索了lnc-RNA表達(dá)譜在牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化中的作用，對(duì)于促進(jìn)MSC特異性分化及在組織再生工程中的應(yīng)用，具有重要意義。然而，本研究尚有不足，具體lnc-RNA-SSR調(diào)控WNT5a表達(dá)及WNT信號(hào)通路激活的機(jī)制尚未完全闡明，仍需要再未來(lái)的研究中進(jìn)一步探索。