黃強　周梁

喉癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一，且隨著生活環(huán)境以及生活方式的改變，發(fā)病率有逐年上升趨勢[1]，也是唯一一個5年生存率不升反降的腫瘤類型[2]。吸煙、飲酒的人群罹患喉癌的風(fēng)險比不吸煙、不飲酒的人群高數(shù)倍[3]。喉癌早期癥狀隱匿，發(fā)現(xiàn)時60%的患者已進入進展期[1]，故早期診斷和治療喉癌是臨床的重中之重。相關(guān)研究[4]表明：基質(zhì)金屬蛋白酶2(metal matrix proteinase-2, MMP-2)介導(dǎo)喉癌細(xì)胞的間質(zhì)遷移以及浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為，在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。本研究系統(tǒng)評價MMP-2在喉癌中的表達(dá)及其臨床意義，以期能給基礎(chǔ)和臨床研究提供證據(jù)支撐。

1　資料與方法

1.1檢索策略通過中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方、維普、Pubmed、Web of science等國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫以“基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、明膠酶2(matrix metalloproteinase-2)、喉癌(laryngeal carcinoma)、喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)、喉腫瘤(laryngeal cancer)”等檢索詞進行計算機檢索，收集關(guān)于MMP-2在喉癌中表達(dá)及其意義的文獻，時間跨度為建庫后到2017年1月，輔以手工檢索參考文獻。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)①國內(nèi)外公開發(fā)表的關(guān)于MMP-2在喉癌中表達(dá)情況的病例-對照研究；②腫瘤組標(biāo)本必須經(jīng)病理驗證為LSCC，對照組標(biāo)本為非腫瘤組織，包括正常黏膜、聲帶息肉以及癌旁安全緣組織；③所有喉癌患者之前未接受任何放、化療以及生物治療等措施；④檢測方法為免疫組織化學(xué)SP(streptavidin-perosidase)法；⑤原始文獻中可提取出優(yōu)勢比(odd ratio,OR)值和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)，或者可通過推導(dǎo)得出。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)①無對照組或者對照組為癌前病變樣本；②樣本含非LSCC以及喉轉(zhuǎn)移癌；③Western印跡等其他檢測方法或非免疫組織化學(xué)SP法；④無免疫組織化學(xué)結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)；⑤綜述、會議論文等文獻；⑥推導(dǎo)不出數(shù)據(jù)以及數(shù)據(jù)信息過少的文獻；⑦重復(fù)發(fā)表的文獻。

1.4篩選、質(zhì)量評價、數(shù)據(jù)提取由2名研究者根據(jù)檢索策略以及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)獨立進行文獻檢索，根據(jù)Lichtenstein質(zhì)量評價表[5]進行質(zhì)量評價。①是否明確納入標(biāo)準(zhǔn)及其基本特征；②是否科學(xué)地設(shè)計試驗；③是否正確處理相關(guān)因素及方法；④是否正確使用統(tǒng)計方法；⑤是否就存在的偏倚進行討論。以上5項指標(biāo)，每項為1分，滿足總分≥3分者認(rèn)為文獻質(zhì)量可靠。進行數(shù)據(jù)提取、整理。主要指標(biāo)為MMP-2在腫瘤組織以及對照組中的表達(dá)差異，次要指標(biāo)包括MMP-2在喉癌不同臨床分期、TNM分期、病理分級、原發(fā)位置以及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移之間的差異。有分歧時由2名研究者

通過討論解決問題，意見不一致的由第三方評定。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用從Cochrane協(xié)作網(wǎng)下載的Review manager 5.3軟件按照Meta分析的要求對結(jié)局指標(biāo)進行合并分析并繪制出森林圖，采用OR值及95%CI為分析統(tǒng)計量，檢驗水平為P=0.05。25%≤I2<50%為存在輕度異質(zhì)性，50%≤I2<75%為存在中度異質(zhì)性，I2≥75%為存在重度異質(zhì)性。各研究結(jié)果間存在異質(zhì)性差異時(P≤0.10，I2≥25%)采用隨機效應(yīng)模型，無異質(zhì)性差異時則采用固定效應(yīng)模型(P>0.10，I2<25%)。

2　結(jié)果

2.1文獻檢索結(jié)果聯(lián)機以及手工檢索共獲得相關(guān)文獻122篇，根據(jù)文獻的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，閱讀摘要排除內(nèi)容不相關(guān)文獻80篇，重復(fù)發(fā)表或綜述6篇，閱讀全文排除無對照組或?qū)φ战M不符要求11篇，樣本含非LSCC及喉轉(zhuǎn)移癌3篇，非免疫組織化學(xué)SP法檢測13篇。共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻9篇[6-14]，其中LSCC組樣本共473例，對照組樣本共245例(圖1)。

圖1.　文獻篩選流程圖

2.2入選文獻的基本特征納入研究的9篇文獻質(zhì)量都較高，包含了LSCC組與對照組MMP-2表達(dá)水平的比較以及MMP-2在LSCC淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移之間的原始數(shù)據(jù)；5篇涉及MMP-2在LSCC不同臨床分期之間的差異比較；4篇涉及MMP-2在LSCC不同TNM分期中的變化；7篇涉及MMP-2在LSCC不同病理分級表達(dá)情況的比較；3篇涉及MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置的表達(dá)差異。文獻質(zhì)量評價詳情、基本特征見表1、2。

表1　Lichtenstein質(zhì)量評價表

表2　納入研究的基本特征(MMP-2表達(dá)陽性率)

注：“/”表示無此項

2.3MMP-2表達(dá)結(jié)果分析

2.3.1MMP-2在LSCC組與對照組中的表達(dá)有關(guān)MMP-2在LSCC組和對照組中的研究共納入9篇文獻，其中LSCC組中MMP-2表達(dá)陽性者359例(75.90%)，對照組中MMP-2表達(dá)陽性者67例(27.35%)。各項研究間存在中度異質(zhì)性(P=0.03，I2=54%)，因此選用隨機效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：LSCC組和對照組在MMP-2表達(dá)水平上的差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義[OR=8.88，95%CI：5.04～15.63，P<0.05](圖2)。

圖2.　MMP-2在LSCC組與對照組中的表達(dá)情況

2.3.2MMP-2在LSCC不同臨床分期中的表達(dá)關(guān)于MMP-2在LSCC不同臨床分期中的研究共納入5篇文獻，其中Ⅰ～Ⅱ期MMP-2表達(dá)陽性者56例(68.29%)，Ⅲ～Ⅳ期MMP-2表達(dá)陽性者111例(85.38%)。各項研究之間不存在異質(zhì)性(P=0.50，I2=0)，據(jù)此選用固定效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：LSCC不同臨床分期中MMP-2的表達(dá)水平差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義[OR=2.76，95%CI：1.39～5.51，P<0.05](圖3)。

圖3.　MMP-2在LSCC不同臨床分期中的表達(dá)情況

2.3.3MMP-2在LSCC不同TNM分期中的表達(dá)關(guān)于MMP-2在LSCC不同TNM分期中的研究共納入4篇文獻，其中T1～T2期MMP-2表達(dá)陽性者52例(61.90%)，T3～T4期MMP-2表達(dá)陽性者95例(83.33%)。各項研究之間不存在異質(zhì)性(P=0.45，I2=0)，據(jù)此選用固定效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：LSCC不同TNM分期中MMP-2的表達(dá)水平差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義[OR=3.46，95%CI：1.72～6.96，P<0.05](圖4)。

圖4.　MMP-2在LSCC不同TNM分期中的表達(dá)情況

2.3.4MMP-2在LSCC有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)關(guān)于MMP-2在LSCC有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的研究共納入9篇文獻，其中淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組MMP-2表達(dá)陽性者190例(87.16%)，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組MMP-2表達(dá)陽性者169例(66.27%)。各項研究之間存在中度異質(zhì)性(P=0.007，I2=62%)，因此選用隨機效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：MMP-2在LSCC淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移的表達(dá)水平上差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義[OR=4.07，95%CI：1.60～10.32，P<0.05](圖5)。

圖5.　MMP-2在LSCC有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)情況

2.3.5MMP-2在LSCC不同病理分級中的表達(dá)關(guān)于MMP-2在LSCC不同病理分級中的研究共納入7篇文獻，其中中低分化組MMP-2表達(dá)陽性者189例(83.26%)，高分化組MMP-2表達(dá)陽性者87例(64.93%)。各項研究之間存在輕度異質(zhì)性(P=0.08，I2=46%)，因此選用隨機效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：MMP-2在LSCC不同病理分級的表達(dá)水平上的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[OR=3.04，95%CI：1.35～6.85，P<0.05](圖6)。

圖6.　MMP-2在LSCC不同病理分級中的表達(dá)情況

2.3.6MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置中的表達(dá)關(guān)于MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置中的研究共納入3篇文獻，其中聲門型組MMP-2表達(dá)陽性者68例(74.73%)，非聲門型組MMP-2表達(dá)陽性者54例(72.97%)。各項研究之間存在中度異質(zhì)性(P=0.14，I2=50%)，因此選用隨機效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置的表達(dá)水平上的差異并不具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義[OR=1.10，95%CI：0.38～3.13，P=0.86](圖7)。

圖7.　MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置中的表達(dá)情況

2.4發(fā)表偏倚通過繪制倒漏斗圖(圖8)發(fā)現(xiàn)所有研究呈倒漏斗狀排列，但并不完全對稱分布。不能排除存在發(fā)表偏倚的可能，需進一步做敏感度分析以驗證結(jié)論是否穩(wěn)健。

圖8.　LSCC組和對照組MMP-2表達(dá)差異的倒漏斗圖

2.5敏感度分析本文研究的主要指標(biāo)是MMP-2在LSCC組和對照組的表達(dá)情況，次要指標(biāo)是MMP-2在LSCC淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移以及不同病理分級中的表達(dá)情況，均有不同程度的異質(zhì)性差異，因此有必要進行敏感度分析以檢驗這3項指標(biāo)的結(jié)論是否受異質(zhì)性差異的影響。通過逐篇剔除納入的文獻，發(fā)現(xiàn)這3項指標(biāo)的結(jié)論并沒有發(fā)生改變，差異仍然具有統(tǒng)計學(xué)意義[OR=8.88，95%CI：5.04～15.63，P<0.05；OR=4.07，95%CI:1.60～10.32，P<0.05；OR=3.04，95%CI:1.35～6.85，P<0.05]。同時通過Stata 13.1軟件進行敏感度分析驗證，結(jié)果顯示：納入的效應(yīng)值基本上在總效應(yīng)值的可信區(qū)間之內(nèi)(圖9～11)，提示異質(zhì)性差異的存在并沒有影響這3項指標(biāo)結(jié)論的穩(wěn)定性，結(jié)果較穩(wěn)健。

圖9.　MMP-2在LSCC組和對照組表達(dá)差異的敏感度分析

圖10.　MMP-2在LSCC淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移中表達(dá)差異的敏感度分析

圖11.　MMP-2在不同病理分級中表達(dá)差異的敏感度分析

3　討論

Meta分析是整合分析眾多具有特定條件研究的一種方法，通過Meta分析可以將眾多小樣本研究整合在一起，達(dá)到擴大樣本含量增強檢驗效能的目的，因此在臨床研究和醫(yī)療決策中扮演重要的角色。本研究利用Meta分析研究MMP-2在LSCC中的表達(dá)及其臨床意義，為了驗證結(jié)論是否穩(wěn)健以及是否受到發(fā)表偏倚等影響，通過倒漏斗圖繪制驗證，逐篇剔除納入文獻以及利用Stata 13.1軟件進行敏感度驗證，均提示即使納入的相關(guān)文獻存在一定的異質(zhì)性以及發(fā)表偏倚，但結(jié)論仍然具有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果可靠。但是受到陰性結(jié)果不發(fā)表、文獻語種限制、樣本量、實驗方法和納入文獻條件限制等問題，不可避免地存在各種偏倚，在一定程度上也會影響Meta分析的結(jié)果，因此尚需增加樣本量及優(yōu)化方案以進一步驗證。

浸潤、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤區(qū)別于良性病變的最顯著特征，亦是造成臨床治療失敗的主要原因之一。MMPs超家族是一組高度同源的蛋白酶類，主要包括MMP-2和MMP-9，參與降解、破壞構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅳ型膠原，而Ⅳ型膠原則是構(gòu)成基底膜的重要組成成分[15]。MMPs超家族(包括MMP-2和MMP-9)以酶原形式分泌，在生理條件下參與胚胎發(fā)育、組織重塑等過程，但在某些病理條件下被金屬蛋白酶組織抑制因子2(TIMP-2)招募到細(xì)胞表面激活而參與炎癥以及腫瘤轉(zhuǎn)移的過程[16]?；啄な翘峁┘?xì)胞結(jié)構(gòu)支撐、營養(yǎng)等的重要結(jié)構(gòu)，也是阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要屏障，其病理性的降解可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞沿著基底膜缺口向間質(zhì)遷移、促進腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]，因此與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。最近有研究[18]發(fā)現(xiàn)：膽管癌細(xì)胞可通過下調(diào)miR-138的表達(dá)水平增強MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而使其增殖遷移以及侵襲能力得到加強。而在人骨肉瘤細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)通過下調(diào)miR-519d的表達(dá)水平增強了MMP的表達(dá)，從而促進了腫瘤的轉(zhuǎn)移[19]。Xu等[20]采用葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1(glucose transporter protein-1, Glut-1)反義核酸技術(shù)轉(zhuǎn)染LSCC細(xì)胞系Hep-2，發(fā)現(xiàn)與腫瘤惡性行為密切相關(guān)的Glut-1與MMP-2共表達(dá)，且Glut-1參與調(diào)控MMP-2的表達(dá)。這提示在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，調(diào)控MMP表達(dá)水平的基因及機制極為復(fù)雜，共同參與了對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而促進了腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲能力。

本研究通過Meta分析發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達(dá)在LSCC組織中增加。林雁等[10]分析了MMP-2在54例腫瘤組織、23例聲帶息肉組織和15例喉部正常組織的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達(dá)在腫瘤組織的表達(dá)水平(72.2%)高于息肉組織(47.8%)和喉部正常組織(40%)，推測MMP-2的表達(dá)與臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度存在相關(guān)性。這與Gou等[21]發(fā)現(xiàn)MMP-2在LSCC組織中高表達(dá)，且MMP-2的高表達(dá)水平是導(dǎo)致LSCC患者預(yù)后較差的因素結(jié)果一致。另外本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2表達(dá)水平在臨床分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化等方面具有緊密的相關(guān)性，均提示MMP-2在LSCC的發(fā)生、發(fā)展、演化中具有重要意義。而MMP-2在LSCC不同原發(fā)部位差異并不顯著的原因，推測可能是由于不同原發(fā)部位的腫瘤產(chǎn)生MMP-2的量無顯著差別所致

總之，本研究采用Meta分析發(fā)現(xiàn)MMP-2在LSCC組織中的表達(dá)增高，且與腫瘤進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化存在相關(guān)性。MMP-2的表達(dá)水平改變可能在LSCC的早期診斷和治療等方面具有重要意義。隨著MMP-2的致癌機制以及在LSCC浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后中具體作用的深入研究，特異性地抑制MMP-2也可能成為一種潛在的LSCC靶向治療策略。

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