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(云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院，　昆明 650201)

在一些被子植物類群中，認為花瓣來源于苞片或者葉片的改變(bracteopetaloidy) ,花瓣狀苞片象真正花瓣一樣行使吸引傳粉者的作用,可是，很少研究在花器官之外(如花瓣狀的苞片)MADS-box直系同源的作用。擬南芥的直系同源MADS-box基因在花瓣狀總苞表達只有在鴿子樹[Davidiainvolucrate(Cornales)][1]和山茱萸中研究過[2]，發(fā)現(xiàn)基因有異位表達的現(xiàn)象。

A-class功能基因的起源至今仍然是個謎。在真雙子葉植物擬南芥中，A功能基因最終演化為APETALA1(AP1),CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)，這3個旁系同源的功能產(chǎn)生了新功能化和亞功能化，分別調(diào)控特定組織器官形態(tài)，即AP1主要是控制花萼和花瓣發(fā)育，由于在ap1突變體中，花萼轉(zhuǎn)變成苞片而花瓣缺失，因此形成的花只有雄蕊和雌雄[3]。同時AP1還控制花分生組織的識別，從柳樹中分離出來的SAP1-1和SAP1-2基因通過擬南芥中異源表達SAP1-1基因可以使擬南芥提前開花，并且每一朵花中花瓣多于4個，而從擬南芥分離出來的AP1或者其它同源基因轉(zhuǎn)化擬南芥的結(jié)果沒有出現(xiàn)這種表型，說明SAP1-1控制花分生組織的識別和花瓣的數(shù)目[4]；而從菠菜中分離出來的AP1基因在花萼中沒有表達，推測AP1基因在菠菜中的功能是不保守的[5]。

圖2　Blastx預測AP1蛋白質(zhì)保守的功能結(jié)構(gòu)域

三白草在開花時植株頂端3片苞片變白而引人注目，更重要的特點是其花沒有花萼和花瓣，是屬于無被花，花器官結(jié)構(gòu)非常簡單，只由雄蕊和心皮組成，而且花非常小。本實驗通過RACE方法克隆三白草的A-ClassAP1基因的cDNA全長；通過RT-PCR研究AP1 MADS-box基因在苞葉變化過程中表達情況。同時對開花時頂端3片苞片變白和三白草花被缺失的原因進行探索，是否也象珙桐(Davidia)和山茱萸(Cornus)中存在基因異位表達的現(xiàn)象。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

無被花的三白草的幼葉，苞葉變白過程中的一半白葉和一半綠葉，苞葉變白過程中的全部白色苞葉，苞葉退白過程中一半白葉和一半退白的綠葉，所采集的三白草材料栽種在云南農(nóng)業(yè)大學后山實驗基地。

1.2　實驗儀器

PCR儀、電泳槽、離心機、振蕩床、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3　RNA的提取

選用Trans Zol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)提取三白草花器官的RNA，嚴格按照試劑盒進行。

1.4　特異性引物設計

3’-RACE CDC Primer

5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 VN-3

AP 1-F 5-ATGGGGAGGGGACGGGT-3

AP 1-R 5-TTTTTAATAACAATGAAAATCATTA-3

1.5　cDNA的合成

5’端RACE按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程進行。PCR反應按程序進行循環(huán)：35的循環(huán)；94 ℃×3 min 30 s，94 ℃×20 s,54 ℃×30 s,72 ℃×1 min，72 ℃×7 min,4 ℃×∞，循環(huán)結(jié)束后，取5μL樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測合成情況。

1.6　電泳檢測，割膠回收目的片段

取5μL的PCR產(chǎn)物進行克隆，克隆方法參照文獻[8]，送北京華大基因公司進行測序。

2　結(jié)果與分析

2.1　RACE的結(jié)果

進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，得到cDNA片段，將其在NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中進行blastx的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)是屬于AP1 MADS-box基因家族。為了進一步研究該基因的功能及表達特性，克隆全長序列。以三白草的mRNA為模板，嚴格按照試劑盒的說明進行全長序列的克隆，以RACE CDC Primer和AP1-F為引物，進行PCR，得到其3’端的序列，其3’端的序列與5’端的序列拼接，然后進一步克隆得到1 076 bpAP1 MADS-box全長cDNA(如圖1)，包含有完整的編碼框736 bp。

圖1　AP1全長基因的克隆

2.2　序列比對

將推測的氨基酸序列在美國國家生物技術信息中心NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進行BLAST搜索，分析表明，其編碼的蛋白質(zhì)與多種植物的AP1蛋白具有很高的同源性。具有保守的MADS-box和K-box結(jié)構(gòu)域，如圖2。

圖3　AP1基因的序列

圖4　AP1蛋白質(zhì)C末端結(jié)構(gòu)域的比較

2.3　序列分析

通過PCR擴增、轉(zhuǎn)化并測序，從三白草cDNA中獲得全長序列。序列分析結(jié)果(圖3)表明，該基因cDNA 全長1 076 bp，編碼框為738 bp，編碼245個氨基酸，該基因序列從起始密碼子ATG開始，到終止密碼TAG終止。

從三白草中分離出來的AcAP1基因推定的氨基酸序列C末端結(jié)構(gòu)域與其他物種AP1基因的氨基酸序列比對結(jié)果，顯示AP1氨基酸序列的3’端保守性較低，這是MADS-box基因的典型特征，并在C端不存在單子葉植物APl/SQUA基因所特有的paleoAPl(LPPWML)結(jié)構(gòu)域，也不具有與被子植物基部相對保守的MPWWML基序，而是MLAWLL基序，只具有部分保守的M--W-L結(jié)構(gòu)域，如圖4。

2.4　AP1基因在花瓣狀苞葉中的表達

AP1基因在苞葉顏色變化過程中，苞葉全部變成白色和退白過程中一半是白色的苞葉中表達量最高，如圖5中條帶4和條帶5；而在幼葉中幾乎沒有表達量，如圖5中條帶1；在苞葉變白過程中的一半是葉綠色，一半是白色的苞葉以及退白部分的表達量近似，如2,3條帶和6條帶。所以在全白和退白的這部分白葉片中表達量最高。

圖5　AP1基因在苞葉中的表達