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        三白草APETALA1基因的克隆和在苞葉中的表達

        2018-03-31 05:50:00,,
        種子 2018年3期
        關鍵詞:苞葉苞片擬南芥

        , , 

        (云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院, 昆明 650201)

        在一些被子植物類群中,認為花瓣來源于苞片或者葉片的改變(bracteopetaloidy) ,花瓣狀苞片象真正花瓣一樣行使吸引傳粉者的作用,可是,很少研究在花器官之外(如花瓣狀的苞片)MADS-box直系同源的作用。擬南芥的直系同源MADS-box基因在花瓣狀總苞表達只有在鴿子樹[Davidiainvolucrate(Cornales)][1]和山茱萸中研究過[2],發(fā)現(xiàn)基因有異位表達的現(xiàn)象。

        A-class功能基因的起源至今仍然是個謎。在真雙子葉植物擬南芥中,A功能基因最終演化為APETALA1(AP1),CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL),這3個旁系同源的功能產(chǎn)生了新功能化和亞功能化,分別調(diào)控特定組織器官形態(tài),即AP1主要是控制花萼和花瓣發(fā)育,由于在ap1突變體中,花萼轉(zhuǎn)變成苞片而花瓣缺失,因此形成的花只有雄蕊和雌雄[3]。同時AP1還控制花分生組織的識別,從柳樹中分離出來的SAP1-1和SAP1-2基因通過擬南芥中異源表達SAP1-1基因可以使擬南芥提前開花,并且每一朵花中花瓣多于4個,而從擬南芥分離出來的AP1或者其它同源基因轉(zhuǎn)化擬南芥的結(jié)果沒有出現(xiàn)這種表型,說明SAP1-1控制花分生組織的識別和花瓣的數(shù)目[4];而從菠菜中分離出來的AP1基因在花萼中沒有表達,推測AP1基因在菠菜中的功能是不保守的[5]。

        圖2 Blastx預測AP1蛋白質(zhì)保守的功能結(jié)構(gòu)域

        三白草在開花時植株頂端3片苞片變白而引人注目,更重要的特點是其花沒有花萼和花瓣,是屬于無被花,花器官結(jié)構(gòu)非常簡單,只由雄蕊和心皮組成,而且花非常小。本實驗通過RACE方法克隆三白草的A-ClassAP1基因的cDNA全長;通過RT-PCR研究AP1 MADS-box基因在苞葉變化過程中表達情況。同時對開花時頂端3片苞片變白和三白草花被缺失的原因進行探索,是否也象珙桐(Davidia)和山茱萸(Cornus)中存在基因異位表達的現(xiàn)象。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        無被花的三白草的幼葉,苞葉變白過程中的一半白葉和一半綠葉,苞葉變白過程中的全部白色苞葉,苞葉退白過程中一半白葉和一半退白的綠葉,所采集的三白草材料栽種在云南農(nóng)業(yè)大學后山實驗基地。

        1.2 實驗儀器

        PCR儀、電泳槽、離心機、振蕩床、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱等。

        1.3 RNA的提取

        選用Trans Zol Plant(TransGen Biotech,Beijing,code#ET 121-01)提取三白草花器官的RNA,嚴格按照試劑盒進行。

        1.4 特異性引物設計

        3’-RACE CDC Primer

        5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 VN-3

        AP 1-F 5-ATGGGGAGGGGACGGGT-3

        AP 1-R 5-TTTTTAATAACAATGAAAATCATTA-3

        1.5 cDNA的合成

        5’端RACE按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程進行。PCR反應按程序進行循環(huán):35的循環(huán);94 ℃×3 min 30 s,94 ℃×20 s,54 ℃×30 s,72 ℃×1 min,72 ℃×7 min,4 ℃×∞,循環(huán)結(jié)束后,取5μL樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳,檢測合成情況。

        1.6 電泳檢測,割膠回收目的片段

        取5μL的PCR產(chǎn)物進行克隆,克隆方法參照文獻[8],送北京華大基因公司進行測序。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 RACE的結(jié)果

        進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成,得到cDNA片段,將其在NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中進行blastx的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)是屬于AP1 MADS-box基因家族。為了進一步研究該基因的功能及表達特性,克隆全長序列。以三白草的mRNA為模板,嚴格按照試劑盒的說明進行全長序列的克隆,以RACE CDC Primer和AP1-F為引物,進行PCR,得到其3’端的序列,其3’端的序列與5’端的序列拼接,然后進一步克隆得到1 076 bpAP1 MADS-box全長cDNA(如圖1),包含有完整的編碼框736 bp。

        圖1 AP1全長基因的克隆

        2.2 序列比對

        將推測的氨基酸序列在美國國家生物技術信息中心NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進行BLAST搜索,分析表明,其編碼的蛋白質(zhì)與多種植物的AP1蛋白具有很高的同源性。具有保守的MADS-box和K-box結(jié)構(gòu)域,如圖2。

        圖3 AP1基因的序列

        圖4 AP1蛋白質(zhì)C末端結(jié)構(gòu)域的比較

        2.3 序列分析

        通過PCR擴增、轉(zhuǎn)化并測序,從三白草cDNA中獲得全長序列。序列分析結(jié)果(圖3)表明,該基因cDNA 全長1 076 bp,編碼框為738 bp,編碼245個氨基酸,該基因序列從起始密碼子ATG開始,到終止密碼TAG終止。

        從三白草中分離出來的AcAP1基因推定的氨基酸序列C末端結(jié)構(gòu)域與其他物種AP1基因的氨基酸序列比對結(jié)果,顯示AP1氨基酸序列的3’端保守性較低,這是MADS-box基因的典型特征,并在C端不存在單子葉植物APl/SQUA基因所特有的paleoAPl(LPPWML)結(jié)構(gòu)域,也不具有與被子植物基部相對保守的MPWWML基序,而是MLAWLL基序,只具有部分保守的M--W-L結(jié)構(gòu)域,如圖4。

        2.4 AP1基因在花瓣狀苞葉中的表達

        AP1基因在苞葉顏色變化過程中,苞葉全部變成白色和退白過程中一半是白色的苞葉中表達量最高,如圖5中條帶4和條帶5;而在幼葉中幾乎沒有表達量,如圖5中條帶1;在苞葉變白過程中的一半是葉綠色,一半是白色的苞葉以及退白部分的表達量近似,如2,3條帶和6條帶。所以在全白和退白的這部分白葉片中表達量最高。

        圖5 AP1基因在苞葉中的表達

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