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(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201)
在一些被子植物類群中,認(rèn)為花瓣來(lái)源于苞片或者葉片的改變(bracteopetaloidy) ,花瓣?duì)畎笳嬲ò暌粯有惺刮齻鞣壅叩淖饔?可是,很少研究在花器官之外(如花瓣?duì)畹陌?MADS-box直系同源的作用。擬南芥的直系同源MADS-box基因在花瓣?duì)羁偘磉_(dá)只有在鴿子樹(shù)[Davidiainvolucrate(Cornales)][1]和山茱萸中研究過(guò)[2],發(fā)現(xiàn)基因有異位表達(dá)的現(xiàn)象。
A-class功能基因的起源至今仍然是個(gè)謎。在真雙子葉植物擬南芥中,A功能基因最終演化為APETALA1(AP1),CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL),這3個(gè)旁系同源的功能產(chǎn)生了新功能化和亞功能化,分別調(diào)控特定組織器官形態(tài),即AP1主要是控制花萼和花瓣發(fā)育,由于在ap1突變體中,花萼轉(zhuǎn)變成苞片而花瓣缺失,因此形成的花只有雄蕊和雌雄[3]。同時(shí)AP1還控制花分生組織的識(shí)別,從柳樹(shù)中分離出來(lái)的SAP1-1和SAP1-2基因通過(guò)擬南芥中異源表達(dá)SAP1-1基因可以使擬南芥提前開(kāi)花,并且每一朵花中花瓣多于4個(gè),而從擬南芥分離出來(lái)的AP1或者其它同源基因轉(zhuǎn)化擬南芥的結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)這種表型,說(shuō)明SAP1-1控制花分生組織的識(shí)別和花瓣的數(shù)目[4];而從菠菜中分離出來(lái)的AP1基因在花萼中沒(méi)有表達(dá),推測(cè)AP1基因在菠菜中的功能是不保守的[5]。
圖2 Blastx預(yù)測(cè)AP1蛋白質(zhì)保守的功能結(jié)構(gòu)域
三白草在開(kāi)花時(shí)植株頂端3片苞片變白而引人注目,更重要的特點(diǎn)是其花沒(méi)有花萼和花瓣,是屬于無(wú)被花,花器官結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單,只由雄蕊和心皮組成,而且花非常小。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RACE方法克隆三白草的A-ClassAP1基因的cDNA全長(zhǎng);通過(guò)RT-PCR研究AP1 MADS-box基因在苞葉變化過(guò)程中表達(dá)情況。同時(shí)對(duì)開(kāi)花時(shí)頂端3片苞片變白和三白草花被缺失的原因進(jìn)行探索,是否也象珙桐(Davidia)和山茱萸(Cornus)中存在基因異位表達(dá)的現(xiàn)象。
無(wú)被花的三白草的幼葉,苞葉變白過(guò)程中的一半白葉和一半綠葉,苞葉變白過(guò)程中的全部白色苞葉,苞葉退白過(guò)程中一半白葉和一半退白的綠葉,所采集的三白草材料栽種在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山實(shí)驗(yàn)基地。
PCR儀、電泳槽、離心機(jī)、振蕩床、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱等。
選用Trans Zol Plant(TransGen Biotech,Beijing,code#ET 121-01)提取三白草花器官的RNA,嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行。
3’-RACE CDC Primer
5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 VN-3
AP 1-F 5-ATGGGGAGGGGACGGGT-3
AP 1-R 5-TTTTTAATAACAATGAAAATCATTA-3
5’端RACE按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程進(jìn)行。PCR反應(yīng)按程序進(jìn)行循環(huán):35的循環(huán);94 ℃×3 min 30 s,94 ℃×20 s,54 ℃×30 s,72 ℃×1 min,72 ℃×7 min,4 ℃×∞,循環(huán)結(jié)束后,取5μL樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳,檢測(cè)合成情況。
取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆,克隆方法參照文獻(xiàn)[8],送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。
進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成,得到cDNA片段,將其在NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中進(jìn)行blastx的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)是屬于AP1 MADS-box基因家族。為了進(jìn)一步研究該基因的功能及表達(dá)特性,克隆全長(zhǎng)序列。以三白草的mRNA為模板,嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行全長(zhǎng)序列的克隆,以RACE CDC Primer和AP1-F為引物,進(jìn)行PCR,得到其3’端的序列,其3’端的序列與5’端的序列拼接,然后進(jìn)一步克隆得到1 076 bpAP1 MADS-box全長(zhǎng)cDNA(如圖1),包含有完整的編碼框736 bp。
圖1 AP1全長(zhǎng)基因的克隆
將推測(cè)的氨基酸序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進(jìn)行BLAST搜索,分析表明,其編碼的蛋白質(zhì)與多種植物的AP1蛋白具有很高的同源性。具有保守的MADS-box和K-box結(jié)構(gòu)域,如圖2。
圖3 AP1基因的序列
圖4 AP1蛋白質(zhì)C末端結(jié)構(gòu)域的比較
通過(guò)PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化并測(cè)序,從三白草cDNA中獲得全長(zhǎng)序列。序列分析結(jié)果(圖3)表明,該基因cDNA 全長(zhǎng)1 076 bp,編碼框?yàn)?38 bp,編碼245個(gè)氨基酸,該基因序列從起始密碼子ATG開(kāi)始,到終止密碼TAG終止。
從三白草中分離出來(lái)的AcAP1基因推定的氨基酸序列C末端結(jié)構(gòu)域與其他物種AP1基因的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果,顯示AP1氨基酸序列的3’端保守性較低,這是MADS-box基因的典型特征,并在C端不存在單子葉植物APl/SQUA基因所特有的paleoAPl(LPPWML)結(jié)構(gòu)域,也不具有與被子植物基部相對(duì)保守的MPWWML基序,而是MLAWLL基序,只具有部分保守的M--W-L結(jié)構(gòu)域,如圖4。
AP1基因在苞葉顏色變化過(guò)程中,苞葉全部變成白色和退白過(guò)程中一半是白色的苞葉中表達(dá)量最高,如圖5中條帶4和條帶5;而在幼葉中幾乎沒(méi)有表達(dá)量,如圖5中條帶1;在苞葉變白過(guò)程中的一半是葉綠色,一半是白色的苞葉以及退白部分的表達(dá)量近似,如2,3條帶和6條帶。所以在全白和退白的這部分白葉片中表達(dá)量最高。
圖5 AP1基因在苞葉中的表達(dá)