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(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，　昆明 650201)

在一些被子植物類群中，認(rèn)為花瓣來(lái)源于苞片或者葉片的改變(bracteopetaloidy) ,花瓣?duì)畎笳嬲ò暌粯有惺刮齻鞣壅叩淖饔?可是，很少研究在花器官之外(如花瓣?duì)畹陌?MADS-box直系同源的作用。擬南芥的直系同源MADS-box基因在花瓣?duì)羁偘磉_(dá)只有在鴿子樹(shù)[Davidiainvolucrate(Cornales)][1]和山茱萸中研究過(guò)[2]，發(fā)現(xiàn)基因有異位表達(dá)的現(xiàn)象。

A-class功能基因的起源至今仍然是個(gè)謎。在真雙子葉植物擬南芥中，A功能基因最終演化為APETALA1(AP1),CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)，這3個(gè)旁系同源的功能產(chǎn)生了新功能化和亞功能化，分別調(diào)控特定組織器官形態(tài)，即AP1主要是控制花萼和花瓣發(fā)育，由于在ap1突變體中，花萼轉(zhuǎn)變成苞片而花瓣缺失，因此形成的花只有雄蕊和雌雄[3]。同時(shí)AP1還控制花分生組織的識(shí)別，從柳樹(shù)中分離出來(lái)的SAP1-1和SAP1-2基因通過(guò)擬南芥中異源表達(dá)SAP1-1基因可以使擬南芥提前開(kāi)花，并且每一朵花中花瓣多于4個(gè)，而從擬南芥分離出來(lái)的AP1或者其它同源基因轉(zhuǎn)化擬南芥的結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)這種表型，說(shuō)明SAP1-1控制花分生組織的識(shí)別和花瓣的數(shù)目[4]；而從菠菜中分離出來(lái)的AP1基因在花萼中沒(méi)有表達(dá)，推測(cè)AP1基因在菠菜中的功能是不保守的[5]。

圖2　Blastx預(yù)測(cè)AP1蛋白質(zhì)保守的功能結(jié)構(gòu)域

三白草在開(kāi)花時(shí)植株頂端3片苞片變白而引人注目，更重要的特點(diǎn)是其花沒(méi)有花萼和花瓣，是屬于無(wú)被花，花器官結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，只由雄蕊和心皮組成，而且花非常小。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RACE方法克隆三白草的A-ClassAP1基因的cDNA全長(zhǎng)；通過(guò)RT-PCR研究AP1 MADS-box基因在苞葉變化過(guò)程中表達(dá)情況。同時(shí)對(duì)開(kāi)花時(shí)頂端3片苞片變白和三白草花被缺失的原因進(jìn)行探索，是否也象珙桐(Davidia)和山茱萸(Cornus)中存在基因異位表達(dá)的現(xiàn)象。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

無(wú)被花的三白草的幼葉，苞葉變白過(guò)程中的一半白葉和一半綠葉，苞葉變白過(guò)程中的全部白色苞葉，苞葉退白過(guò)程中一半白葉和一半退白的綠葉，所采集的三白草材料栽種在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山實(shí)驗(yàn)基地。

1.2　實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀、電泳槽、離心機(jī)、振蕩床、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3　RNA的提取

選用Trans Zol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)提取三白草花器官的RNA，嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行。

1.4　特異性引物設(shè)計(jì)

3’-RACE CDC Primer

5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 VN-3

AP 1-F 5-ATGGGGAGGGGACGGGT-3

AP 1-R 5-TTTTTAATAACAATGAAAATCATTA-3

1.5　cDNA的合成

5’端RACE按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程進(jìn)行。PCR反應(yīng)按程序進(jìn)行循環(huán)：35的循環(huán)；94 ℃×3 min 30 s，94 ℃×20 s,54 ℃×30 s,72 ℃×1 min，72 ℃×7 min,4 ℃×∞，循環(huán)結(jié)束后，取5μL樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)合成情況。

1.6　電泳檢測(cè)，割膠回收目的片段

取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，克隆方法參照文獻(xiàn)[8]，送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

2　結(jié)果與分析

2.1　RACE的結(jié)果

進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，得到cDNA片段，將其在NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中進(jìn)行blastx的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)是屬于AP1 MADS-box基因家族。為了進(jìn)一步研究該基因的功能及表達(dá)特性，克隆全長(zhǎng)序列。以三白草的mRNA為模板，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行全長(zhǎng)序列的克隆，以RACE CDC Primer和AP1-F為引物，進(jìn)行PCR，得到其3’端的序列，其3’端的序列與5’端的序列拼接，然后進(jìn)一步克隆得到1 076 bpAP1 MADS-box全長(zhǎng)cDNA(如圖1)，包含有完整的編碼框736 bp。

圖1　AP1全長(zhǎng)基因的克隆

2.2　序列比對(duì)

將推測(cè)的氨基酸序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進(jìn)行BLAST搜索，分析表明，其編碼的蛋白質(zhì)與多種植物的AP1蛋白具有很高的同源性。具有保守的MADS-box和K-box結(jié)構(gòu)域，如圖2。

圖3　AP1基因的序列

圖4　AP1蛋白質(zhì)C末端結(jié)構(gòu)域的比較

2.3　序列分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化并測(cè)序，從三白草cDNA中獲得全長(zhǎng)序列。序列分析結(jié)果(圖3)表明，該基因cDNA 全長(zhǎng)1 076 bp，編碼框?yàn)?38 bp，編碼245個(gè)氨基酸，該基因序列從起始密碼子ATG開(kāi)始，到終止密碼TAG終止。

從三白草中分離出來(lái)的AcAP1基因推定的氨基酸序列C末端結(jié)構(gòu)域與其他物種AP1基因的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，顯示AP1氨基酸序列的3’端保守性較低，這是MADS-box基因的典型特征，并在C端不存在單子葉植物APl/SQUA基因所特有的paleoAPl(LPPWML)結(jié)構(gòu)域，也不具有與被子植物基部相對(duì)保守的MPWWML基序，而是MLAWLL基序，只具有部分保守的M--W-L結(jié)構(gòu)域，如圖4。

2.4　AP1基因在花瓣?duì)畎~中的表達(dá)

AP1基因在苞葉顏色變化過(guò)程中，苞葉全部變成白色和退白過(guò)程中一半是白色的苞葉中表達(dá)量最高，如圖5中條帶4和條帶5；而在幼葉中幾乎沒(méi)有表達(dá)量，如圖5中條帶1；在苞葉變白過(guò)程中的一半是葉綠色，一半是白色的苞葉以及退白部分的表達(dá)量近似，如2,3條帶和6條帶。所以在全白和退白的這部分白葉片中表達(dá)量最高。

圖5　AP1基因在苞葉中的表達(dá)