張 杰, 高 波

0 引 言

正常人皮膚成纖維細胞(human skin fibroblast，HSF)長期暴露在氧化應(yīng)激條件下，可以被氧化應(yīng)激誘導(dǎo)出現(xiàn)衰老、形態(tài)改變、G1期停滯以及許多調(diào)控衰老靶基因的表達水平改變等標(biāo)記[1-2]。紫外線長期照射皮膚可以發(fā)生氧化應(yīng)激類的光損傷，這種光損傷在細胞衰老、皮膚老化的過程中發(fā)揮著重要的作用，紫外線中波(ultraviolet B,UVB)作為自然環(huán)境中的一種紫外輻射主要作用于皮膚的真皮淺層和表皮層，UVB照射后可以誘導(dǎo)皮膚光老化，導(dǎo)致皮膚變得粗糙、皺紋加深[3]。衰老標(biāo)記蛋白30(senescence marker protein 30,SMP30)是新發(fā)現(xiàn)的一種存在于大腦微粒體中的衰老標(biāo)記蛋白，最早識別于老鼠肝臟，又被稱為鈣調(diào)素，其表達隨著宿主年齡的增加而降低，可能介導(dǎo)延緩衰老的進程[4]。本研究采用不同劑量的UVB照射HSF不同時間，模擬損傷狀態(tài)，觀察HSF細胞生長活性、凋亡率以及SMP30基因表達的變化，探討該基因在UVB導(dǎo)致的皮膚損傷的作用，為闡明氧化應(yīng)激類光損傷機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料HSF (武漢大學(xué)細胞庫)，Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(Promega)；PE7500(ABI公司)；100 bp DNA marker (Fermentas公司)；SYBR GreenⅠ染料(Gene公司)；RG-BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)(Gene公司)； CF-16RX臺式高速冷凍離心機(日立公司)；721紫外分光光度計(北京六一公司)；PCR試劑盒 (上海生物工程有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與UVB處理將細胞凍融復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，融合生長至80%后用1∶1的胰蛋白酶和EDTA進行消化傳代培養(yǎng)。取2～4代生長良好的細胞進行試驗，其余液氮保存。設(shè)置實驗組和對照組，其中經(jīng)過不同劑量UVB(100、200、300 mJ/cm2)處理不同時間(1、2、3 d后)[5]的HSF為實驗組，以未采用UVB照射的HSF為陰性對照組。取生長良好的傳代細胞培養(yǎng)24 h后，收集實驗組和對照組細胞進行HSF細胞生長活性、凋亡率以及SMP30基因表達的檢測。

1.2.2細胞增殖活性的檢測應(yīng)用MTT法檢測。具體方法為：取對數(shù)生長期的細胞約2×103個(約200 μL)的培養(yǎng)液接種到培養(yǎng)板中，24 h后細胞貼壁單層生長約50%～60%孔面積時棄上清，UVB間距30 cm處照射，劑量分別為100、200、300 mJ/cm2，照射時間分別為1、2、3 d。照射結(jié)束后終止培養(yǎng)，棄去上清，每空加二甲亞砜振蕩混勻，測定各孔570 nm處吸光度(A)，計算實驗組和對照組的細胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate, CPIR)。每組實驗重復(fù)5次，計算公式如下：

CPIR=(對照組A-實驗組A/對照組A)×100%

1.2.3流式細胞儀檢測HSF細胞凋亡率UVB照射時間、劑量方法同上。照射完畢后胰蛋白酶消化離心收集細胞約1×106個，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3次，加入FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V 10 μL和結(jié)合緩沖液100 μL，室溫避光10 min，加入碘化丙啶5 uL，混勻后避光染色30 min后用流式細胞儀測定HSF細胞凋亡率。

1.3SMP30基因表達檢測

1.3.1引物合成內(nèi)參β-actin的上游引物: CTC GCG TAC TCT CTC TTT CTG G，下游引物: GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA A，擴增片段334 bp；SMP30的上游引物:CCG TGG ATG CCT TTG ACT AT，下游引物:TCC AAA GCA GCA TGA AGT TG，擴增片段233 bp(上海生物工程有限公司)。

1.3.2RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄收集細胞，按照說明書步驟提取HSF細胞中總RNA，提取的RNA經(jīng)分光光度計測定其純度和濃度后溶于無RNA酶的雙蒸水中，采用A3500逆轉(zhuǎn)試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA 2 μL，25 mmol/L MgCL24 μL，10 mmol/L dNTP混合液 2 μL，10×Buffer 2 μL，Oligo(dT)引物1 μL，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶0.6 μL，Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，用無核酸酶的雙蒸水齊體積至20 μL。短暫離心后置于PCR擴增儀，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min進行逆轉(zhuǎn)錄。用無RNA酶的雙蒸水稀釋逆轉(zhuǎn)的cDNA至100 μL后mRNA擴增或者-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3PCR擴增PCR擴增體系 2mmol/L dNTP 1.5 μL、10×Buffer 3 μL、25mmol/L Mg2+2.4 μL、5 U/uL Taq 0.3 μL、上下游引物各2 μL、10×SYBR-GreenⅠ1 μL、 cDNA 5 μL，用無菌水補齊體積共30 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 60 s共40個循環(huán)；最后一步收集熔點曲線的過程95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min。

1.3.4結(jié)果判斷通過熔點曲線判斷擴增的特異性，然后取5 μL擴增產(chǎn)物與指示buffer混勻后，2%瓊脂糖凝膠進行電泳，120 V電壓電泳1 h，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。在233、334 bp處出現(xiàn)特異性目的條帶。并利用檢測Ct值和擴增效率E，以β-actin mRNA為參照，計算SMP30相對表達量，公式如下：

SMP30 mRNA/β-actin mRNA=(1+Eβ-actin)Ct (β-actin)/ (1+ESMP30)Ct (SMP30)

2 結(jié) 果

2.1不同劑量UVB處理不同時間后對HSF細胞增殖的影響隨著照射時間的延長，CPIR增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著UVB劑量的增加，CPIR增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

組別不同照射時間的CPIR1d2d3d對照組000實驗組 100mJ/cm24.12±0.76*#6.02±1.08#8.38±1.27*# 200mJ/cm27.14±0.84*9.14±1.4411.42±1.51* 300mJ/cm29.52±0.53*#12.37±0.96#14.64±1.05*#與UVB照射2d比較,*P<0.05;與實驗組UVB200mJ/cm2比較,#P<0.05

2.2不同劑量UVB處理不同時間后對HSF細胞凋亡的影響隨著照射時間的延長，細胞凋亡率逐漸增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著UVB劑量的增加，細胞凋亡率逐漸增高(P<0.05)。見表2 。

組別不同照射時間的細胞凋亡率1d2d3d對照組1.96±0.412.81±0.574.01±0.38實驗組 100mJ/cm26.52±1.51*#10.06±1.50#12.06±1.17*# 200mJ/cm29.61±1.14*12.24±1.1914.32±0.86* 300mJ/cm212.06±1.17*#14.18±1.16#16.02±1.32*#與UVB照射2d比較,*P<0.05;與實驗組UVB200mJ/cm2比較,#P<0.05

2.3UVB誘導(dǎo)后SMP30基因表達的變化對照組中SMP30基因的相對表達量為(1.15±0.11)，實驗組中SMP30基因表達量為(0.66±0.19)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.5，P<0.01)。基因表達的電泳見圖1。隨著UVB劑量的增加，實驗組中SMP30基因表達逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著UVB處理時間的延長SMP30基因表達也逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，基因的表達對UVB誘導(dǎo)有著較為明顯的時間依賴性和濃度劑量依賴性。見表3。

1：對照組；2：β-actin；3～5分別為實驗組UVB 100、200、300 mJ/cm2圖1 SMP30基因在實驗組和對照組中的表達電泳圖

組別不同照射時間的基因相對表達量1d2d3d對照組1.08±0.101.18±0.101.20±0.10實驗組 100mJ/cm20.94±0.08#*0.82±0.08#0.69±0.10#* 200mJ/cm20.80±0.11*0.66±0.080.53±0.09* 300mJ/cm20.63±0.12#*0.48±0.08#0.36±0.07*#與UVB照射2d比較,*P<0.05;與實驗組UVB200mJ/cm2比較,#P<0.05

3 討 論

衰老是指在正常生理情況下發(fā)育成熟的個體隨著年齡的增長器官逐漸退行性改變以及生理機能逐漸衰退等生物現(xiàn)象，是內(nèi)源性因素和外源性因素共同作用的結(jié)果[6]。細胞內(nèi)mRNA含量降低是衰老后細胞分子水平的主要改變，作為人體最大器官的皮膚隨著年齡增長也會出現(xiàn)衰老情況，并且研究表明長期的UVB照射可以導(dǎo)致不可逆的慢性光老化曬傷，發(fā)病隱蔽、病程較長，不僅可以造成皮膚的早衰、難治性皮損，還可以誘發(fā)皮膚腫瘤的發(fā)生[7-10]。為研究UVB照射和SMP30基因改變之間的關(guān)系，本文以不同劑量UVB處理不同時間后的HSF為研究對象，研究SMP30基因在模擬損傷狀態(tài)前后基因表達的變化，探討UVB照射在皮膚衰老中的機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著UVB劑量的增加以及照射時間的延長，HSF細胞增殖抑制率及細胞凋亡率逐漸增高，表明HSF在一定劑量UVB照射一定時間后會出現(xiàn)一定的損傷狀態(tài)，比如細胞凋亡、細胞生存率下降等。王懿娜等[2]研究也發(fā)現(xiàn)300 mJ/cm2劑量的UVB照射可以使得HSF細胞進入光損傷狀態(tài)，細胞會出現(xiàn)一系列的氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)，如：細胞周期停滯在G1期、細胞凋亡、SOD活性下降以及氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)物升高等。并且本研究發(fā)現(xiàn)隨著UVB劑量的增加實驗組中SMP30基因表達逐漸降低，基因的表達對UVB誘導(dǎo)有著較為明顯的時間依賴性和濃度劑量依賴性，模擬損傷后的基因表達要明顯低于對照組，這與國內(nèi)的研究結(jié)果一致[11]。SMP30在實驗老鼠中，隨著氧化應(yīng)激水平的逐漸增強，其表達逐漸減弱[12]，并且高表達的SMP30可以抑制與衰老相關(guān)的細胞活性氧ROS和β-半乳糖苷酶的表達[11]，而在小鼠敲除SMP30基因后，促氧化劑水平隨著鼠齡增加而增加[13]，這些研究表明SMP30具有抗細胞衰老的作用，可能正是由于皮膚在遭受UVB這類氧化應(yīng)激時，氧自由基增多聚集，并且引起HSF細胞中調(diào)控皮膚衰老的基因SMP30表達降低，產(chǎn)生一系列不可逆的細胞內(nèi)的氧化損傷，導(dǎo)致皮膚的衰老[14]。

研究表明，大劑量的紫外照射可以引起DNA不可逆的損傷，或者細胞壞死甚至癌變，小劑量的照射可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的光損傷，進而啟動細胞老化過程[15-16]。氧化應(yīng)激損傷在皮膚細胞早衰過程中發(fā)揮著重要作用，并且紫外照射導(dǎo)致的光老化被認為是一種癌前病變[17]，如何有效降低和控制這類損傷，延緩和預(yù)防由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的皮膚衰老是我們后期研究的主要方向，也是課題目前不足之處，但這也為美容醫(yī)學(xué)提供了一個很好的契機。并且進一步研究UVB照射，預(yù)防皮膚腫瘤的發(fā)生也將是我們后期研究的重點。

綜上所述，經(jīng)過不同劑量UVB處理不同時間后，HSF細胞中SMP30表達存在較為明顯的時間依賴性和劑量依賴性，這對了解UVB如何調(diào)控皮膚衰老機制提供一定理論依據(jù)。

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