王江，徐華，謝劍煒

軍事醫(yī)學(xué)研究院 毒物藥物研究所，北京 100850

肉毒神經(jīng)毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）主要由肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生，是已知對人類毒性最強(qiáng)的天然蛋白質(zhì)毒素，能夠引起人和動(dòng)物中毒乃至死亡，對人的半數(shù)致死量（LD50）為0.1～1 ng/kg。天然發(fā)生的食源性肉毒中毒主要是由于罐頭等食品加工生產(chǎn)不當(dāng)引起的，吸毒者創(chuàng)傷性肉毒中毒也處于上升趨勢。同時(shí)，A型肉毒毒素（BoNT/A）和B型肉毒毒素（BoNT/B）已經(jīng)商業(yè)化發(fā)展成為各種局部肌張力障礙、自主神經(jīng)功能障礙和醫(yī)療美容等的治療藥物[1]，治療過程中時(shí)有中毒事件發(fā)生，對其注射液的安全性評價(jià)顯得尤為重要。此外，因其高毒性和易于生產(chǎn)，肉毒毒素成為潛在的生物武器和生物恐怖襲擊戰(zhàn)劑[2]。因此，建立對肉毒毒素快速且靈敏的確證檢測方法具有極其重要的醫(yī)學(xué)和軍事意義。

1 肉毒毒素結(jié)構(gòu)與分類

根據(jù)其抗原屬性（產(chǎn)生毒素的抗原性），可將BoNT分為7個(gè)血清型，即A～G型。人類肉毒中毒主要由A、B、E型引起，偶爾由F型BoNT引起，C型和D型主要引起禽畜和動(dòng)物中毒。BoNT可經(jīng)黏膜表層吸收[3]。7種血清型中，A型毒性最強(qiáng)，其次是B、E、F型。

BoNT從肉毒桿菌中以復(fù)合物的形式釋放，包含各種非毒性的保護(hù)毒素，以免受水解蛋白和胃腸道酸性環(huán)境降解[4]。BoNT的相對分子質(zhì)量（Mr）約為150×103，由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成三維空間結(jié)構(gòu)，BoNT/A是最早確定晶體結(jié)構(gòu)的血清型全毒素[5]。肉毒毒素在內(nèi)源或外源性的蛋白水解酶作用下被切割為重鏈（HC，Mr約為100×103）和輕鏈（LC，Mr約為 50×103）而顯示其毒性[6]。重鏈便于毒素通過內(nèi)吞作用進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，輕鏈作為鋅依賴的金屬蛋白酶，普遍被認(rèn)為是肉毒毒素的毒性部分。輕鏈能夠特異性地酶切可溶性亞酰胺敏感因子吸附蛋白受體（SNAREs），SNARE蛋白家族是神經(jīng)遞質(zhì)釋放所必需的蛋白，能夠催化膜融合，主要包括位于轉(zhuǎn)運(yùn)小泡膜上的VAMP［也稱作突觸小泡蛋白（synaptobrevin）］、位于突觸前膜上的SNAP-25和突觸融合蛋白（syntaxin），以及一些胞質(zhì)蛋白。一個(gè)SNARE蛋白的裂解能阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和相關(guān)神經(jīng)肌肉接頭的失活，最終導(dǎo)致肌肉麻痹[7]。肉毒毒素對其底物具有高度選擇性[8]，A和E型特異性酶切SNAP-25蛋白，B、D、F和G型特異性酶切VAMP蛋白，C型的酶切底物則為突觸融合蛋白和SNAP-25蛋白[9]。盡管肉毒毒素各結(jié)構(gòu)域的作用已知，由離子鍵緊密連接的重鏈和輕鏈分開的機(jī)制仍不清楚[10]。

2 肉毒毒素檢測方法

2.1 小鼠生物試驗(yàn)法（mouse bioassay，MBA）

小鼠生物試驗(yàn)法是公認(rèn)的肉毒毒素檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”，能評估活性毒素的整體功能（例如結(jié)合、轉(zhuǎn)位和水解功能），檢測肉毒毒素的7種血清型。該實(shí)驗(yàn)以小鼠半數(shù)致死量（mouse median lethal dose，MLD50）為基礎(chǔ)，給多組小鼠腹腔注射系列濃度梯度的毒素樣本，以確定當(dāng)半數(shù)小鼠死亡時(shí)的毒素濃度。對于檢測BoNT/A，MBA的靈敏度可達(dá)10 pg/mL，此濃度與1 MLD50/mL一致[11]。盡管該檢測方法靈敏度高，但是存在一定的局限性：每種血清型毒素的檢測都需要1 mL體積的樣品，最理想的狀態(tài)是＞4 mL的樣品量，當(dāng)樣品采自嬰兒糞樣或食物殘留物時(shí)，難以滿足檢測需求；此外，盡管該方法能在24 h內(nèi)得出陽性結(jié)果，但是需要4～5 d確證陰性樣品或低濃度樣品[12]；樣品中存在其他細(xì)菌或微生物時(shí)，也會(huì)對試驗(yàn)造成干擾。由于MBA法用于肉毒毒素檢測存在其局限性，以及提倡減少活體動(dòng)物的使用，許多體外檢測方法迅速發(fā)展起來。

2.2 免疫學(xué)檢測方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） 在過去30年中，ELISA成為最廣泛應(yīng)用于肉毒毒素血清型鑒定和檢測的技術(shù)，該方法以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，夾心免疫分析法是最常見的形式，使用2種毒素特異性的抗體，其中一種作為捕獲抗體，另一種作為檢測抗體。抗肉毒毒素的捕獲抗體與待測樣品結(jié)合，加入酶標(biāo)記的檢測抗體，顯色后在酶標(biāo)儀中檢測比色或發(fā)光信號，產(chǎn)生的信號強(qiáng)度通常與樣品中毒素的量成比例[13]。對ELISA法進(jìn)行改進(jìn)能提高其檢測肉毒毒素的靈敏度，例如采用噬菌體肽庫篩選技術(shù)篩選出的環(huán)肽作為捕獲抗體，抗BoNT/A多克隆抗體作為檢測抗體，采用化學(xué)發(fā)光ELISA法，檢測靈敏度可達(dá)1 pg/mL。近年來，夾心免疫分析法使用高親和力單克隆抗體檢測BoNT/A和BoNT/B，檢測限低于小鼠生物試驗(yàn)法（10 pg/mL）[14]。但是ELISA方法也存在其缺點(diǎn)，例如不能確定毒素是否仍具有功能活性，檢測復(fù)雜臨床樣品時(shí)靈敏度較低，容易發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽性結(jié)果等。

2.2.2 免疫色譜法（immunochromatography assays，ICA） 側(cè)向?qū)游龊椭鶎游鍪敲庖呱V法中的2種方法，二者在檢測速度和便于現(xiàn)場使用方面具有很大的優(yōu)勢。側(cè)向?qū)游鍪且环N便攜式的在硝酸纖維條上反應(yīng)的試紙，將捕獲抗體滴于硝酸纖維支架上，其他的反應(yīng)試劑（例如檢測抗體、緩沖液、控制抗體）干結(jié)到反應(yīng)板上。待測樣品滴到反應(yīng)板（樣品帶）上發(fā)生水合作用，毒素與檢測抗體結(jié)合后從樣品帶遷移到檢測帶被捕獲抗體捕捉。該捕獲步驟使毒素濃縮并與標(biāo)記后的二抗結(jié)合形成復(fù)合物，產(chǎn)生明顯的有色條帶。常見的標(biāo)記如膠體金，能與毒素樣品產(chǎn)生紅色條帶，或是不同顏色的與檢測抗體結(jié)合的乳球[15]。

側(cè)向?qū)游龇治鏊俣瓤烨页杀镜?，是理想的肉毒毒素快速確證方法，但其應(yīng)用仍然存在一定的局限性。首先，側(cè)向?qū)游龅撵`敏度為10～20 ng/mL（具體取決于毒素類型）[16]，與其他快速檢測方法相比仍較低；其次，側(cè)向?qū)游鰞H能提供肉眼可見的定性結(jié)果，無法對毒素進(jìn)行定量。隨著更高親和力的抗體和更好的檢測標(biāo)記物的可實(shí)現(xiàn)，側(cè)向?qū)游龅撵`敏度有望提高。近年的研究表明，采用單一的側(cè)向?qū)游鲈嚰埬軌蛲瑫r(shí)辨別和確證BoNT/A、BoNT/B，表明側(cè)向?qū)游鲈嚰堄型蔀槭称钒踩I(lǐng)域強(qiáng)有力的分析工具[17]。

2.2.3 免疫PCR法（immuno-PCR） 免疫PCR法與ELISA相似，被分析物的檢測是以抗原-抗體復(fù)合物的形式為基礎(chǔ)，結(jié)合抗體的特異性與報(bào)告DNA分子通過PCR擴(kuò)增，發(fā)展出檢測BoNT較為靈敏的方法。該法使用的檢測抗體是與報(bào)告DNA分子結(jié)合的抗體，而不是一種酶。DNA分子與毒素特異性檢測抗體結(jié)合后通過傳統(tǒng)PCR或?qū)崟r(shí)PCR很容易實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，免疫PCR檢測BoNT/A檢測限可達(dá)5 pg（50 μL體系中），采用相同抗體檢測時(shí)，免疫PCR法的靈敏度可比ELISA提高1000倍[18]。Chao[19]等采用生物素化的報(bào)告DNA分子通過鏈霉親和素與生物素化的抗體結(jié)合，并優(yōu)化報(bào)告DNA分子與鏈霉親和素的量以降低背景干擾，檢測BoNT/A的靈敏度可達(dá)50 fg（50 μL體系中）。

2.3 基于生物傳感器的檢測方法（biosensor based assays）

與毒素檢測相關(guān)的一些特定傳感器技術(shù)有陣列生物傳感器法（array biosensor assay）、芯片ELISA法（ELISA-on-a-chip，EOC）和適配體電化學(xué)方法（aptamer-electrochemical assay）。對于肉毒毒素的快速檢測，生物傳感器技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了以表面等離子共振、折射、熒光和化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的技術(shù)，這些技術(shù)通常取決于毒素-蛋白（通常是一種抗體）的結(jié)合，結(jié)合的結(jié)果能直接測量[2]。Han[20]等發(fā)展了結(jié)合ELISA和免疫色譜技術(shù)的EOC法用于現(xiàn)場偵檢，產(chǎn)生的比色發(fā)光信號能被基于電感偶合的檢測器檢測，定量檢測BoNT/A的靈敏度為2 ng/mL。然而，生物傳感器技術(shù)與ELISA方法相比通常缺乏足夠的靈敏度、特異性和重復(fù)性。

2.4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）

熒光共振能量轉(zhuǎn)移是依賴于供體和受體分子間距離的光物理進(jìn)程，處于激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)通過偶極子間的相互作用，將能量以非輻射的方式轉(zhuǎn)移給鄰近的受體分子，從而導(dǎo)致供體熒光淬滅和受體熒光發(fā)射的增加[21]。FRET已發(fā)展成為A、B、E、F型肉毒毒素高通量檢測的方法，各血清型毒素作用于其特異性底物導(dǎo)致底物熒光性發(fā)生變化而被檢測。該方法通常使用一條兩端有標(biāo)記的寡肽模仿天然底物，一個(gè)熒光受體分子連接在一側(cè)末端，一個(gè)熒光供體連接在另一末端，熒光共振能量從供體轉(zhuǎn)移到受體僅發(fā)生于底物肽未斷裂、兩端標(biāo)記都完整并彼此極為鄰近時(shí)。當(dāng)毒素作用時(shí)底物肽斷裂，兩側(cè)標(biāo)記被分隔開，因此阻斷了熒光能量的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET現(xiàn)象也隨之消失。熒光共振能量的減少直接與肉毒毒素濃度成比例[2]。與ELISA相比，F(xiàn)RET的最大優(yōu)點(diǎn)是能夠檢測活性毒素。Joshi[22]比較了FRET的2種底物SSA[23]和SNAPtide在檢測BoNT/A時(shí)的靈敏度，發(fā)現(xiàn)采用SSA檢測的靈敏度比SNAPtide（150 ng/mL）提高一個(gè)數(shù)量級，檢測血漿樣本中BoNT/A檢測限為15 ng/mL；此外，采用SSA為底物可篩選BoNT/A輕鏈的突變株，因此可用于區(qū)分生物學(xué)功能和非生物學(xué)功能的BoNT/A輕鏈。

2.5 細(xì)胞學(xué)檢測法（cell-based assays）

細(xì)胞學(xué)檢測法是模擬活體中毒的體外檢測方法，它能在體外較好地模擬活體中毒。該方法有望成為小鼠生物試驗(yàn)法的替代方法，并且是近年來的研究熱點(diǎn)[24]。細(xì)胞試驗(yàn)法常用的細(xì)胞有傳代細(xì)胞系如neuro-2a、PC12和SK-N-SH細(xì)胞，或者使用來源于雞、小鼠的原代神經(jīng)元細(xì)胞和小鼠、大鼠脊髓細(xì)胞[25]。細(xì)胞內(nèi)肉毒毒素活性的檢測可通過蛋白質(zhì)印跡分析法檢測靶蛋白的裂解產(chǎn)物，另外可通過特異性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法檢測或神經(jīng)元活性測定。采用傳代細(xì)胞系的檢測方法在臨床樣本肉毒毒素活性測定中靈敏度相對不足，但采用制備的原代神經(jīng)元細(xì)胞檢測，其靈敏度與小鼠生物試驗(yàn)法（10 pg/mL）近似[26]。細(xì)胞試驗(yàn)法也存在一些缺點(diǎn)，如耗時(shí)長、試驗(yàn)流程復(fù)雜、需要組織或細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備。

2.6 肽鏈內(nèi)切酶質(zhì)譜法（Endopep-MS assay）

肽鏈內(nèi)切酶質(zhì)譜法是一種快速且靈敏的檢測方法，不僅能測定毒素的活性，還可以確定肉毒毒素的血清型[27]。該方法以毒素的蛋白水解酶活性為基礎(chǔ)，不同的肉毒毒素血清型在其特異的位點(diǎn)酶切特定的底物肽段，例如BoNT/A在SNAP-25蛋白的Q197和R198兩個(gè)氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切[28]。通過質(zhì)譜檢測質(zhì)量特異的酶切產(chǎn)物可以確定肉毒毒素血清型，克服了傳統(tǒng)ELISA檢測方法中不同血清型具有交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)。底物肽段可模仿肉毒毒素在體內(nèi)的靶標(biāo)SNAP-25或突觸小泡蛋白2的氨基酸序列組成[27]。一般采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-MS）或電噴霧離子源質(zhì)譜（ESI-MS）進(jìn)行檢測。肽鏈內(nèi)切酶質(zhì)譜法能在不同的樣本基質(zhì)中檢測肉毒毒素，檢測限低于小鼠生物試驗(yàn)法。就A、B、E、F型肉毒毒素而言，內(nèi)切酶質(zhì)譜法對于血清樣本的檢測限為0.05～0.5 MLD50/mL。

內(nèi)切酶質(zhì)譜法主要通過優(yōu)化底物肽段和優(yōu)化臨床樣品前處理提高檢測靈敏度，特定的底物肽段對肉毒毒素的親和力以及肉毒毒素對底物肽段的酶切效率直接影響產(chǎn)物肽段的量，進(jìn)而影響檢測靈敏度。目前，大多數(shù)研究采用MALDIMS檢測，Barr等[29]選取BoNT/A原始底物SNAP-25的185～206位氨基酸殘基組成的肽段進(jìn)行修飾，通過底物肽末端修飾，內(nèi)部氨基酸替代[30]，肽段長度適當(dāng)延伸和酶切位點(diǎn)附近氨基酸替換[31]等策略提高BoNT/A檢測靈敏度。值得注意的是，一些臨床樣本如糞樣中存在的高濃度非特異內(nèi)源性蛋白或蛋白酶，會(huì)導(dǎo)致干擾背景并降低內(nèi)切酶質(zhì)譜法檢測的靈敏度，因此需要采取一些前處理降低樣品中雜質(zhì)蛋白的干擾。例如采用高親和力抗體偶聯(lián)免疫磁珠捕獲毒素[32]，采用高濃度鈉鹽洗滌磁珠-毒素復(fù)合物并加入蛋白酶抑制劑，能夠有效減少樣品中的蛋白酶[33]。通過一系列優(yōu)化，MALDI-MS檢測BoNT/A的靈敏度可達(dá)0.1 MLD50/mL（血漿）和0.2 MLD50/mL（糞樣）。目前采用ESI-MS檢測BoNT的文獻(xiàn)并不多，但ESI-MS在定量準(zhǔn)確性及數(shù)據(jù)重現(xiàn)性等方面有極大的優(yōu)勢，檢測BoNT靈敏度高且特異性強(qiáng)，僅需數(shù)小時(shí)即可完成。該方法亦可通過優(yōu)化底物肽段等策略提高檢測靈敏度，例如Rosen等[34]采用優(yōu)化的底物肽189RTRIDEGNQRATR（Nle）LG204檢測血漿樣品中的BoNT/A，靈敏度可達(dá)0.1 MLD50/mL。此外，ESI-MS還可在毒素-底物酶切反應(yīng)體系中同時(shí)檢測不同血清型的BoNT，減少所需樣品體積并節(jié)約檢測時(shí)間，Rosen等[34]將 BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E 3種毒素特異的底物肽混合，單次反應(yīng)即可同時(shí)檢測血漿樣品中的3種毒素，BoNT/B、BoNT/E的檢測靈敏度與BoNT/A相當(dāng)。

作為有力的毒素分析確證技術(shù)，內(nèi)切酶質(zhì)譜法已成為近年來肉毒毒素檢測的研究熱點(diǎn)，但其需要昂貴的質(zhì)譜儀、繁瑣的樣品前處理和專業(yè)的數(shù)據(jù)分析，在大規(guī)模臨床樣品中的應(yīng)用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著質(zhì)譜儀小型化和各種新型離子源質(zhì)譜的快速發(fā)展，內(nèi)切酶質(zhì)譜法有望成為廣泛應(yīng)用的肉毒毒素檢測方法。

3 展望

肉毒毒素是一種高毒性和最具威脅的生物恐怖戰(zhàn)劑，在臨床應(yīng)用和可疑的肉毒毒素食物中毒檢測中，需要靈敏度高和血清型特異性的檢測方法。小鼠生物試驗(yàn)法是肉毒毒素檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)長、非自動(dòng)化操作、需要使用動(dòng)物等使其應(yīng)用受到限制。目前，肉毒毒素體外檢測方法取得了顯著進(jìn)步，例如改進(jìn)后的ELISA法和FRET法能夠檢測活性和非活性的神經(jīng)毒素，在肉毒毒素功能研究中已有很大進(jìn)展，一些細(xì)胞學(xué)檢測法相比于小鼠生物試驗(yàn)法，檢測靈敏度更高。肽鏈內(nèi)切酶質(zhì)譜法由于具有較高的靈敏度、血清型特異性和能夠檢測毒素活性，得到越來越廣泛的應(yīng)用，其檢測方法的成功建立對同類神經(jīng)毒素的檢測具有極大的借鑒意義，例如內(nèi)切酶質(zhì)譜法可拓展應(yīng)用于其他蛋白水解酶毒素（如破傷風(fēng)毒素）的檢測。當(dāng)然，本文所提及的方法都需要進(jìn)一步優(yōu)化，以及應(yīng)用于食品樣品、臨床樣品和環(huán)境樣品的深入驗(yàn)證。質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是ESI-MS的強(qiáng)大分析能力，結(jié)合新型的生物傳感器和多樣化的技術(shù)，有望發(fā)展出更加理想的肉毒毒素檢測方法。