顏明艷， 王 月， 顧華鑫， 王有基， 李瓊珍， 范志鋒， 孫 彬， 胡夢紅

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306; 2. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，南寧 530021)

鱟(Horseshoe crab)，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、肢口綱(Merostomata)、劍尾目(Xiphosura)，有“活化石”之稱?，F(xiàn)今世界上僅存二亞科三屬的4種鱟，分別為圓尾鱟(Carcinoscorpiusrotundicauda)、中國鱟(Tachypleustridentatus)、南方鱟(Tachypleusgigas)和美洲鱟(Limuluspolyphemus)。近年來，有關(guān)鱟生物學(xué)方面的研究進展迅速。鱟血液中含有多種活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)的生物活性不僅可以起到抗菌、抗病毒的作用，甚至能抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化。

早在1956年人們就開始了對鱟血液及其與細(xì)菌內(nèi)毒素關(guān)系的研究[1]。此后，鱟試劑的應(yīng)用滲入到各個領(lǐng)域，如檢測生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、食品加工等方面。范林等[2]研究發(fā)現(xiàn)，鱟試劑動態(tài)濁度法可準(zhǔn)確檢測重組人凝血因子Ⅷ細(xì)菌內(nèi)毒素。Solano等[3]發(fā)現(xiàn)鱟試劑可用于檢測抗蛇毒血清的內(nèi)毒素含量。

鱟試劑按其來源可分為兩種，一種是中國鱟試劑(Tachypleus Amebocyte Lysate)，縮寫為TAL，原材料為中國鱟血液；另一種是美洲鱟試劑(Limulus Amebocyte Lysate)，縮寫為LAL，提取自美洲鱟的血液。TAL與LAL的功能相同。世界上擁有鱟資源的國家并不多，而我國占有世界上95%的中國鱟資源[4]。我國生產(chǎn)鱟試劑的原材料主要提取自中國鱟的血細(xì)胞[5]。目前，在福建廈門、廣東湛江、廣西北海等鱟棲息地集中分布了我國生產(chǎn)鱟試劑的工廠。

1　鱟試劑的生產(chǎn)工藝和應(yīng)用領(lǐng)域

鱟工廠采集鱟血液的步驟：1)抓捕。在鱟棲息地捕捉中國鱟。2)運輸。在密封的空間運輸，同時將鱟身上的沙子等雜物去除，檢查中國鱟是否受傷(鱟試劑廠不采集受傷鱟的血液)。3)提取血液。將與鱟細(xì)胞接觸的所有玻璃器皿嚴(yán)格消毒，用1%碘酒，70%酒精對中國鱟頭胸腹部關(guān)節(jié)部位進行消毒，之后用玻璃插管直接插入鱟心臟包膜讓血液經(jīng)插管流入裝有抗凝劑的貯存瓶中，每只鱟大約采100 mL血液，保持抗凝劑與采血量體積比為1∶1。4)放生。采完血的鱟在當(dāng)天帶到距被捕地大約113～129 km的地方放生，防止短時間再次被捕采血。研究顯示適量抽血不會影響鱟的生活和生殖能力[6]，但需要足夠的時間才能使采血鱟恢復(fù)健康。

鱟試劑是一種生物試劑，其提取過程是先從中國鱟的藍(lán)色血液中分離出變形細(xì)胞，然后提取細(xì)胞溶解物后經(jīng)低溫冷凍干燥形成鱟試劑。鱟試劑按實驗方法可分為凝膠法鱟試劑和光度測定法鱟試劑(濁度法和顯色基質(zhì)法)。其中，凝膠法鱟試劑是定性檢測或半定量內(nèi)毒素的方法，其原理是與內(nèi)毒素反應(yīng)產(chǎn)生凝集。而光度測定法鱟試劑則是定量檢測內(nèi)毒素的方法。鱟試劑按使用特點可分為4種，分別為普通鱟試劑、高靈敏度鱟試劑、特異性鱟試劑及定量法鱟試劑。不同分類的鱟試劑的靈敏度不同，制備方法也略有不同，本文介紹了其中一種較為普遍的制備方法。其具體制備過程是將采集到的與抗凝劑混合的鱟血用三羥氨甲烷等緩沖液將pH調(diào)至7.1±0.3，然后以1600 r/min的速度離心10 min，收集其沉淀細(xì)胞后加洗滌液(如3%NaCl)洗滌3次，離心除去洗液后得到濃集的鱟血細(xì)胞，在其中加入3倍量的崩解液(注射用水、0.9%NaCl注射液等)，搖勻密封，在4℃下冷藏24 h后再離心10 min，速度為3000 r/min，除去細(xì)胞破裂后的碎片，取得的上清液即是變形細(xì)胞溶解物。然后進行靈敏度標(biāo)定。標(biāo)定后將其分裝并凍干封口得到成品鱟試劑[7]。

鱟試劑是目前檢測內(nèi)毒素最有效、最簡便的試劑。因其操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點在藥品檢驗、食品、醫(yī)療用具、臨床醫(yī)學(xué)研究等多個領(lǐng)域均有應(yīng)用。鱟試劑產(chǎn)生凝集是一系列酶反應(yīng)的過程。細(xì)胞漿顆粒存在于鱟血細(xì)胞中，其含有一種酶系統(tǒng)，包括B因子(factor B)、C因子(factor C)、凝固酶原(proctting enzyme)和凝固蛋白原(coagulogen)，功能是與內(nèi)毒素起凝集作用。具體過程為：C因子被內(nèi)毒素激活，而B因子則被活化C因子啟動成為活化B因子，活化B因子會激活凝固酶原生成凝固酶，而凝固蛋白原由于凝固酶的酶解作用轉(zhuǎn)變?yōu)槟痰鞍?，最后，凝固蛋白通過交聯(lián)酶作用產(chǎn)生凝集反應(yīng)[8]。在凝固酶原和G因子存在條件下，鱟試劑還可與CMPS類物質(zhì)產(chǎn)生凝集作用[9]。

2　鱟試劑產(chǎn)業(yè)在中國的發(fā)展現(xiàn)狀

我國現(xiàn)有的鱟試劑廠主要分布在福建廈門、廣東湛江、廣西北海等中國鱟棲息地。例如作為國內(nèi)最早生產(chǎn)鱟試劑的廠家的福建廈門鱟試劑生物科技股份有限公司于1987年就已經(jīng)成功研制出鱟試劑，該公司的特異性鱟試劑(即棄G因子鱟試劑)是國內(nèi)首創(chuàng)產(chǎn)品，于1995年開始批量生產(chǎn)。該試劑可以避免G因子旁路對其的干擾，且只對內(nèi)毒素起反應(yīng)，使得檢測結(jié)果更加可靠，無論是在藥檢還是臨床檢驗方面都是必不可少的檢測試劑。目前該公司已有透析專用鱟試劑盒、顯色基質(zhì)鱟試劑、凝膠法鱟試劑、動態(tài)濁度法鱟試劑、特異性鱟試劑、內(nèi)毒素等一系列鱟試劑產(chǎn)品。其中，2005年推出的顯色基質(zhì)定量鱟試劑盒使用簡單方便，抗干擾能力強，靈敏度高達(dá)0.005 EU/mL，質(zhì)量也已達(dá)到國際領(lǐng)先水平。福州新北生化工業(yè)有限公司，也是一家以研發(fā)、生產(chǎn)鱟試劑及其他各種生物試劑產(chǎn)品的企業(yè)。該公司不僅有在藥品領(lǐng)域中檢測注射藥品中熱原質(zhì)的產(chǎn)品，還有在臨床領(lǐng)域檢測人體血液中細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌多糖的試劑盒。在廣東，如湛江博康海洋生物有限公司，也已從事細(xì)菌內(nèi)毒素檢測與鱟試劑研究和生產(chǎn)30多年，是全球早期成功研究鱟試劑的專業(yè)生產(chǎn)企業(yè)，該公司于2012年研制的“真菌(1，3)-β-D葡聚糖檢測試劑盒(動態(tài)濁度法)”產(chǎn)品，打破了美國在該項技術(shù)領(lǐng)域的壟斷。此外，北海興龍生物制品有限公司、湛江安度斯公司等專業(yè)生產(chǎn)中國鱟試劑(TAL)及相關(guān)產(chǎn)品的公司，其產(chǎn)品也獲得國內(nèi)外的廣泛認(rèn)可。

3　鱟試劑相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的問題

3.1　研究基礎(chǔ)薄弱

鱟試劑產(chǎn)業(yè)作為新興產(chǎn)業(yè)，我國對其的研究較少，基礎(chǔ)還較為薄弱。我國生產(chǎn)的鱟試劑與國際同類產(chǎn)品有一定差距，具體表現(xiàn)在鱟試劑的靈敏度、質(zhì)量、穩(wěn)定性、各支的均一性及內(nèi)毒素各種標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑對照品等方面。深入研究鱟試驗反應(yīng)動力學(xué)機制并完善以其為基礎(chǔ)的內(nèi)毒素定量分析技術(shù)已刻不容緩。

3.2　原材料供應(yīng)逐年下降

以年產(chǎn)量150萬支的鱟試劑公司為例，每年需要5000對(即1萬只)成年鱟提供血源。然而，作為原材料的中國鱟數(shù)量卻急劇減少，遠(yuǎn)不能滿足鱟試劑廠對中國鱟血液的需求。翁朝紅等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國鱟在浙江舟山地區(qū)幾近絕跡，福建東山灣海域每年被捕數(shù)量也僅千對。從前在中國東部和南部沿海比比皆是的中國鱟，現(xiàn)在大部分海域已經(jīng)找不到其蹤跡了。不僅上岸產(chǎn)卵的成鱟寥寥可數(shù)，潮間帶上的幼鱟也非常少見。廣西北部灣是我國中國鱟的主要棲息地，但棲息于此的中國鱟數(shù)量正在逐年減少，從20世紀(jì)90年代以前的60～70萬對減少到2010年的每年約30萬對[11]。我國中國鱟資源已經(jīng)面臨枯竭。作為原材料的中國鱟枯竭將直接導(dǎo)致鱟試劑產(chǎn)業(yè)的停滯不前。

3.3　鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠完善

盡管我國對于鱟試劑的質(zhì)量制定了相關(guān)政策，但目前，我國對于鱟試劑相關(guān)產(chǎn)業(yè)的重視程度不夠高，相關(guān)政策的執(zhí)行力度不夠嚴(yán)格，加上相關(guān)部門的監(jiān)督力度不夠，導(dǎo)致了鱟試劑質(zhì)量的參差不齊，且鱟試劑容易受到多種不穩(wěn)定因素的影響，如鱟動物個體差異、制備過程中器具消毒不嚴(yán)格等，致使同一廠家批號不同的鱟試劑質(zhì)量也有所差異，這使得鱟試劑靈敏度的復(fù)核值與其標(biāo)示值不盡相同。規(guī)范鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，加大對鱟試劑靈敏度的復(fù)核監(jiān)測力度等措施對于鱟試劑的質(zhì)量至關(guān)重要。

4　建議

中國鱟資源銳減將直接影響鱟試劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。早在20世紀(jì)80年代，我國科學(xué)工作者就開始呼吁保護鱟資源，但受限于當(dāng)時的人口增長、經(jīng)濟缺乏發(fā)展等因素，我國的鱟資源并沒有受到應(yīng)有的保護[12]。中國鱟從卵細(xì)胞受精至性成熟需要13～15年的時間[13]，這漫長的生長時間使得中國鱟資源的恢復(fù)十分困難。因此，為了中國鱟試劑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，開展中國鱟的人工繁育、野外放流、棲息地保護等工作刻不容緩。此外，提高鱟試劑提取效率、完善鱟試劑的制造工藝，規(guī)范采血技術(shù)，減少對采血鱟的傷害，立法保障采血鱟的放生等舉措對于鱟試劑的可持續(xù)發(fā)展也不可或缺。具體建議如下。

4.1　規(guī)范鱟試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

不同廠家甚至是同一廠家不同批次的鱟試劑在質(zhì)量參數(shù)、生產(chǎn)工藝等方面都會有不同程度的差異。這將導(dǎo)致鱟試劑檢測內(nèi)毒素的結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，研究影響鱟試劑質(zhì)量的因素并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對保證鱟試劑質(zhì)量至關(guān)重要。鱟試劑制備的關(guān)鍵在于其靈敏度、穩(wěn)定性及自身凝集等。一般要求穩(wěn)定的靈敏度，大于24 h的自凝時間，適宜的pH、具有一定的緩沖能力等。達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)的鱟試劑，既浪費了寶貴的中國鱟藍(lán)色血液，也會導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

確定鱟試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)既需要得到國家的重視，有關(guān)部門監(jiān)督復(fù)核鱟試劑靈敏度的力度也應(yīng)加強。確定出廠鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使我國鱟試劑工廠有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加了鱟試劑內(nèi)毒素檢查準(zhǔn)確性的同時，也為鱟試劑的進一步發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。

4.2　規(guī)范鱟試劑廠的采血過程

鱟試劑企業(yè)不可因盲目追求一時的利益而過度捕撈鱟、隨意加大采血劑量等，應(yīng)注重長期發(fā)展，做好中國鱟的保護工作。在中國鱟的運輸過程中應(yīng)注意對鱟的保護，不采受傷的中國鱟的血液。在采血過程中則應(yīng)該注意無菌消毒和采血的量。利用完中國鱟要放回原棲息地，不能為了節(jié)約成本而隨意丟棄，且要離抓捕地113～129 km處放生，防止中國鱟還沒有完全康復(fù)就再次被捕捉采血，從而導(dǎo)致中國鱟的死亡。

企業(yè)可以和科學(xué)工作者合作研究采血后的鱟所需的營養(yǎng)以及怎樣使血細(xì)胞快速恢復(fù)，以利于企業(yè)暫養(yǎng)采血鱟一段時間，并在短時間多次采血后再放回。人工飼養(yǎng)鱟既可以節(jié)約運輸成本，減少鱟在運輸過程中受到的傷害，增加抽血成功率，還可以避免因潮汛等原因造成捕捉的鱟數(shù)量減少從而影響企業(yè)按計劃生產(chǎn)供應(yīng)的情況發(fā)生。鱟試劑的制備過程要嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，公司可以建造一個無菌室，在無菌室進行鱟試劑的制備，減少鱟試劑被污染的可能性。企業(yè)也應(yīng)該斥資幫助中國鱟種群的恢復(fù)，使得企業(yè)有鱟可以采血，利于企業(yè)自身的可持續(xù)發(fā)展。政府部門加強對于公司的監(jiān)管措施，嚴(yán)格規(guī)范鱟試劑公司對于鱟的采血及釋放等過程，對于違反規(guī)定的公司進行嚴(yán)懲。

4.3　加強科研人員團隊建設(shè)

鱟試劑產(chǎn)業(yè)作為新興產(chǎn)業(yè)，在我國發(fā)展緩慢，研究基礎(chǔ)薄弱，這與我國從事相關(guān)研究的科研人員不足有一定的關(guān)系。政府應(yīng)充分調(diào)動科研人員對于鱟試劑的研究熱情，大力推動科研工作，客觀分析我國鱟試劑產(chǎn)業(yè)的研究現(xiàn)狀，找出問題的關(guān)鍵，有針對性的進行研究，從而解決問題。如深入研究鱟試驗反應(yīng)動力學(xué)機制等技術(shù)。為了拓展鱟試劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也應(yīng)該加強鱟試劑的基礎(chǔ)研究，不僅要鼓勵科研人員從事鱟試劑的相關(guān)研究，政府及相關(guān)機構(gòu)還應(yīng)加強對鱟試劑相關(guān)科研人員的培養(yǎng)，完善鱟試劑生產(chǎn)工藝從而加快鱟試劑相關(guān)研究的發(fā)展。

4.4　恢復(fù)中國鱟種群

中國鱟資源面臨枯竭，可通過人工養(yǎng)殖和稚鱟放流等方法促進中國鱟種群恢復(fù)。目前，已有很多關(guān)于中國鱟人工養(yǎng)殖技術(shù)的研究。中國鱟的研究工作可以追溯到20世紀(jì)50年代[14]，到了80年代，學(xué)者們以中國鱟的人工飼養(yǎng)、人工育苗技術(shù)等方面為重點進行了研究[15-17]；90年代，洪水根[18]、廖永巖[19]等進行了進一步研究；近十幾年來，更多的學(xué)者對中國鱟的人工繁殖技術(shù)進行了研究[20-25]，大大推進了中國鱟在我國的研究進程。王駿博[23]研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的灘涂地區(qū)人工養(yǎng)殖或放流幼鱟，幼鱟完全可以在自然區(qū)域生長發(fā)育。廖永巖和洪水根[24]也認(rèn)為可以在合適的條件下放流人工育苗養(yǎng)殖成的幼鱟，從而使鱟種群逐漸恢復(fù)，有效保護鱟資源。迄今為止，中國鱟人工繁殖技術(shù)已經(jīng)獲得成功。依靠這些已有的成果和經(jīng)驗，加快中國鱟的人工增養(yǎng)殖、幼體食性和孵育特性等方面研究的步伐可以為中國鱟資源恢復(fù)提供理論基礎(chǔ)，從而通過增殖放流方式在一定程度上恢復(fù)中國鱟資源。

4.5　提高公眾保育意識

人類活動的干擾是中國鱟資源枯竭的一個重要原因。雖然中國鱟是國家二級保護動物，但是很多漁民都不知道鱟的寶貴，甚至對其進行捕殺、食用等違法行為，造成鱟資源的枯竭。所以，提高民眾保護鱟的意識是有效保護鱟的一個重要措施，可以大大減少人類活動對鱟造成的傷害。民眾的力量是無窮的，我們應(yīng)該引導(dǎo)廣大民眾保護鱟，讓他們意識到鱟的寶貴，了解到鱟資源瀕臨滅絕的情況，積極參與到保護鱟的行動中。政府則應(yīng)加大執(zhí)法力度，對非法捕撈、販賣鱟的行為予以打擊和嚴(yán)懲，從而促使大眾自覺遵守法律。

就鱟試劑產(chǎn)業(yè)目前在中國的發(fā)展現(xiàn)狀而言，相關(guān)企業(yè)應(yīng)增強自身責(zé)任意識，健全公司管理制度，提高中國鱟的保育意識，以保護中國鱟為前提開展企業(yè)制造鱟試劑的工作。政府部門應(yīng)該規(guī)范鱟試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，鼓勵科研人員從事鱟血液學(xué)基礎(chǔ)研究和鱟試劑生產(chǎn)工藝改良等工作，從而促進該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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