王光裕，楊英，車寶泉，李文東，王升啟

1.軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850；2.北京市藥品檢驗(yàn)所，北京100035

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展與醫(yī)療水平的提高，人們得以對(duì)以前無(wú)法治愈的疾病加以控制。伴隨大量抗腫瘤化療藥物、免疫制劑及激素的使用，雖然延長(zhǎng)了人們的壽命，但也使患者的內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)失調(diào)的可能性增加，從而給了侵襲性真菌可乘之機(jī)，對(duì)于艾滋病等免疫缺陷病患者、骨髓移植和器官移植患者，其真菌感染率也大大增加[1-2]。此外，近年來(lái)不斷有新發(fā)真菌病原體侵襲人類的報(bào)道[3-4]，也引發(fā)了國(guó)際關(guān)注。有研究表明，侵襲性真菌感染患者的死亡率超過(guò)50%[5-6]，因此，采用合適的抗真菌藥物至關(guān)重要。但是臨床用藥狀況表明，越來(lái)越多的真菌感染顯示對(duì)傳統(tǒng)抗真菌藥物的耐藥性，嚴(yán)重影響患者的恢復(fù)，這就促使人們對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，以期改良傳統(tǒng)藥物或發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物。

臨床常見(jiàn)的真菌感染多為條件致病菌，一般在伴隨感染或患者免疫力低下時(shí)發(fā)病。依據(jù)真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，主要分為以下幾類：①酵母菌屬，包括念珠菌（白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌等）和非念珠菌（包括隱球菌、毛孢子菌等）；②霉菌屬，包括曲霉菌（煙曲霉、黃曲霉、土曲霉等）和非曲霉（結(jié)合菌、暗色孢霉菌、青霉菌等）；③雙相真菌，包括馬爾尼菲藍(lán)狀菌、副球孢子菌和組織胞漿菌等；④類真菌，包括肺孢子菌、奴卡菌、放線菌等[7]。

1 常見(jiàn)抗真菌藥物

針對(duì)真菌生長(zhǎng)增殖的各個(gè)過(guò)程，不同抗真菌藥物有不同的作用機(jī)理，基于藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以分為以下幾類。

1.1 多烯類抗真菌藥

包括兩性霉素B 以及制霉菌素，其通過(guò)結(jié)合真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇，形成甾醇-多烯復(fù)合物，從而在細(xì)胞膜上形成親水通道，增加陽(yáng)離子通透性，致使細(xì)胞膜內(nèi)外離子梯度變化，內(nèi)容物外泄，造成真菌死亡[8-9]。人細(xì)胞膜上膽固醇與麥角固醇結(jié)構(gòu)類似，當(dāng)腎小球?yàn)V過(guò)率降低時(shí)，服用多烯類藥物會(huì)對(duì)人體顯示腎毒性。

1.2 吡咯類抗真菌藥

又稱氮唑類抗真菌藥物，包括咪唑類和三氮唑類。咪唑類常用藥物有咪康唑和酮康唑，但毒副作用大，一般僅外用；三氮唑類的常用藥物有氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑等[10]。該類藥物作用機(jī)制和多烯類不同。真菌細(xì)胞色素P-450 能夠催化羊毛固醇14 位脫α甲基成為真菌細(xì)胞膜上的重要成分麥角固醇，吡咯類藥物通過(guò)和細(xì)胞色素P-450 結(jié)合來(lái)抑制羊毛固醇去甲基酶（CYP51）,導(dǎo)致羊毛固醇不能有效合成，破壞細(xì)胞膜的滲透性，繼而造成真菌死亡[11-12]。有研究顯示，伏立康唑可以穿透血腦屏障，因此，可以用來(lái)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的真菌感染[13]。

1.3 環(huán)狀酯肽類抗真菌藥

又稱棘白菌素類抗真菌藥，常見(jiàn)臨床用藥為卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈。該類藥物主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁發(fā)揮藥效。1，3-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要組分，由1，3-葡聚糖合成酶催化合成，棘白菌素通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)抑制真菌1，3-葡聚糖合成酶，抑制細(xì)胞壁的1，3-葡聚糖合成，破壞真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，達(dá)到抑制并殺滅真菌的目的[14]。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)并不存在該酶，因此，該類藥物并不會(huì)對(duì)人體有毒性作用[15]。

1.4 核酸抑制類抗真菌藥

常見(jiàn)臨床用藥為5-氟胞嘧啶（5-FC），其依靠胞嘧啶通透酶進(jìn)入真菌細(xì)胞，經(jīng)胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)變成氟尿嘧啶，之后轉(zhuǎn)變成氟尿苷三磷酸，整合到真菌RNA 中，從而阻斷蛋白質(zhì)的合成；此外，5-FC 還能夠轉(zhuǎn)變成氟脫氧尿苷磷酸，競(jìng)爭(zhēng)性抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，影響DNA 的合成，從而抑制真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)。臨床治療中發(fā)現(xiàn)5-FC 具有腎毒性和骨髓抑制的副作用，因此，在使用時(shí)必須控制其血藥濃度[16]。此外，同伏立康唑一樣，5-FC 也可以穿透血腦屏障，可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的真菌感染[12]。

1.5 烯丙胺類抗真菌藥物

常見(jiàn)臨床用藥為特比萘芬、萘替芬等，是從雜環(huán)螺旋萘衍生出來(lái)的廣譜高效低毒抗真菌藥，通過(guò)抑制鯊烯環(huán)氧合酶，導(dǎo)致鯊烯的堆積，同時(shí)，細(xì)胞膜麥角固醇的合成也受到抑制[17-18]。

1.6 其他抗真菌藥物

以上幾種為抗真菌常用藥。此外，從木槿馬杜拉放線菌中分離得到的普那米星在鈣離子存在的條件下可與甘露聚糖結(jié)合，改變其空間結(jié)構(gòu)，從而破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致菌體死亡[19]。由鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類天然抗生素抗霉素A 能夠與真菌細(xì)胞內(nèi)線粒體的電子傳遞體系結(jié)合，嚴(yán)重阻礙由輔酶Q 向細(xì)胞色素C 的電子傳遞，從而起到殺菌作用[20]。中藥組分黃芩苷，可能通過(guò)抑制白念珠菌DNA 生物合成達(dá)到抗菌作用[21]。

2 真菌的耐藥機(jī)制

真菌可通過(guò)一系列方法減弱或避免藥物的作用，從而達(dá)到抗藥目的。

2.1 改變藥物靶向分子

一種方式是改變藥物靶向蛋白的結(jié)構(gòu)，降低藥物敏感性，從而使藥物失效。ERG11基因編碼羊毛固醇去甲基酶CYP51，該基因突變致使酶的氨基酸序列改變，當(dāng)突變位點(diǎn)為吡咯類藥物的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，藥物無(wú)法與酶結(jié)合，從而喪失藥效。另一種方式是過(guò)量表達(dá)藥物靶向蛋白，使藥物不能完全發(fā)揮作用[22]。

2.2 降低菌體內(nèi)藥物濃度

一方面，通過(guò)降低細(xì)胞通透性，使藥物進(jìn)入細(xì)胞的量減少；另一方面，細(xì)胞膜外排泵表達(dá)增加，從而加速將藥物排到胞外。真菌外排泵主要包括ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCT）超家族和異化擴(kuò)散載體（MFS）超家族。ABCT 通過(guò)ATP 供能將藥物排到胞外，白念珠菌的ABCT 相關(guān)蛋白為CDR1 和CDR2，是將吡咯類藥物外排的最主要ABCT。MFS 超家族利用細(xì)胞內(nèi)外的氫離子濃度差產(chǎn)生的電化學(xué)勢(shì)能對(duì)藥物分子進(jìn)行被動(dòng)運(yùn)輸，其相關(guān)載體基因?yàn)镸DR1等，通過(guò)基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)、mRNA 分解抑制來(lái)上調(diào)mRNA 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)耐藥[23]。真菌細(xì)胞胞嘧啶通透酶活性降低能夠減少對(duì)5-FC 的攝取，從而出現(xiàn)耐藥[24]。

2.3 改變代謝途徑

抗真菌藥物可以通過(guò)抑制真菌代謝關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵物質(zhì)合成來(lái)發(fā)揮抑菌作用，如吡咯藥物抑制14α-甲基-3，6-二醇轉(zhuǎn)化為麥角固醇，但是當(dāng)EGR3基因突 變時(shí)，14α-甲基-3，6-二醇 被14α-甲基甾醇代替，14α-甲基甾醇可以部分行使麥角固醇的功能，從而達(dá)到耐藥效果[25]。此外，真菌還可以抑制5-FC 代謝為毒性物質(zhì)的關(guān)鍵酶（UPRTase）誘導(dǎo)耐藥[26]。

2.4 形成生物膜

生物膜是真菌形成群落后分泌于胞外并包裹在真菌表面的多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于其具有天然屏障作用，所以會(huì)影響藥物作用于菌體；另一方面，形成生物膜后菌體生長(zhǎng)緩慢，從而也限制了和外界的物質(zhì)交換，降低藥物攝??；此外，有研究表明，該狀態(tài)菌體會(huì)有耐藥基因的表達(dá)[27-28]。

2.5 細(xì)胞壁的適應(yīng)性改變

FKS1 蛋白是葡聚糖合成酶復(fù)合物的催化亞基，其編碼基因（尤其是HS1 和HS2 區(qū)）突變，很有可能致使對(duì)棘白菌素的敏感性降低，有研究表明，自發(fā)突變所致FKS1 多態(tài)性與白念珠菌對(duì)棘白菌素的藥物敏感性降低有關(guān)[29-30]。

3 對(duì)抗真菌耐藥的方案

3.1 對(duì)原有藥物進(jìn)行化學(xué)修飾

對(duì)于棘白菌素類，Singh 等以羥基谷氨酰胺替換蘇氨酸、以芳香族雜環(huán)的?；鶄?cè)鏈替換環(huán)六肽分子獲得的新型藥物具有低毒高效抗菌活性[31]。對(duì)于氟康唑，有研究顯示，一方面可以對(duì)其醇羥基酯化，另一方面可以利用三唑環(huán)N 原子形成季銨鹽化合物，其抗菌活性都得到明顯提高[32-33]。

3.2 開(kāi)發(fā)新型結(jié)構(gòu)的藥物

Viamet Pharmaceuticals 公司研發(fā)了對(duì)真菌具有更高選擇性的VT-1161、VT-1129、VT-1598 等四氮唑類藥物[34]。VT-1161 對(duì)白念珠菌的CYP51具有高親和力，因此具有比常規(guī)氮唑類藥物更高的選擇性[35]；VT-1129 具有類似的基本骨架，主要對(duì)隱球菌產(chǎn)生抑制作用[36]；VT-1598 對(duì)酵母菌、絲狀真菌，甚至超級(jí)真菌——耳念珠菌都具有較強(qiáng)的抑制作用[37-38]。

3.3 開(kāi)發(fā)新劑型

多烯類藥物對(duì)人體毒性大，因而限制了其應(yīng)用。通過(guò)開(kāi)發(fā)新劑型，如脂質(zhì)體藥物、納米球藥物等，可以顯著降低藥物毒性。如兩性霉素B 做成脂質(zhì)體，能結(jié)合麥角固醇，但腎毒性大大降低，目前已有上市藥物。兩性霉素B/聚乙二醇-聚谷氨酰胺芐酯納米球能夠顯著降低兩性霉素的毒性，目前還處于研發(fā)階段[39-40]。

3.4 采用中藥制劑

研究顯示，黃芩、黃柏、黃連以及在麻黃莖中分離得到的原花青素A 對(duì)白念珠菌有較強(qiáng)的抑菌效果[41-42]。小檗堿和氟康唑聯(lián)合用藥也顯示對(duì)白念珠菌的抑菌效應(yīng)[43]。

3.5 尋找新的作用靶點(diǎn)

對(duì)于人體內(nèi)沒(méi)有而真菌細(xì)胞必不可少的代謝途徑，可以開(kāi)發(fā)藥物阻斷其代謝，不會(huì)對(duì)人體造成損傷。如ASP2397 通過(guò)靶向人體不具有而在真菌細(xì)胞中存在的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而發(fā)揮藥效[44-45]。

3.6 抗真菌藥物的合理使用

相比抗細(xì)菌、抗病毒藥物，抗真菌藥物種類雖不多，但各個(gè)藥物具有其特定的抗菌譜，例如隱球菌對(duì)棘白菌素類抗真菌藥耐藥，毛霉對(duì)棘白菌素類和吡咯類均耐藥；此外，同一藥物在體內(nèi)針對(duì)不同組織部位的感染也具有特定的濃度，例如氟康唑在尿路的藥物濃度是血液中的10 倍以上，卡泊芬凈在肝腎的藥物濃度是血液中的5 倍以上，而在腦脊液中濃度極低[46]。因此，選擇合適的藥物種類和劑量就顯得尤為重要，不合理的臨床用藥不但會(huì)耽誤病程、給患者帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還會(huì)誘導(dǎo)真菌耐藥性的產(chǎn)生。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著研究的不斷深入，對(duì)真菌耐藥機(jī)制的探究有了一定進(jìn)展，尤其是比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)等在侵襲性真菌研究中的應(yīng)用，對(duì)解析真菌的毒力和耐藥起到重要作用[47-48]。對(duì)于某些感染，通過(guò)改良藥物或聯(lián)合用藥能取得一定的治療效果，但真菌耐藥的復(fù)雜性不容忽視，也依然有許多耐藥機(jī)制不甚明了。2009年，在日本首先發(fā)現(xiàn)了具有強(qiáng)抗藥性的超級(jí)真菌——耳念珠菌，隨后在世界多國(guó)都有發(fā)現(xiàn)，其不但致死率高而且多重耐藥，研究顯示，幾乎所有的耳念珠菌菌株對(duì)氟康唑耐藥，半數(shù)以上對(duì)伏立康唑耐藥，三分之一對(duì)兩性霉素B 耐藥，少數(shù)對(duì)棘白菌素也耐藥[49]；另有研究顯示，耳念珠菌的耐藥性與FKS1、FKS2、CgPDR1、CgCDR1和FCY2這些基因的單核苷酸突變可能存在關(guān)聯(lián)性[24]。但目前對(duì)于耳念珠菌感染并沒(méi)有有效的治療手段，研究其耐藥機(jī)制，研發(fā)相應(yīng)的診斷與治療方法，從而有針對(duì)性地靶向用藥，仍是研究者們努力的方向[50]。