俞珺瑤，杜華平

浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院 血液科，浙江 杭州 310016

CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated pro?teins，CRISPR/Cas）系統(tǒng)是細菌和古細菌在生物進化過程中形成的一種適應性免疫防御系統(tǒng)，用來對抗入侵的噬菌體及其他外源質(zhì)粒核酸（包括DNA和RNA）。CRISPR-Cas系統(tǒng)先將外源核酸片段整合到CRISPR回文重復序列中，當外源核酸再次入侵時，細胞表達的CRISPRRNA（crRNA）引導Cas核酸內(nèi)切酶迅速切割外源核酸，從而起到免疫防御的作用[1-3]。該過程主要包括以下幾個步驟[4-5]：①CRISPR間隔區(qū)的獲得：將外源核酸序列整合到CRISPR基因組5′端2個重復序列之間得到間隔區(qū)（interspacer），對應的外源核酸序列稱為protospacer；②CRIPSR基因座的表達（包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工)：以間隔區(qū)核酸序列為模板轉(zhuǎn)錄的前體crRNA（pre-RNA）在Cas蛋白和tracrRNA幫助下剪切成小的RNA，即成熟的crRNA；③CRISPR/Cas系統(tǒng)對外源入侵核酸的切割：成熟的crRNA與具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白（如Cas9、Cas12、Cas13等）形成核酸核蛋白復合物，crRNA能與外源核酸的protospacer互補配對，引導Cas蛋白在特定位置對外源核酸進行切割。CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為ClassⅠ和Ⅱ兩大類，每個大類又分為不同型（type）和亞型（sub?type）。ClassⅠ CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌和古細菌中較多見，但因成分相對復雜不適合作為工具使用而較少被研究[6]。ClassⅡ CRISPR-Cas系統(tǒng)（包括typeⅡ、typeⅤ、typeⅥ等）雖然少見，但其識別和切割外源核酸的靶序列只需一種Cas蛋白，因此被改造成基因編輯工具而受到越來越多的關(guān)注[7-8]。CRISPR-Cas系統(tǒng)又可根據(jù)功能分為靶向DNA和RNA等2種。以下對各種類型的CRISPRCas系統(tǒng)做具體闡述。

1 靶向結(jié)合DNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)

1.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)

發(fā)現(xiàn)于釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）和嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）的CRISPR-Cas9系統(tǒng)屬于ClassⅡtypeⅡ CRISPR-Cas系統(tǒng)，其組成包括crRNA、tracrRNA和Cas9，由于成分簡單，最早被用于基因編輯的工具而被廣泛研究。研究者將tracrRNA和crRNA連接形成一個guideRNA（gRNA），使得CRISPR-Cas9系統(tǒng)進一步簡化為只有g(shù)RNA和Cas9這2種組分的系統(tǒng)。gRNA利用一段約20個核苷酸的RNA序列通過堿基互補配對原則與靶DNA結(jié)合，Cas9在gRNA的引導下在靶DNA的特定位置對其進行切割。同時發(fā)現(xiàn)，外源 DNA5′-PAM（protospaceradjacentmotifs）結(jié)構(gòu)的存在對Cas9作用的發(fā)揮是必要的[9-10]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)對基因組特定的DNA片段進行切割，形成DNA雙鏈切口（double-strand breaks，DSBs）。在真核細胞內(nèi)，對DSBs的修復機制有2種：非同源末端連接（non-homologous endjoining，NHEJ）和同源重組（homologous recombina?tion，HR）。NHEJ是不依賴于模板的切口修復，通過對斷端的單純連接來實現(xiàn)，會導致核苷酸插入與缺失[11]。HR以同源DNA為模板，通過同源重組的方式修復DSBs，這種修復方式更精確。通過設(shè)計同源DNA模板，可以人為地將外源DNA片段插入基因組特定位點中[12-13]。

Cas9有2個發(fā)揮切割作用的結(jié)構(gòu)域——HNH和RuvC，分別切割靶序列的非互補鏈和互補鏈。有研究報道[14]，突變RuvC或HNH可以產(chǎn)生切口酶，切口酶只有單鏈切割活性，可以降低Cas9的脫靶效應。另外，同時突變HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域，可以得到?jīng)]有切割活性的dCas9[7]。dCas9保留了特異性結(jié)合DNA的功能，可以通過聯(lián)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如轉(zhuǎn)錄抑制因子（KRAB、Mxi1等）[15-16]或轉(zhuǎn)錄激活因子（VP64、p65等）[17-18]來調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄過程。

1.2 CRISPR-Cas12a系統(tǒng)

Cas12a（之前被命名為Cpf1）是CRISPR-Cas ClassⅡtypeⅤ-A系統(tǒng)的一種核酸內(nèi)切酶。與Cas9不同，Cas12a對DNA的切割不需要tracrRNA的協(xié)助[19]，同時它參與前體crRNA的成熟過程[20]。因此，CRISPR-Cas12a系統(tǒng)對DNA進行靶向切割只需要crRNA和Cas12a這2種組分。

RuvC和Nuc是Cas12a蛋白對DNA進行切割的2個結(jié)構(gòu)域[21-22]。與Cas9的RuvC結(jié)構(gòu)域不同，Cas12aRuvC直接切割DNA雙鏈，Nuc在這個過程中起輔助作用[22-23]。因此，Cas12a蛋白RuvC結(jié)構(gòu)域的突變直接導致其DNA切割作用的喪失。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)對靶DNA的切割依賴于對非互補鏈上富含T的PAM序列的識別[19,24]，Cas12a蛋白在遠離PAM端對DNA雙鏈進行切割[19,25]。

與CRISPR-Cas9系統(tǒng)相比，CRISPR-Cas12a更適于編輯富含AT的DNA序列，因其切割作用的發(fā)揮依賴于富含T的PAM的存在。同時，Cas12a蛋白切割DNA雙鏈形成互補的粘性末端，能增加同源重組修復的幾率，從而提高外源基因?qū)胄蔥19]。在特異性方面，也有研究報道，Cas12a的脫靶效應比Cas9更低[26-27]，這些優(yōu)勢讓CRISPRCas12a系統(tǒng)有望成為比Cas9更適于靶向基因編輯的工具。

2 靶向結(jié)合RNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)

2.1 CRISPR-RCas9

2014 年，O′Connell等[28]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）可以對ssRNA進行切割。我們知道，SpCas9識別和切割DNA作用的發(fā)揮依賴于非互補配對鏈上5′-NGG-3′PAM的存在。O′Connell等通過外源提供一段含有PAM序列的ssDNA寡聚核苷酸鏈（稱為PAMmers），這段序列能與靶ssRNA互補配對，SpCas9就能在crRNA的協(xié)同作用下識別PAM結(jié)構(gòu)，在靶ssRNA的特定位點進行切割。

RCas9系統(tǒng)對靶RNA的切割需要SpCas9、gRNA和PAMmer這3種組分。如何有效地將3種組分轉(zhuǎn)入細胞并發(fā)揮作用，是該系統(tǒng)實際應用的難題之一。其次，PAMmer是一段寡聚核苷酸單鏈，在細胞內(nèi)容易被RNaseH降解[28-29]。另外，該系統(tǒng)也會對含有PAM結(jié)構(gòu)的細胞核DNA進行攻擊，造成基因突變。這些缺點限制了RCas9在科學研究中的使用。

2.2 CRISPR-FnCas9

CRISPR-FnCas9是CRISPR-CastypeⅡ的一種亞型。FnCas9的作用方式與SpCas9相似，在crRNA和tracrRNA的協(xié)同作用下，通過識別5′-NGG-3′PAM結(jié)構(gòu)對dsDNA進行切割[30]。但與CRISPR-SpCas9不同的是，CRISPR-FnCas9中存在一種被稱為 scaRNA（smallCRISPR/Casassociat?edRNA）的小RNA，能與tracrRNA形成雜合雙鏈RNA，scaRNA:tracrRNA雜合雙鏈引導FnCas9對真核細胞中的病毒RNA進行切割[31]。CRISPR-Fn?Cas9對靶RNA的識別不依賴PAM結(jié)構(gòu)[32]。Price等[32]對CRISPR-FnCas9系統(tǒng)進行改造，將tracrRNA和scaRNA整合形成rgRNA（RNA-targetingguide RNA），利用FnCas9:rgRNA復合物對人肝癌細胞中的丙肝病毒（HCV）基因進行失活，檢測結(jié)果顯示病毒蛋白的表達下降約60%。然而，F(xiàn)nCas9靶向切割RNA的機制并不清楚[30]，Price等發(fā)現(xiàn)Fn?Cas9對HCV的表達抑制似乎是通過抑制病毒本身的復制和翻譯過程實現(xiàn)的，而不是直接降解病毒RNA。另外和CRISPR-RCas9一樣，CRISPRFnCas9同樣可以對細胞核的DNA發(fā)生作用，這種脫靶效應的存在限制了它的使用。

2.3 CRISPR-Cas13a

CRISPR-Cas13a系統(tǒng)屬于CRISPR-CasClassⅡ typeⅥ-A，最早由Abudayyeh等在纖毛菌Lepto?trichiashahii中發(fā)現(xiàn)[33]。Abudayyeh 等[33]發(fā)現(xiàn)L.sha?hiiCas13a（LshCas13a）蛋白能在一段含28個核苷酸的特異性RNA序列的協(xié)同作用下，幫助大腸桿菌抵御噬菌體MS2（一種ssRNA病毒）的入侵。同時他們發(fā)現(xiàn)在Cas13a的切割過程中存在其他旁系ssRNA的非特異性切割，這種作用機制可能與病毒入侵過程中誘導宿主細胞程序性死亡有關(guān)。之后該系統(tǒng)的作用機制逐漸被闡明。該系統(tǒng)主要包括crRNA和Cas13a（之前被命名為C2c2）蛋白2種組分。成熟的crRNA由含有28個核苷酸的靶RNA結(jié)合序列和骨架結(jié)構(gòu)組成。Cas13a蛋白是具有雙重作用的RNA酶[34]，不僅參與crRNA的成熟過程，同時能特異性地對靶RNA進行切割。Cas13a切割活性的發(fā)揮主要依賴2個HEPN結(jié)構(gòu)域，對HEPN結(jié)構(gòu)域的組氨酸和精氨酸殘基進行突變可造成Cas13a的失活，形成dCas13a。dCas13a保留ssRNA的結(jié)合能力，但不能對其進行切割。同時，Liu等發(fā)現(xiàn)靶RNA3′端的Non-GPSF（protospacerflankingsite）結(jié)構(gòu)的存在對crRNA和Cas13a作用的發(fā)揮至關(guān)重要[35]。

2017年，Abudayyeh等[36]進一步發(fā)現(xiàn)纖毛菌L.wadei來源的Cas13a（LwaCas13a）蛋白的切割活性和特異性比包括之前發(fā)現(xiàn)的LshCas13a在內(nèi)的其他Cas13a蛋白都高，并且第一次利用多個crRNA在真核細胞中實現(xiàn)對ssRNA的多位點打靶，另外并沒有觀察到因Cas13a的非特異性切割而造成真核細胞的死亡。CRISPR-Cas13a系統(tǒng)展現(xiàn)出與RNA干擾相同的作用效果，但較后者有更高的特異性，同時該系統(tǒng)組分簡單，易于作為RNA編輯工具使用，目前已越來越受到研究者的關(guān)注。

2.4 CRISPR-Cas13b

Cas13b是屬于CRISPR-CasClassⅡ typeⅥ-B的Cas蛋白。Smargon等[37]研究發(fā)現(xiàn)，Cas13b的作用機制基本與Cas13a相同，例如靶向切割ssRNA而不能切割dsRNA，參與前體RNA的成熟過程，存在對旁系ssRNA的非特異性切割等。但與Cas13a不同的是，Cas13b發(fā)揮作用需要靶RNA的兩端均存在PFS結(jié)構(gòu)，增加了該系統(tǒng)對ssRNA打靶的限制。Smargon等[37]同時也發(fā)現(xiàn)2種小的功能蛋白Csx27和Csx28，Csx27能抑制Cas13b對靶RNA序列的識別和切割作用，而Csx28則正好相反，能加強Cas13b的這種作用。

3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應用及潛在應用價值

3.1 靶向結(jié)合DNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)

3.1.1 尋找新的功能基因或致病基因 已有研究者[38-39]利用多個gRNA組成的gRNAlibrary聯(lián)合Cas9對不同基因中編碼外顯子的序列進行打靶，造成相應基因表達蛋白功能的喪失，再經(jīng)后續(xù)的陰性和陽性篩選過程，幫助找到影響細胞正常功能或?qū)е录膊〉年P(guān)鍵基因。雖然用傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)也能實現(xiàn)全基因組功能基因篩選，但CRISPR-Cas9系統(tǒng)特異性更高，適用范圍更廣。

3.1.2 構(gòu)建疾病動物/細胞模型 將Cas9和gRNA注入實驗動物的受精卵中修飾特定的基因，獲得可以遺傳的基因型，從而得到轉(zhuǎn)基因動物模型。這種方法的優(yōu)勢在于明顯縮短了建模時間，編輯特異性高，適用于大規(guī)模操作等。已有利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)建立靈長類動物模型來研究神經(jīng)精神疾病的研究[40]。目前，該方法建立動物模型最大的挑戰(zhàn)在于存在遺傳學嵌合現(xiàn)象（genetic mosaicism），產(chǎn)生該現(xiàn)象部分受到CRISPR-Ca9s系統(tǒng)基因打靶效率的影響。

也有研究[41]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在人誘導多能干細胞（hiPSC）中插入2種與產(chǎn)生阿爾茲海默癥β淀粉樣蛋白有關(guān)的遺傳突變，隨后誘導這些干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元細胞并產(chǎn)生大量β淀粉樣蛋白，從而模擬阿爾茲海默癥的疾病表現(xiàn)。

3.1.3 用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控 dCas9可以通過直接與DNA作用元件結(jié)合，或聯(lián)合轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子，來調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄過程，但目前認為dCas9的這種調(diào)節(jié)作用相對較弱。有研究[18,42-43]利用多個gRNA引導攜有不同轉(zhuǎn)錄因子的dCas9結(jié)合同一個DNA作用元件（如轉(zhuǎn)錄啟動子），不同轉(zhuǎn)錄因子之間發(fā)揮協(xié)同作用，從而大大增強了dCas9對轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)效應。

3.1.4 用于活細胞的基因/蛋白顯像 帶有熒光蛋白標簽的dCas9能結(jié)合特定的DNA序列，通過熒光蛋白顯示活細胞內(nèi)某個基因的空間位置。傳統(tǒng)用于標記DNA的熒光原位雜交（FISH）技術(shù)需要固定細胞，無法用于活細胞的基因追蹤。CRISPR-dCas9系統(tǒng)這種顯像的功能不僅可以用于檢測某種特定基因，還可用于研究基因組中各功能和結(jié)構(gòu)元件之間的空間位置關(guān)系。

Yasuda等[44]利用CRISPR-Cas9介導同源重組修復對內(nèi)源性蛋白進行單細胞標記（single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair，SLENDR）精確標記發(fā)育大腦中的內(nèi)源性蛋白。更實際的一項研究[45]利用CRISPR-Cas9輔助的基于紙片的診斷模塊來檢測血液、尿液或唾液樣品的寨卡病毒（Zikavirus,ZIKV）

3.1.5 在基因治療上的潛在應用 CRISPR-Cas9能在特定位點切割DNA形成DSB，再通過NHEJ或HR方式引起異?；蚴Щ罴罢；蛑亟?，從而修復特定的基因功能，為人類遺傳性疾病提供了新的治療手段。近年，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)治療鐮刀形貧血[46]、杜氏肌營養(yǎng)不良癥[47]等遺傳性疾病及清除受感染細胞中的人免疫缺陷病毒（HIV）治療艾滋病[48-49]的研究取得了較大進展。

3.2 靶向結(jié)合RNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)

CRISPR-RCas9、CRISPR-FnCas9、CRISPRCas13系統(tǒng)均能靶向作用于ssRNA，被認為是對mRNA轉(zhuǎn)錄組水平進行調(diào)控的重要工具，mRNA轉(zhuǎn)錄組水平的調(diào)控相較于DNA基因組水平的調(diào)控更加靈活、直接。自2014年O′Connell等發(fā)現(xiàn)RCas9可以靶向切割ssRNA以來，研究者就開始關(guān)注靶向結(jié)合RNA的CRISPR-Cas系統(tǒng)在mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA顯像、mRNA定向定位、RNA病毒干擾等方面的潛在應用價值，并做了初步探索。而最新發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas13系統(tǒng)，由于其組分簡單、特異性高、作用機制相對明確等優(yōu)點，成為研究者關(guān)注的焦點。以下以CRISPR-Cas13系統(tǒng)為例做進一步闡述。

3.2.1 利用CRISPR-Cas13系統(tǒng)對RNA的直接切割作用 Cas13可以通過直接切割特定mRNA來下調(diào)基因的表達，與傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)相比，其適用范圍更廣。crRNA可以設(shè)計成gRNA庫，同時針對mRNA的多個位點進行打靶，實現(xiàn)對多個基因表達的下調(diào)。另外，先前有研究[50]將一段RNA剪切結(jié)構(gòu)域和RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Pumilio/fem-3整合成一個人工RNA核酸內(nèi)切酶，利用該酶對細菌和人的多種RNA實現(xiàn)表達沉默。Cas13的出現(xiàn)使上述過程的實現(xiàn)變得更加容易，可以用于沉默人體細胞中致病mRNA的表達[51]。

3.2.2 利用CRISPR-dCas13系統(tǒng)對RNA的特異性識別作用 通過對dCas13的切割結(jié)構(gòu)域進行突變，可以得到?jīng)]有切割活性的dCas13蛋白。dCas13保留了特異性結(jié)合ssRNA的功能，可以作為一種gRNA引導的RNA結(jié)合蛋白應用于轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的編輯。

①轉(zhuǎn)錄后水平的mRNA編輯 利用dCas13能靶向結(jié)合但不能切割RNA的這一特性，聯(lián)合GFP等熒光顯示蛋白，可以用于顯示細胞內(nèi)mRNA的活動軌跡。2016年Nelles等[29]最先利用沒有切割活性的RCas9-GFP、sgRNA和PAMmer追蹤ACTB mRNA從細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中的過程，同時通過FISH觀察到ACTB、CCNA2和TFRC等3種mRNA的聚集現(xiàn)象。同樣我們可將dCas13蛋白與GFP等熒光顯示蛋白結(jié)合，用于顯示特定mRNA在細胞內(nèi)的位置及轉(zhuǎn)移軌跡，從而監(jiān)測細胞在不同環(huán)境狀態(tài)（如應激、損傷、疾病及藥物干預等）下mRNA轉(zhuǎn)錄組的行為學變化。更實際的應用價值在于利用dCas9的這種追蹤定位功能來富集某些表面標志不明確的成體干細胞，利用這些成體干細胞表達某種特定的mRNA，通過CRISPRCas13系統(tǒng)進行顯示來達到分離純化這些細胞的目的[52]。

其次，CRISPR-dCas13系統(tǒng)可以在轉(zhuǎn)錄后水平增強或抑制基因的表達。通過與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯的增強子或沉默子結(jié)合，dCas13可以在沒有改變mRNA數(shù)量的情況下增強或抑制某個特定基因的蛋白表達，這種調(diào)控基因表達的方式不會對基因組本身造成影響。

另外，dCas13可以幫助mRNA定位到細胞的特定位置從而發(fā)揮其功能。例如，在神經(jīng)元細胞中維持突觸結(jié)構(gòu)和活性的PSD-95（postsynaptic densityprotein95）蛋白，其mRNA需要通過樹突到達特定作用部位后再翻譯成PSD-95蛋白[53]，發(fā)揮相應的功能。dCas13可以通過與轉(zhuǎn)運因子結(jié)合幫助mRNA運輸?shù)教囟ú课唬缤挥|前或突觸后末端，從而維持突觸的生長和功能，這對神經(jīng)元損傷后再生修復有重要意義[52]。

②pre-mRNA水平的編輯 dCas13可以引導剪接因子至pre-mRNA的特定位置，從而調(diào)控mRNA的剪接過程。之前有研究[54-55]利用RNA結(jié)合蛋白（如PUF、MS2等）聯(lián)合剪接增強因子（如富含精氨酸/絲氨酸的結(jié)構(gòu)域）或剪接抑制因子（如富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域）來改變特定mRNA的剪接模式。Cas13能使靶向pre-mRNA的過程更容易實現(xiàn)，并且能對多個位點同時進行操作，可用于干預mRNA的異常剪接過程，從而逆轉(zhuǎn)因mRNA的異常剪接而導致的細胞功能異常等后果。

另外，dCas13可用于REPAIR的編輯過程，REPAIR的全稱為RNA Editing for Programmable adenosine-to-inosine（A-to-I） Replacement。已有研究[56]利用dCas13b-ADARDD實現(xiàn)了這一編輯過程。其意義在于，許多疾病如局灶性癲癇、杜氏肌營養(yǎng)不良癥及帕金森病等都與G-to-A的基因突變有關(guān)，REPAIR過程可以在mRNA水平逆轉(zhuǎn)A突變，從而達到治療疾病的目的。

3.2.3 對RNA病毒的干擾 發(fā)現(xiàn)于細菌體內(nèi)的CRISPR-Cas13系統(tǒng)不僅能直接對侵入細菌的噬菌體RNA進行切割，同時能激活細菌的免疫系統(tǒng)來抵御外來的噬菌體RNA[33]。利用CRISPRCas13系統(tǒng)的這一特性，可以干擾RNA病毒在真核細胞中的表達。早前也有研究[32]利用FnCas9來抑制真核細胞中人HCV的表達。相較于Fn?Cas9，Cas13的作用機制更加明確，不僅可以直接或通過細胞自身的免疫系統(tǒng)抑制RNA病毒的活性，而且可以用于干擾需要轉(zhuǎn)錄成RNA發(fā)揮作用的DNA病毒。

3.2.4 腫瘤等疾病的治療 目前腫瘤的治療注重于靶向殺傷腫瘤細胞而不對正常細胞造成影響。理論上，CRISPR-Cas13系統(tǒng)能特異性結(jié)合腫瘤細胞的mRNA，能夠直接影響某一特定mRNA功能的發(fā)揮，同時可以激活細胞程序性死亡過程，直接殺死腫瘤細胞[57-58]。目前尚須進一步的研究來驗證和完善這一推論，但Cas13用于腫瘤靶向治療的前景不容忽視。

4 結(jié)語

參考文獻