左靜　甄佳秀　楊正艷　李月恒　羅俊

第三期牙本質(zhì)是牙齒萌出后在不斷受到各種內(nèi)源性及外源性病理刺激后牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體產(chǎn)生的防御修復(fù)反應(yīng)，包括反應(yīng)性牙本質(zhì)及修復(fù)性牙本質(zhì)2 種[1-2]。由于第三期牙本質(zhì)的形成可增加剩余牙本質(zhì)厚度[3]，且其新形成的牙本質(zhì)小管明顯彎曲、數(shù)目較少，可有效減少外部刺激向髓腔內(nèi)傳導(dǎo)，對(duì)于保存健康牙髓、緩解牙本質(zhì)過敏癥狀等方面有重要意義。

低強(qiáng)度脈沖超聲(low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是一種非侵入性的理療方法，因其對(duì)骨組織獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于新鮮骨折及骨不連等的臨床治療[4]。由于牙體硬組織與骨組織結(jié)構(gòu)的相似性，且有報(bào)道認(rèn)為早期形成的第三期牙本質(zhì)具有某些骨樣特征[5]，我們推測(cè)LIPUS可能對(duì)牙體硬組織的修復(fù)也有一定作用。有研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的牙齒經(jīng)LIPUS輻照后有修復(fù)性牙本質(zhì)形成，且可觀察到DMP1、DSPP等牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白表達(dá)增加[6]，說明LIPUS可能對(duì)牙本質(zhì)基質(zhì)形成及早期礦化誘導(dǎo)有一定作用，但對(duì)于其是否會(huì)調(diào)節(jié)鈣鹽轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)第三期牙本質(zhì)的礦化成熟尚無任何研究。因而本實(shí)驗(yàn)希望通過檢測(cè)LIPUS 輻照后牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體上鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)主要蛋白Cav1.2及NCX1表達(dá)變化，探討LIPUS是否對(duì)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)具有調(diào)節(jié)作用及其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分組及模型建立

成年雄性SD大鼠[(360±13) g， 12～13 周，n=40]，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將40只SD大鼠10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉(0.3 ml/100 g)在右側(cè)上頜第一磨牙面采用改良備洞法建立牙本質(zhì)損傷模型[7-8]。隨機(jī)選取其中20只大鼠對(duì)備洞牙予以超聲輻照，剩余20只大鼠對(duì)未備洞的左側(cè)上頜第一磨牙予以超聲輻照，最終形成備洞組、備洞+LIPUS組、LIPUS組及空白對(duì)照組4 個(gè)研究組。所有操作均由一名經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)技術(shù)員完成。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)計(jì)劃獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2　超聲設(shè)備、參數(shù)設(shè)定及輻照方式

本實(shí)驗(yàn)超聲設(shè)備為低強(qiáng)度脈沖超聲儀(重慶海扶)，使用前已通過超聲功率計(jì)UPM-DT-1重新調(diào)試并校正了強(qiáng)度，設(shè)定超聲波輸出頻率1.5 MHz，功率30 mW/cm2, 脈沖信號(hào)長(zhǎng)度200 us，重復(fù)率1 KHz。超聲換能器探頭為10 mm×5 mm的長(zhǎng)方形，形似牙刷，使用時(shí)表面涂布一層超聲耦合劑，將其縱向輕置于磨牙咬合面(圖 1)，每天連續(xù)輻照20 min?？瞻讓?duì)照組及LIPUS組采用超聲假照處理。

分別在持續(xù)作用1、 3、 7 d及14 d后處死SD大鼠，并即刻將SD大鼠上頜磨牙連同周圍牙槽骨一并取下，用于后續(xù)處理分析。

1.3　組織病理學(xué)分析

取出的上頜磨牙區(qū)組織40 g/L甲醛液固定48 h，充分沖洗，10%EDTA脫礦液中脫礦3～4 周，修整組織塊，石蠟包埋，層厚4 μm連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察。顯微病理圖文分析軟件(Olympus DP80 YC.YX-2050，日本)采集圖片，進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4　免疫組化

上述石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2去離子水避光條件下孵育10～20 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，胃蛋白酶37 ℃條件下消化15～30 min進(jìn)行抗原修復(fù)，正常山羊血清工作液封閉， 37 ℃孵育10～30 min后傾去封閉液，以封閉非特異性抗原，分別滴加Cav1.2， NCX1單克隆抗體(1∶200， Abcam, UK), 4 ℃孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育30 min，滴加SABC,鏡下控制使用DAB工作液顯色，蘇木素復(fù)染1～2 min。上述每步后均用PBS沖洗5 min×3，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟相同。顯微病理圖文分析軟件采集圖片，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)圖片的IOD SUM及area進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算平均吸光度值(MOD,mean density)，MOD=IOD SUM/area，繪制MOD值變化曲線，觀察比較各蛋白表達(dá)變化。

圖 1　低強(qiáng)度脈沖超聲儀及超聲輻照示意圖

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)　果

2.1　組織病理學(xué)觀察

2.1.1空白對(duì)照組成牙本質(zhì)細(xì)胞呈柱狀緊密排列于牙本質(zhì)內(nèi)側(cè)，髓腔內(nèi)細(xì)胞形態(tài)正常，排列層次清楚，由外向內(nèi)分為乏細(xì)胞層、多細(xì)胞層及固有牙髓層，多個(gè)小血管散在分布于髓腔內(nèi)(圖 2)。

2.1.2LIPUS輻照組與空白對(duì)照組相比，髓腔內(nèi)細(xì)胞形態(tài)及層次結(jié)構(gòu)無明顯變化，僅近輻照側(cè)多細(xì)胞層牙髓細(xì)胞少許增多，有向成牙本質(zhì)細(xì)胞層遷移的趨勢(shì)(圖 3)。

2.1.3備洞組1 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞層排列紊亂，近牙尖處部分成牙本質(zhì)細(xì)胞消失，有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，多細(xì)胞層細(xì)胞增多，髓腔內(nèi)血管擴(kuò)張充血， 3 d時(shí)病理改變與1 d相似。 7 d時(shí)炎癥緩解，牙髓細(xì)胞增多，有少量長(zhǎng)梭型細(xì)胞向牙本質(zhì)遷移形成成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，有少量修復(fù)性牙本質(zhì)形成， 14 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞增多，乏細(xì)胞層不明顯，多細(xì)胞層細(xì)胞增加(圖 3)。

2.1.4LIPUS+備洞組1 d及3 d時(shí)炎癥明顯，髓腔內(nèi)細(xì)胞表現(xiàn)與備洞組相似，但7 d及14 d時(shí)遷移而來的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)目相對(duì)而言更多，且修復(fù)性牙本質(zhì)形成更加明顯(圖 3)。

2.2　免疫組化圖像分析

2.2.1Cav1.2定位與表達(dá)變化免疫組化染色顯示Cav1.2蛋白在各組均有表達(dá)，染色陽性呈現(xiàn)為黃色-棕黃色， 定位于深入牙本質(zhì)內(nèi)的成牙本質(zhì)細(xì)胞突起上。

備洞組、備洞+LIPUS組各時(shí)間點(diǎn)及LIPUS組1 d時(shí)MOD值均較空白對(duì)照組大(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。備洞+LIPUS組在1 d(P=0.008)及3 d(P=0.017)MOD值比備洞組明顯升高(圖 4)，而7 d及14 d時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MOD值曲線總體表現(xiàn)為緩慢下降趨勢(shì)(圖 5A)。

D: 牙本質(zhì); PD: 前期牙本質(zhì); P: 牙髓; OD: 成牙本質(zhì)細(xì)胞層; Cf: 乏細(xì)胞層; Cr: 多細(xì)胞層

圖 2空白對(duì)照組(HE,×400)

D: Dentin; PD: Predentin; P: Pulp; OD: The odontoblastic cell layer; Cf: Cellular few layer; Cr: Cellular rich layer

Fig 2Sections of the control group(HE，×400)

圖 3牙髓牙本質(zhì)病理組織學(xué)觀察(HE，×400)

Fig 3Paothological observation of dental pulp and dentin(HE，×400)

圖 4Cav1.2蛋白的表達(dá)(→： 指黃棕色區(qū)域?yàn)榈鞍妆磉_(dá)區(qū)域)(免疫組織化學(xué)染色,×400)

Fig 4Cav1.2 expression(Arrow： Positive staining areas)(IHC,×400)

圖 5　各組陽性染色平均吸光度值變化曲線

2.2.2鈉鈣交換體NCX1蛋白定位與表達(dá)變化免疫組化染色顯示NCX1在各組均有表達(dá)，染色陽性呈現(xiàn)為棕黃色-深棕色，主要定位于髓腔內(nèi)各種牙髓細(xì)胞胞膜及細(xì)胞質(zhì)，其中在成牙本質(zhì)細(xì)胞胞體及突起上表達(dá)更明顯。

備洞組1 d(P=0.002)及備洞+LIPUS組1 d(P=0.000 3)、 3 d(P=0.001)時(shí)MOD值較空白組顯著升高，其余組別MOD值較空白對(duì)照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。備洞+LIPUS組MOD值與備洞組相比在1 d(P=0.000 4)及3 d(P=0.008)時(shí)明顯升高(圖 6)， 7 d及14 d則無明顯差異，MOD值曲線總體表現(xiàn)為緩慢下降趨勢(shì)(圖 5B)。

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)通過建立牙本質(zhì)損傷的動(dòng)物模型，探討低強(qiáng)度脈沖超聲是否對(duì)牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體及鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白具有調(diào)節(jié)作用。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)損傷后牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體會(huì)產(chǎn)生一系列炎癥修復(fù)反應(yīng)，這證明了牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體自身的修復(fù)再生潛能，而這種修復(fù)過程是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的，并非一種完全獨(dú)立的生命活動(dòng)[9]。備洞+LIPUS組形成的修復(fù)性牙本質(zhì)及成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞均較備洞組更明顯，由此推測(cè)低強(qiáng)度脈沖超聲可能誘導(dǎo)了牙髓細(xì)胞向損傷區(qū)域遷移分化，參與并促進(jìn)了第三期牙本質(zhì)的形成， 這與Al-Daghreer 等[10-11]的研究結(jié)果一致。然而有趣的是單純超聲輻照正常牙齒并不能觀察到有修復(fù)性牙本質(zhì)形成或其他明顯的病理變化。因而我們推測(cè)超聲可能是在牙齒損傷修復(fù)開啟后對(duì)修復(fù)反應(yīng)具有協(xié)同強(qiáng)化作用。

圖 6NCX1在髓腔的表達(dá)情況，→所指黃棕色區(qū)域?yàn)榈鞍妆磉_(dá)區(qū)域(免疫組織化學(xué)染色,×400)

Fig 6The expression of NCX1， Arrow: Positive staining areas(IHC,×400)

Cav1.2為成牙本質(zhì)細(xì)胞上主要的L-型鈣離子通道蛋白基因型，可將循環(huán)血液中的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，NCX1是牙髓組織上鈉鈣交換體的主要基因型，是成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子向礦化前沿定向外排系統(tǒng)的重要組成部分，二者對(duì)于促進(jìn)牙本質(zhì)礦化成熟及維持細(xì)胞內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)具有重要作用，Cav1.2-NCX1途徑是目前學(xué)術(shù)界認(rèn)可的牙本質(zhì)礦化時(shí)鈣離子的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式[12-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cav1.2及NCX1在牙本質(zhì)損傷后表達(dá)明顯增加， 1 d時(shí)最高，后逐漸下降， 14 d時(shí)基本降至空白對(duì)照組水平，提示Cav1.2、NCX1在損傷早期即被迅速激活，推測(cè)其可能參與了損傷的早期感知與修復(fù)過程。而備洞+LIPUS組在1天及3天的蛋白表達(dá)量又明顯高于單純備洞組，提示超聲可能在損傷早期對(duì)Cav1.2及NCX1的表達(dá)具有明顯促進(jìn)作用，后期則不明顯，超聲的這一現(xiàn)象在促進(jìn)骨折愈合方面已有相關(guān)報(bào)道[15]，但在牙齒修復(fù)尚無研究。與空白對(duì)照組相比，Cav1.2 在LIPUS輻照1 d時(shí)明顯提高，可能是由于超聲的機(jī)械刺激所致，謝亞佳 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)Cav1.2在張應(yīng)力刺激12 h時(shí)基因表達(dá)明顯增加，但24 h后表達(dá)水平即下調(diào)，這種現(xiàn)象可能解釋了Cav1.2蛋白在1 d時(shí)表達(dá)明顯升高的原因，但也不能完全排除是實(shí)驗(yàn)誤差所致。其余時(shí)間點(diǎn)單純超聲刺激并沒有觀察到有明顯的蛋白表達(dá)增加，結(jié)合HE染色顯示的LIPUS組的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，這可能提示本實(shí)驗(yàn)所設(shè)超聲輻照較安全，并不會(huì)誘導(dǎo)正常組織發(fā)生明顯明顯生理及病理改變，但其具體安全閾值及促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的最適閾值仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述， 低頻脈沖超聲可能會(huì)促進(jìn)牙本質(zhì)損傷早期鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)主要蛋白的表達(dá)，加快第三期牙本質(zhì)修復(fù)進(jìn)程，對(duì)牙體硬組織的防御修復(fù)具有一定的臨床意義。

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