呂麗華　黃華　陸世銀　蘇志恒

近來(lái)，聚乳酸可吸收樁膜系統(tǒng)有望為乳牙殘根、殘冠修復(fù)提供新的方法。聚乳酸作為一種新型生物降解材料，其降解時(shí)間與乳牙牙根生理吸收時(shí)間較為同步且最終以ATP、H2O及CO2形式排除體外[1-3]。將聚乳酸可吸收根管樁在一定量的三氯甲烷中充分溶解并采用溶劑揮發(fā)成膜法[4]制成聚乳酸薄膜，對(duì)可吸收根管樁與根管壁間的封閉性能良好[5]，并且具有良好的生物相容性[6]。然而，三氯甲烷疑為致癌物質(zhì)[7]，人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)將三氯甲烷歸為第二類(lèi)溶劑，溶劑殘留限量為0.006%(60 ng/mg)，我國(guó)藥典規(guī)定三氯甲烷允許殘留限量為0.006%(60 ng/mg)[8]。為保證臨床應(yīng)用安全，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]中殘留溶劑測(cè)定法，對(duì)醫(yī)用聚乳酸薄膜中三氯甲烷殘留量的測(cè)定方法進(jìn)行研究，旨在建立靈敏度高，精密度好，測(cè)定結(jié)果可靠的分析方法。

1　材料與方法

1.1　儀器與試藥

GC2010 Plus氣相色譜儀、 RESTEK RTX毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm， 日本島津公司)。

醫(yī)用聚乳酸可吸收根管樁(INION，芬蘭)；三氯甲烷為分析純(99.5%，廣東汕頭市西隴化工廠(chǎng))，環(huán)己烷為色譜純(99.9%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.2　色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

1.2.1色譜條件GC2010 Plus氣相色譜儀， RESTEK RTX毛細(xì)管色譜柱； 檢測(cè)器：電子捕獲檢測(cè)器(ECD), 檢測(cè)器溫度: 270 ℃；柱溫：85 ℃維持 3 min；分流進(jìn)樣方式，分流比：10∶1；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；載氣：高純氮?dú)猓魉伲?.0 ml/min；進(jìn)樣量：1 μl。

1.2.2系統(tǒng)適用性及專(zhuān)屬性試驗(yàn)

1.2.2.1對(duì)照品溶液的制備對(duì)照品貯備液：精密稱(chēng)取三氯甲烷20 mg，置于100 ml棕色容量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。

對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品貯備液1 ml，置于100 ml棕色容量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻，配成2 000 ng/ml作為對(duì)照品溶液。

1.2.2.2供試品溶液的制備精密稱(chēng)取聚乳酸樁0.1 g，置于具塞棕色瓶中，加入三氯甲烷50 ml，密塞，靜置3 h，待聚乳酸釘完全溶解后，將0.2 ml溶解液涂布在7 mm×20 mm的醫(yī)用載玻片上制膜(0.40 mg/張)，分別在25 ℃、37 ℃、60 ℃恒溫干燥箱中處理12、 24 h。每張薄膜加入400 μl環(huán)己烷于搖床上固定轉(zhuǎn)數(shù)浸泡10 min。

1.2.2.3加標(biāo)供試品溶液的制備取已知三氯甲烷含量的薄膜樣品一張，置于棕色小瓶中，加入對(duì)照品溶液400 μl，于搖床上固定轉(zhuǎn)數(shù)浸泡10 min。

1.2.2.4測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、加標(biāo)供試品溶液和環(huán)己烷溶劑液各1.0 μl，在上述系統(tǒng)適應(yīng)性的色譜條件下，供試品中三氯甲烷色譜峰與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并與其他共存成分達(dá)到基線(xiàn)分離，陰性無(wú)干擾，理論塔板數(shù)大于5000，各項(xiàng)色譜峰參數(shù)合格，色譜圖見(jiàn)圖 1。

圖 1色譜圖

Fig 1Chromatogram

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1精密度試驗(yàn)精密量取三氯甲烷濃度為1 000 ng/ml的溶液1 μl，按前述色譜條件，連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算三氯甲烷的峰面積的RSD 0.9%。 結(jié)果顯示，三氯甲烷峰面積的RSD(%)值小于2.0%，表明該方法精密度良好。

1.3.2線(xiàn)性范圍的考察分別精密量取對(duì)照品溶液0.062 5、 0.125、 0.25、 0.75、 1.25、 1.75、 2.5 ml，分別置于5 ml容量瓶中，均加入環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻，配成25、 50、 100、 300、 500、 700、 1 000、 2 000 ng/ml濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液。按前述色譜條件測(cè)定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。線(xiàn)性方程為A=149.56C+99 978(r=0.999 9)，三氯甲烷檢測(cè)濃度線(xiàn)性范圍25～2 000 ng/ml。

1.3.3檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)采用逐步稀釋法測(cè)得，以S/N=3時(shí)計(jì)算三氯甲烷的檢測(cè)限，以S/N=10時(shí)計(jì)算三氯甲烷的定量限。結(jié)果檢測(cè)限為1.50 ng/ml，折算成樣品的含量為1.50 ng/mg；定量限為4.62 ng/ml，折算成樣品的含量為4.62 ng/mg。

1.3.4重復(fù)性試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知三氯甲烷含量的樣品0.40 mg，分別置于棕色小瓶中，共3 份，分別加入400 μl的對(duì)照品液，于搖床浸泡萃取10 min，搖勻，按前述色譜條件測(cè)定及外標(biāo)法計(jì)算， 三氯甲烷的平均回收率為98.35%， RSD=1.98%。結(jié)果顯示，重復(fù)性和回收率的RSD(%)值均小于2.0%，回收率在95.0～105.0%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法重復(fù)性和回收率良好。

1.4　供試品中三氯甲烷殘留量測(cè)定

取三氯甲烷和經(jīng)恒溫干燥箱25 ℃、37 ℃、60℃分別處理12、 24 h的6批樣品，按已知方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，在前述色譜條件下測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算三氯甲烷的殘留量。

2　結(jié)　果

經(jīng)恒溫干燥箱25 ℃處理12、24 h的樣品中三氯甲烷的平均殘留量分別為1 918 ng/mg，RSD=2.8%； 1 428 ng/mg， RSD=4.0%。 經(jīng)恒溫干燥箱37 ℃處理12、 24 h的樣品中三氯甲烷的平均殘留量分別為1 207 ng/mg，RSD=2.2%； 724 ng/mg，RSD=2.6%。經(jīng)恒溫干燥箱60 ℃處理12、 24 h的樣品中三氯甲烷的平均殘留量分別為68.37 ng/mg， RSD=3.5%； 18.30 ng/mg， RSD=2.4%。 結(jié)果見(jiàn)表 1。結(jié)果表明：經(jīng)恒溫干燥箱60 ℃處理24 h的樣品中三氯甲烷的平均殘留量18.30 ng/mg低于國(guó)家限量60 ng/mg，保證臨床應(yīng)用的安全性。

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)在溶劑選擇方面考察了乙酸乙酯、石油醚、環(huán)己烷三種溶劑對(duì)三氯甲烷的溶解性，其中溶劑為環(huán)己烷時(shí)，三氯甲烷含量最高，石油醚次之， 乙酸乙酯最低，且環(huán)己烷萃取所得供試品色譜圖雜質(zhì)最少，基線(xiàn)最穩(wěn)定，故綜合考慮選用環(huán)己烷作為萃取溶劑。

目前,對(duì)殘留溶劑測(cè)定一般選擇火焰離子化檢測(cè)(FID)檢測(cè)器，可以得到較寬的線(xiàn)性范圍；但對(duì)含鹵族元素等電負(fù)性較強(qiáng)基團(tuán)的殘留溶劑如三氯甲烷等，為提高檢測(cè)的靈敏度，可采用電子捕獲檢測(cè)器(ECD)檢測(cè)器[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇能獲得較FID更高靈敏度的ECD檢測(cè)器。

表 1聚乳酸薄膜三氯甲烷殘留量測(cè)定結(jié)果

Tab 1Measurement result of trichloromethane residual amount in polylactic acid membrane

三氯甲烷保留時(shí)間(min)殘留量(ng/mg)平均殘留量(ng/mg)RSD(%)12h25℃2．1742．1772．17519681862192319182．824h25℃2．1752．1752．17714881374142314284．012h37℃2．1762．1732．17612311211117912072．224h37℃2．1752．1752．171　741　727　704　7242．612h60℃2．1832．1812．18468．4565．9270．7568．373．524h60℃2．1842．1842．18418．1418．8017．9518．302．4

干燥溫度及時(shí)間是影響聚乳酸薄膜制作中三氯甲烷殘留的兩個(gè)重要因素，樣品處理中考慮三氯甲烷的可揮發(fā)性，延長(zhǎng)其揮發(fā)時(shí)間及提高溫度加快三氯甲烷的揮發(fā)，而若揮發(fā)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)溫度過(guò)高，樣品脆性加大韌性降低，無(wú)臨床實(shí)際應(yīng)用意義[10]。故本實(shí)驗(yàn)選擇在25、 37、 60 ℃恒溫干燥箱中進(jìn)行12、 24 h處理。有相關(guān)研究表明石墨烯能提高聚乳酸薄膜的熱穩(wěn)定性和增強(qiáng)其力學(xué)性[11]，因此，后續(xù)優(yōu)化工藝時(shí)一方面可考慮加入相關(guān)物質(zhì)以適當(dāng)提高干燥溫度、延長(zhǎng)干燥時(shí)間從而進(jìn)一步降低三氯甲烷的殘留量；另一方面，改進(jìn)工藝也可以考慮使用玉米淀粉或糖類(lèi)發(fā)酵合成，通過(guò)擠出流涎成型法、吹塑成型法、熔融法等方法制成不含有毒物質(zhì)的聚乳酸薄膜[12-14]。目前，已有使用納米技術(shù)，通過(guò)“乳化-溶劑揮發(fā)法”制成聚乳酸相關(guān)產(chǎn)品[15]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)方法學(xué)考察，該方法精密度良好，三氯甲烷檢測(cè)濃度在25～2 000 ng/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，定量限為4.62 ng/ml，樣品測(cè)定重復(fù)性和回收率良好，表明該方法靈敏，準(zhǔn)確。測(cè)定結(jié)果表明，所檢測(cè)樣品中最低為17.95 ng/mg低于國(guó)家藥典規(guī)定限度60 ng/mg，確保臨床應(yīng)用安全。本課題組相關(guān)研究聚乳酸薄膜滿(mǎn)足口腔生物材料要求的生物功能性及相容性，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了樣品的安全性，為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供可靠依據(jù)。

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