楊學(xué)芳　蘇萬?！O文娟

玉竹又名葳蕤、女萎[1]，為百合科黃精屬[2]植物玉竹的干燥根莖，為傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材，具有滋陰、潤肺、養(yǎng)胃生津等功效。該植物不僅作為藥品應(yīng)用，還廣泛應(yīng)用于保健品以及食療中[3]，是衛(wèi)生部公布的藥食兼用87種植物之一[4]。配方顆粒具有體積小、易于保存、易于攜帶、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，突破了傳統(tǒng)中藥飲片煎煮服用的模式，給患者用藥帶來方便。雖然中藥配方顆粒優(yōu)勢明顯，但基礎(chǔ)研究還相對薄弱[5]，目前關(guān)于玉竹配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究還未見報道。2015版《中國藥典》中玉竹飲片項下，對本品的薄層鑒別未做研究，不能為玉竹配方顆粒的定性研究提供參考，且定量方法只適用于單一飲片中玉竹多糖的測定，不適用工藝中以麥芽糊精為輔料進行干燥制粒的配方顆粒中的玉竹多糖的測定。

玉竹飲片的提取物由于黏度大、干粉軟化點較低，噴霧干燥存在黏壁現(xiàn)象，試驗表明，采用加入一定比例的麥芽糊精進行真空干燥的方式較為可行，但麥芽糊精的加入影響了產(chǎn)品中活性成分玉竹多糖[6]的含量測定。多糖是一類成分較為復(fù)雜的混合物，常用的測定方法是比色法，利用水提醇沉的方式將多糖與小分子糖類分離后顯色測定，但麥芽糊精是一類易溶于水不溶于乙醇的糖類輔料，醇沉不能將其與多糖分離，從而會導(dǎo)致產(chǎn)品中多糖測定含量偏高。本研究采用糖化酶將麥芽糊精水解為小分子糖類，再用醇沉的方式將其去除[7]，從而消除麥芽糊精對玉竹多糖含量測定的干擾，為含麥芽糊精類配方顆粒中多糖測定方法的建立提供參考，為規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器 UV-2450紫外-可見分光光度計（日本島津）；XS 205電子分析天平（梅特勒）；DD70薄層成像儀（德國迪賽克），TDL-40B離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-500B超聲儀 (江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；HH恒溫水浴鍋（金壇市中大儀器廠）；硅膠G板（青島海洋化工分廠）。

1.2試藥與藥品 D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-201506，含量以99.9%計），玉竹對照藥材（批號：121467-201103，3g/支），均購于中國食品藥品檢定研究院；玉竹配方顆粒，濟川藥業(yè)集團有限公司自制；麥芽糊精（批號：160714，安徽山河藥用輔料股份有限公司）；硫酸為優(yōu)級純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；苯酚為生化試劑（綠葉集團）；水為超純水，實驗室自制；其余試劑均為分析純。

2　TLC定性鑒別

取本品0.3 g，加乙醇30 mL，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取玉竹對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液10μL、對照藥材溶液15μL，分別點于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 （3∶1∶4∶0.2） 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖1所示。

圖1　玉竹配方顆粒TLC圖譜

3　玉竹多糖含量測定

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取對照品12.66 mg，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

精密量取對照品溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0 mL，分別置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各2 mL，置具塞比色管中，分別加4%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7.0 mL，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法 (《中國藥典》2015年版四部通則0401)，在490 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=0.0509X+0.0089，r=0.999 1，表明D-無水葡萄糖在2.53 μg/mL～12.65μg/mL的范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

3.2供試品溶液的制備及測定方法 取本品，研細，取約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加熱水100 mL使溶解，放冷，加入糖化酶0.05 g，搖勻，置37℃干燥箱中保溫2小時。取出，煮沸5分鐘使酶失活。趁熱過濾，放冷并適當(dāng)濃縮，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水稀釋刻度。精密量取2 mL，置20 mL離心管中，加乙醇10 mL攪拌，離心10分鐘（4000 r/min），取沉淀加2 mL熱水溶解，重復(fù)醇沉離心一次。沉淀加水稍清洗，棄去洗液，沉淀轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法，自“4%苯酚溶液1 mL”，依法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量[8-9]。

3.3精密度試驗 按上述方法測定D-無水葡萄糖，取同一對照品溶液連續(xù)測定6次，RSD為0.29%（n=6），表明該方法精密度良好。

3.4重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號：1610013）6份，按3.2項下方法操作，依法測定D-無水葡萄糖的含量。結(jié)果平均含量為22.87 mg/g，RSD為1.21%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

3.5穩(wěn)定性試驗 分別取對照品溶液及玉竹配方顆粒（批號：1610013）供試品溶液，按上述檢測條件，分別于0、0.5、1、3.5、4.5、6小時進樣，測定D-無水葡萄糖吸光度。RSD分別為0.82%（n=6）、0.53%（n=6），表明對照品及供試品溶液在6小時內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3.6加樣回收率 試驗取供試品6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入D-無水葡萄糖對照品12 mg，照3.2項下方法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果平均回收率為95.0%，RSD=0.70%（n=6），結(jié)果見表1所示。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果?。╪=6）

3.7樣品測定 分別精密稱定三批玉竹配方顆粒（批號：1610013、1610023、161033） 約1 g，按4.2項下方法制備供試品，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定D-無水葡萄糖的含量，結(jié)果見表2所示。

表2　三批樣品中D-無水葡萄糖含量測定結(jié)果

4　討論

（1）薄層鑒別試驗研究過程中，曾吸取供試品溶液1μL、對照藥材溶液10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，顯色后發(fā)現(xiàn)，供試品及對照藥材斑點均不夠清晰；后嘗試進一步加大點樣量，吸取供試品溶液3μL、5μL，對照藥材10μL、15μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上雖顯相同顏色的斑點，但斑點仍不夠清晰，分離效果不理想；下一步在加大點樣量的同時將斑點點成條帶狀，吸取供試品10μL、對照藥材15μL分別以條帶狀點于同一硅膠G薄層板上，結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，分離效果較好，因此確定該方法為玉竹配方顆粒的薄層鑒別方法[10]。

（2）糖化酶用量考察：研究過程中發(fā)現(xiàn)，糖化酶的用量過多或過少均會影響檢測結(jié)果，過多時溶液濃度高顏色深，干擾吸收導(dǎo)致測定值偏高；用量不足時，不能將麥芽糊精水解完全，同樣會導(dǎo)致測定值偏高；通過一系列試驗，最終確定了酶（糖化酶）與底物（麥芽糊精）的比例為5∶1時，為最佳比例，結(jié)合玉竹配方顆粒的工藝中主藥與麥芽糊精比例為4∶1，故主藥取1 g時，對應(yīng)糖化酶的加入量為0.05 g。

（3）酶解溫度考察：研究中分別考察了產(chǎn)品在60℃及37℃條件下的酶解情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解溫度為60℃時，在預(yù)設(shè)的幾個時間段內(nèi)，含量波動較大不穩(wěn)定，且總體較高，說明麥芽糊精沒有完全酶解，考慮原因為60℃時，酶部分失活，導(dǎo)致麥芽糊精水解不完全，因此選定酶解溫度為37℃，在此基礎(chǔ)上進一步考察酶解時間。

（4）酶解時間考察：固定酶解溫度為37℃的條件下，取玉竹配方顆粒8份，每份約1 g，酶解時間分別設(shè)置0.5、1、2、4、6、8、12、24小時，進一步考察糖化酶的酶解能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶解時間為2小時時，吸光度趨于平穩(wěn)，表明此時樣品中麥芽糊精已水解完全。見圖2。

圖2　糖化酶對麥芽糊精水解能力測定結(jié)果

由于酶解反應(yīng)具有高度的專一性，糖化酶對α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵有水解能力，僅可水解玉竹配方顆粒中的麥芽糊精，無法水解玉竹中含有的玉竹黏多糖、玉竹果聚糖等成分，故此法可以有效排除麥芽糊精對活性成分玉竹多糖測定的干擾。

綜上所述，文中的定性及定量方法科學(xué)、準(zhǔn)確，具有良好的可控性及重復(fù)性，可用于玉竹配方顆粒的質(zhì)量控制。

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