趙延兵，張　瑋，趙巧云，秦　雯，蘇瑜恒，牛馨苗

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的原發(fā)性癌和最常見的實性腫瘤[1]。由于肝細胞癌的侵襲而造成的腫瘤細胞轉移顯著降低了相當一部分肝癌患者的治療效果[2]。最新的研究結果表明，大量的miRNA在HCC中被釋放，miRNA直接或間接地通過靶向轉移相關蛋白來調節(jié)腫瘤轉移。miR-181-5p已經(jīng)被證明在幾種癌癥中下調[3]。然而，對于miR-181-5p在人肝癌中的作用機制和潛在的分子機制知之甚少。本研究通過人肝癌標本的免疫組化染色、qRT-PCR和體外培養(yǎng)肝癌細胞并進行細胞轉染、免疫熒光染色、蛋白印跡實驗、平板克隆、Transwell和細胞活力檢測等，研究了miR-181-5p靶基因通過調控AKT3，進而影響肝癌細胞侵襲轉移、增殖，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1材料人肝癌細胞株SMMC-7721，購于天津百塞斯生物科技公司；人肝癌組織收集于焦作市人民醫(yī)院病理科；1640培養(yǎng)基購于Gbico公司；小牛血清購于美國Gbico公司；兔抗鼠AKT3、N-cadherin、E-cadherin抗體以及羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗購于美國CST公司；反轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購于全式金生物科技公司。免疫組化試劑盒購于天津麥蘭伯生物科技公司；免疫熒光二抗，購于美國abcam公司。Transwell小室和Matrigel基底膠購于美國BD公司；AKT3 siRNA、miR-181-5p mimic或inhibitor購于廣州銳博生物科技公司。

1.2miR-181-5p和AKT3含量檢測Trizol法提取總RNA， miRNA專用提取試劑盒提取肝組織miRNA，然后進行反轉錄反應。按照熒光定量PCR試劑盒說明書配置PCR體系，然后上機。PCR 結果計算方法是：目的基因定量=2-△△CT，而△CT =CT目的基因-CT內(nèi)參，△△CT=△CT實驗組-△CT對照組。

1.3AKT3、E-cadherin和N-cadherin表達人肝癌組織用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)經(jīng)過梯度酒精、二甲苯脫水制作組織蠟塊、切片。兩組分別經(jīng)過免疫組化染色，顯微鏡下觀察AKT3、E-cadherin和N-cadherin表達量。

1.4細胞轉染將SMMC-7721肝癌細胞接種至六孔板，培養(yǎng)至細胞密度50%～70%。NC組每孔加入10 μL miRNA-NC轉染細胞；mimic組每孔加入10 μL miRNA-mimic；inhibitor組每孔加入10 μL miRNA-inhibitor；inhibitor+siRNA AKT3組在轉染inhibitor的同時加入siRNA AKT3轉染細胞。將轉染后的肝癌細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5肝癌細胞增殖能力檢測待siRNA NC組、inhibitor+siRNA NC組和inhibitor+siRNA AKT3組細胞密度至80%～90%時，分別胰酶消化、重懸，細胞計數(shù)后調整細胞濃度，于六孔板中培養(yǎng)，每組做3個復孔。放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，0.5%結晶紫染色后肉眼直接計數(shù)每孔的克隆數(shù)[4]。

1.6肝癌細胞侵襲、轉移能力待siRNA NC組、inhibitor+siRNA NC組和inhibitor+siRNA AKT3組SMMC-7721細胞密度至80%～90%時，分別胰酶消化、1%培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)后調整細胞濃度至105·mL-1。在24孔板中加入10%培養(yǎng)基，每孔600 μL。將Transwell小室(加Matrigel膠小室用于觀察SMMC-7721細胞侵襲能力，不加Matrigel膠小室用于觀察腫瘤細胞轉移能力)放入24孔板中，每組吸取100 μL細胞懸液分別加入加膠和不加膠的小室中，每組做3個復孔。放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。棄去培養(yǎng)基，取出小室，用0.1%結晶紫染液室溫染色3 h[5]。在顯微鏡下觀察并計數(shù)。

2　結果

2.1miR-181-5p、AKT3表達量和相關性qRT-PCR結果顯示，與對照組((miR-181-5p (16.6±3.7)，AKT3 (10.6±3.9))相比較，miR-181-5p在人肝癌組織中呈低表達(8.7±3.6)，而AKT3高表達(17.3±3.5)，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，miR-181-5p與AKT3在肝癌組織中相關性較高(r2=0.636 5，P<0.05)；免疫組化結果顯示在miR-181-5p高表達的肝癌組織中AKT3、E-cadherin、N-cadherin陽性染色較miR-181-5p低表達的肝癌組織減弱，見圖1。

A、B：PCR測定miR-181-5p和AKT3在人肝癌組織與正常肝組織表達水平(①P<0.05)；C：miR-181-5p和AKT3在肝癌組織中的相關性；D：免疫組化顯示miR-181-5p高表達肝癌組織和miR-181-5p低表達的肝癌組織中AKT3、E-cadherin和N-cadherin表達分布情況。圖1　各組肝組織miR-181-5p、AKT3表達及miR-181-5p與AKT3相關性

2.2miR-181-5p靶向抑制AKT3Transwell結果顯示：與NC組細胞侵襲數(shù)目96.7±11.4相比較，抑制miR-181-5p活性，細胞侵襲數(shù)目為246.7±27.7，肝癌細胞的侵襲轉移能力增強；敲除AKT3后，細胞侵襲數(shù)目為128.9±10.8，肝癌細胞的侵襲轉移能力降低(P<0.05)；平板克隆結果顯示：NC組細胞數(shù)目為106.2±8.3，抑制miR-181-5p活性，細胞數(shù)目為391.2±12.3，肝癌細胞的增殖能力增強，而敲除AKT3后，細胞數(shù)目為124.5±10.1，肝癌細胞的增殖能力降低(P<0.05)。

A：Transwell顯示肝癌細胞侵襲轉移能力；B:計數(shù)各組細胞數(shù)(①與NC組比較，P<0.05)。C：平板克隆實驗結果顯示肝癌細胞增殖能力;D:計數(shù)各組細胞集落數(shù)(②與inhibitor+siRNA NC組比較，P<0.05)。圖2　miR-181-5p靶向抑制AKT3對肝癌細胞侵襲轉移和增殖能力的影響

3　討論

miR-181家族的成員miR-181-5p已被證明在多種腫瘤中低表達，包括乳腺癌[6]、結直腸癌[7]、肺癌、胃癌和口腔鱗狀細胞癌[8]，但其確切的分子機制仍然未知。作者采用qRT-PCR檢測人肝癌標本中miR-181-5p表達量，發(fā)現(xiàn)miR-181-5p在人肝癌組織中表達量明顯減少。同時，通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)在miR-181-5p高表達組肝癌組織中AKT3、E-cadherin和N-cadherin表達量較miR-181-5p低表達組的肝癌組織中低，說明在肝癌細胞模型中miR-181-5p高表達能顯著降低肝癌細胞的侵襲、轉移和增殖的能力，反之能增強肝癌細胞的侵襲、轉移和增殖的能力。

上述的研究中發(fā)現(xiàn)了miR-181-5p能抑制肝癌細胞的侵襲轉移，但是其作用機制仍然未知。作者通過TargetScan預測了miR-181-5p與自噬相關調節(jié)蛋白AKT3高度相關，于是設想，miR-181-5p是否通過AKT3調節(jié)肝癌細胞EMT，進一步影響肝癌細胞的侵襲轉移？有證據(jù)表明，miR-181家族成員通過EMT途徑發(fā)揮作用。EMT觸發(fā)上皮細胞表達間充質標記物，并下調上皮標志物表達[9]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種上皮分子標記物，其負責建立黏附連接處，在頂面下方形成連續(xù)的黏合帶[10-12]。由EMT引起的E-鈣黏蛋白的損失導致細胞間的接合脫落，并降低黏附力[13-15]。Transwell結果顯示：抑制miR-181-5p活性，肝癌細胞的侵襲轉移能力增強，敲除AKT3后肝癌細胞的侵襲轉移能力降低；平板克隆結果顯示：抑制miR-181-5p活性，肝癌細胞的增殖能力增強，敲除AKT3后肝癌細胞的增殖能力降低。

以上結果表明miR-181-5p靶基因通過靶向調控AKT3，進而影響肝癌細胞侵襲轉移、增殖和生存能力。因此，miR-181-5p靶向調控AKT3抑制自噬有望成為干預肝癌細胞侵襲轉移的新策略。

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