孫仲春，付　華，賈彭林，楊啟琨，瞿勇強(qiáng)，雷普平

不明原因猝死(sudden unexpected death,SUD)是指經(jīng)法醫(yī)病理解剖、組織學(xué)檢驗(yàn)及常規(guī)毒藥物檢驗(yàn)后仍不能明確死亡原因的猝死。不明原因猝死是當(dāng)前法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)有1%～5%的死亡通過法醫(yī)學(xué)系統(tǒng)尸體檢驗(yàn)不能得出明確死亡原因[1]。在云南地區(qū)還存在著一類特殊的不明原因猝死類型，該猝死主要發(fā)生在云南一些偏遠(yuǎn)山區(qū)、半山區(qū)，具有明顯的家族或家庭聚集性、空間聚集性和時(shí)間聚集性等特點(diǎn)，被學(xué)者稱為云南不明原因猝死(yunnan sudden unexplained death,YNSUD)[2]。YNSUD自1978年首次報(bào)道以來，先后有20多個(gè)縣的50多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)報(bào)告了400余例猝死病例[3]，因其死因不明，無有效的治療和預(yù)防措施，已成為嚴(yán)重的社會(huì)問題和法醫(yī)學(xué)鑒定難點(diǎn)[4]。有學(xué)者通過常規(guī)的HE染色觀察認(rèn)為，部分YNSUD就是暴發(fā)性心肌炎。然而，心肌炎性損傷較為輕微的YNSUD通過常規(guī)的HE染色觀察并不能明確認(rèn)定為心肌炎[5]。為探明云南地區(qū)不明原因猝死與心肌炎之間的關(guān)系，本研究對(duì)YNSUD心肌、散發(fā)性SUD心肌進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢驗(yàn)CD8+T細(xì)胞在心肌的表達(dá)情況，同時(shí)對(duì)YNSUD病例的心肌組織進(jìn)行掃描電鏡觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料本研究樣本均來自昆明醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心2013年至2015年，經(jīng)鑒定為不明原因猝死病例29例(其中包括5例為YNSUD、24例為散發(fā)性不明原因猝死)，所選案例均經(jīng)過常規(guī)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下檢查未達(dá)到診斷心肌炎標(biāo)準(zhǔn)，其他均未發(fā)現(xiàn)異常。正常心肌對(duì)照組9例。免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)所用抗體(mouse anti-CD8)、SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。2例死后20 h解剖提取的YNSUD病例心肌組織進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.2方法免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)：心肌樣品取材→包埋組織→切片→貼片→脫蠟→水化→抗原修復(fù)→血清封閉→加一抗→加二抗→顯色劑→復(fù)染→脫水→封片→顯微鏡觀察。掃描電鏡觀察：心肌樣品取材→固定→脫水→干燥→粘樣→鍍膜→掃描電鏡觀察。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)本研究按許良中的判斷標(biāo)準(zhǔn)：先將染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。再將陽性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分：陰性為0分，陽性細(xì)胞簇10%為1分，11～50%為2分，51～5%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積>3分為免疫反應(yīng)陽性[6]；通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行判斷定性，每個(gè)高倍視野≥5個(gè)炎性細(xì)胞或淋巴細(xì)胞為心肌炎，<5個(gè)為炎性細(xì)胞或淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[7]；掃描電鏡結(jié)果由兩位專家分別進(jìn)行觀察判斷。

2　結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)結(jié)果29例不明原因猝死病例中有2例散發(fā)性不明原因猝死心肌CD8+T細(xì)胞表達(dá)呈陽性，8例有淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)但無CD8+T細(xì)胞表達(dá)(其中YNSUD 1例，散發(fā)性不明原因猝死7例)但未達(dá)到心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；9例正常心肌對(duì)照組均為陰性，見表1、圖1。

表1　29例不明原因猝死心肌情況　例

A:YNSUD心肌組織;B:散發(fā)SUD心肌組織;C:散發(fā)SUD心肌組織;D:散發(fā)SUD心肌組織呈炎性改變。圖1　心肌組織中CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況(HE,×100)

2.2心肌電鏡掃描結(jié)果2例YNSUD者心肌超微電鏡觀察得到的心肌超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間質(zhì)中血管、心肌細(xì)胞的病理性改變，見圖2。

A:心肌間質(zhì)自溶性改變；B:心肌肌原纖維自溶性改變；C:心肌肌原纖維自溶橫切面；D:心肌肌原纖維自溶橫切面。圖2　心肌肌原纖維電鏡掃描圖

3　討論

心肌炎性損傷較為輕微的病變?nèi)绾蚊鞔_認(rèn)定為心肌炎是目前猝死心臟病病理研究的一個(gè)難點(diǎn)。有學(xué)者通過對(duì)云南地區(qū)不明原因猝死尸體解剖及病理組織學(xué)光學(xué)顯微鏡檢查表明，48%病例具有局灶性心肌炎改變[8,10,13]，但對(duì)其他無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的不明原因猝死是否存在心肌炎性損傷尚無研究報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞是免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞[8]，可介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，CD8+T細(xì)胞在病毒性心肌炎小鼠心肌組織浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞中所占的百分率與心肌組織病理積分及心肌細(xì)胞凋亡率均呈顯著正相關(guān)，與心肌細(xì)胞炎性損傷密切相關(guān)，可作為心肌炎性損傷的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)[9]。

本研究通過檢測(cè)CD8+T細(xì)胞在云南地區(qū)不明原因猝死者心肌組織中的表達(dá)，結(jié)果有2例散發(fā)性不明原因猝死心肌CD8+T細(xì)胞表達(dá)呈陽性，表明其存在心肌炎性損傷，雖不能診斷為心肌炎，但其心肌炎性損傷可能與其死亡原因相關(guān)。本研究中5例YNSUD均未發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞表達(dá)陽性，提示YNSUD與心肌炎無明確相關(guān)性。8例淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)表明心肌存在炎性反應(yīng)應(yīng)答，而淋巴細(xì)胞是特異性免疫功能的重要組成部分，淋巴細(xì)胞在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用[9]，本研究中8例不明原因猝死心肌存在不同程度的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，提示不明原因猝死可能存在輕微心肌炎性反應(yīng)。本研究掃描電鏡觀察，心肌組織主要呈自溶性改變，未發(fā)現(xiàn)其他病理性改變，其原因主要可能與檢查沒有在死者死亡后及時(shí)提取和送檢有關(guān)。掃描電鏡觀察需要機(jī)體死亡后立即取材與送檢，結(jié)合本研究結(jié)果及法醫(yī)病理尸體檢驗(yàn)時(shí)通常都要死后數(shù)小時(shí)才能進(jìn)行，故掃描電鏡觀察結(jié)果可能受自溶性改變影響較大。

YNSUD發(fā)病迅猛、病情變化快、突然死亡、病死率高，多數(shù)學(xué)者認(rèn)其應(yīng)為心源性猝死[10]。本研究中云南地區(qū)不明原因猝死者心肌CD8+T細(xì)胞的表達(dá)，僅在散發(fā)性不明原因猝死者心肌組織中存在CD8+T細(xì)胞，提示CD8+T細(xì)胞可能與心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展存在聯(lián)系，可能與猝死的機(jī)制有關(guān)[11]。但是，這尚不能解釋云南地區(qū)不明原因猝死的發(fā)生機(jī)制，尤其是YNSUD的發(fā)生還可能與心臟離子基因變異、局灶性心肌炎、不明原因毒物(小白菌)中毒等多種原因相關(guān)[12-19]，有待進(jìn)一步深入研究。

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