孫仲春,付 華,賈彭林,楊啟琨,瞿勇強(qiáng),雷普平
不明原因猝死(sudden unexpected death,SUD)是指經(jīng)法醫(yī)病理解剖、組織學(xué)檢驗(yàn)及常規(guī)毒藥物檢驗(yàn)后仍不能明確死亡原因的猝死。不明原因猝死是當(dāng)前法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)有1%~5%的死亡通過法醫(yī)學(xué)系統(tǒng)尸體檢驗(yàn)不能得出明確死亡原因[1]。在云南地區(qū)還存在著一類特殊的不明原因猝死類型,該猝死主要發(fā)生在云南一些偏遠(yuǎn)山區(qū)、半山區(qū),具有明顯的家族或家庭聚集性、空間聚集性和時(shí)間聚集性等特點(diǎn),被學(xué)者稱為云南不明原因猝死(yunnan sudden unexplained death,YNSUD)[2]。YNSUD自1978年首次報(bào)道以來,先后有20多個(gè)縣的50多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)報(bào)告了400余例猝死病例[3],因其死因不明,無有效的治療和預(yù)防措施,已成為嚴(yán)重的社會(huì)問題和法醫(yī)學(xué)鑒定難點(diǎn)[4]。有學(xué)者通過常規(guī)的HE染色觀察認(rèn)為,部分YNSUD就是暴發(fā)性心肌炎。然而,心肌炎性損傷較為輕微的YNSUD通過常規(guī)的HE染色觀察并不能明確認(rèn)定為心肌炎[5]。為探明云南地區(qū)不明原因猝死與心肌炎之間的關(guān)系,本研究對(duì)YNSUD心肌、散發(fā)性SUD心肌進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢驗(yàn)CD8+T細(xì)胞在心肌的表達(dá)情況,同時(shí)對(duì)YNSUD病例的心肌組織進(jìn)行掃描電鏡觀察,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1材料本研究樣本均來自昆明醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心2013年至2015年,經(jīng)鑒定為不明原因猝死病例29例(其中包括5例為YNSUD、24例為散發(fā)性不明原因猝死),所選案例均經(jīng)過常規(guī)HE染色后,光學(xué)顯微鏡下檢查未達(dá)到診斷心肌炎標(biāo)準(zhǔn),其他均未發(fā)現(xiàn)異常。正常心肌對(duì)照組9例。免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)所用抗體(mouse anti-CD8)、SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。2例死后20 h解剖提取的YNSUD病例心肌組織進(jìn)行掃描電鏡觀察。
1.2方法免疫組織化學(xué)檢驗(yàn):心肌樣品取材→包埋組織→切片→貼片→脫蠟→水化→抗原修復(fù)→血清封閉→加一抗→加二抗→顯色劑→復(fù)染→脫水→封片→顯微鏡觀察。掃描電鏡觀察:心肌樣品取材→固定→脫水→干燥→粘樣→鍍膜→掃描電鏡觀察。
1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)本研究按許良中的判斷標(biāo)準(zhǔn):先將染色強(qiáng)度評(píng)分:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。再將陽性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分:陰性為0分,陽性細(xì)胞簇10%為1分,11~50%為2分,51~5%為3分,>75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積>3分為免疫反應(yīng)陽性[6];通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行判斷定性,每個(gè)高倍視野≥5個(gè)炎性細(xì)胞或淋巴細(xì)胞為心肌炎,<5個(gè)為炎性細(xì)胞或淋巴細(xì)胞浸潤[7];掃描電鏡結(jié)果由兩位專家分別進(jìn)行觀察判斷。
2.1免疫組織化學(xué)結(jié)果29例不明原因猝死病例中有2例散發(fā)性不明原因猝死心肌CD8+T細(xì)胞表達(dá)呈陽性,8例有淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤但無CD8+T細(xì)胞表達(dá)(其中YNSUD 1例,散發(fā)性不明原因猝死7例)但未達(dá)到心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn);9例正常心肌對(duì)照組均為陰性,見表1、圖1。
表1 29例不明原因猝死心肌情況 例
A:YNSUD心肌組織;B:散發(fā)SUD心肌組織;C:散發(fā)SUD心肌組織;D:散發(fā)SUD心肌組織呈炎性改變。圖1 心肌組織中CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況(HE,×100)
2.2心肌電鏡掃描結(jié)果2例YNSUD者心肌超微電鏡觀察得到的心肌超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間質(zhì)中血管、心肌細(xì)胞的病理性改變,見圖2。
A:心肌間質(zhì)自溶性改變;B:心肌肌原纖維自溶性改變;C:心肌肌原纖維自溶橫切面;D:心肌肌原纖維自溶橫切面。圖2 心肌肌原纖維電鏡掃描圖
心肌炎性損傷較為輕微的病變?nèi)绾蚊鞔_認(rèn)定為心肌炎是目前猝死心臟病病理研究的一個(gè)難點(diǎn)。有學(xué)者通過對(duì)云南地區(qū)不明原因猝死尸體解剖及病理組織學(xué)光學(xué)顯微鏡檢查表明,48%病例具有局灶性心肌炎改變[8,10,13],但對(duì)其他無明顯炎性細(xì)胞浸潤的不明原因猝死是否存在心肌炎性損傷尚無研究報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞是免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞[8],可介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用,CD8+T細(xì)胞在病毒性心肌炎小鼠心肌組織浸潤的炎性細(xì)胞中所占的百分率與心肌組織病理積分及心肌細(xì)胞凋亡率均呈顯著正相關(guān),與心肌細(xì)胞炎性損傷密切相關(guān),可作為心肌炎性損傷的一個(gè)重要檢測指標(biāo)[9]。
本研究通過檢測CD8+T細(xì)胞在云南地區(qū)不明原因猝死者心肌組織中的表達(dá),結(jié)果有2例散發(fā)性不明原因猝死心肌CD8+T細(xì)胞表達(dá)呈陽性,表明其存在心肌炎性損傷,雖不能診斷為心肌炎,但其心肌炎性損傷可能與其死亡原因相關(guān)。本研究中5例YNSUD均未發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞表達(dá)陽性,提示YNSUD與心肌炎無明確相關(guān)性。8例淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤表明心肌存在炎性反應(yīng)應(yīng)答,而淋巴細(xì)胞是特異性免疫功能的重要組成部分,淋巴細(xì)胞在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用[9],本研究中8例不明原因猝死心肌存在不同程度的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤,提示不明原因猝死可能存在輕微心肌炎性反應(yīng)。本研究掃描電鏡觀察,心肌組織主要呈自溶性改變,未發(fā)現(xiàn)其他病理性改變,其原因主要可能與檢查沒有在死者死亡后及時(shí)提取和送檢有關(guān)。掃描電鏡觀察需要機(jī)體死亡后立即取材與送檢,結(jié)合本研究結(jié)果及法醫(yī)病理尸體檢驗(yàn)時(shí)通常都要死后數(shù)小時(shí)才能進(jìn)行,故掃描電鏡觀察結(jié)果可能受自溶性改變影響較大。
YNSUD發(fā)病迅猛、病情變化快、突然死亡、病死率高,多數(shù)學(xué)者認(rèn)其應(yīng)為心源性猝死[10]。本研究中云南地區(qū)不明原因猝死者心肌CD8+T細(xì)胞的表達(dá),僅在散發(fā)性不明原因猝死者心肌組織中存在CD8+T細(xì)胞,提示CD8+T細(xì)胞可能與心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展存在聯(lián)系,可能與猝死的機(jī)制有關(guān)[11]。但是,這尚不能解釋云南地區(qū)不明原因猝死的發(fā)生機(jī)制,尤其是YNSUD的發(fā)生還可能與心臟離子基因變異、局灶性心肌炎、不明原因毒物(小白菌)中毒等多種原因相關(guān)[12-19],有待進(jìn)一步深入研究。
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