常鑫　梁宇彬　車思璇　黃敏　曾思琳　陳思言　郭毅

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種隱匿性起病的神經(jīng)變性疾病，患者主要表現(xiàn)以近期記憶力下降，伴有行為障礙和認(rèn)知障礙，后期還可以表現(xiàn)為精神行為異常[1]。AD以神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs )由過(guò)度磷酸化的不可溶性Tau蛋白形成以及神經(jīng)炎性淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑(senile plaque，SP )為主要兩大病因?qū)W說(shuō)，其中還有神經(jīng)凋亡學(xué)說(shuō)、神經(jīng)突觸丟失、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等[2]。突觸后致密蛋白95[3](postsynaptic denisty protein 95，PSD95)是神經(jīng)元的突觸核心蛋白，記憶的保存與形成有賴于突觸蛋白結(jié)構(gòu)完整性和可塑性。目前治療仍未發(fā)現(xiàn)治療AD的有效藥物，因此研發(fā)治療AD的有效藥物是亟待解決的問(wèn)題。小檗堿[4](Berberine，BBR)是黃連素一類的生物類堿，BBR具有多種的藥理作用效果，包括明顯的抗炎作用、抗病毒、抑菌及降糖、降脂等作用。一些研究表明BBR能改善AD的癥狀并減輕其病理學(xué)表現(xiàn)[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用新型的三轉(zhuǎn)基因(3×Tg)小鼠作為AD的動(dòng)物模型，選擇8月齡的3×Tg-AD小鼠以進(jìn)一步探討B(tài)BR對(duì)海馬PSD95表達(dá)水平的影響及與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)自噬水平、磷酸化蛋白激酶B(phos-phorylated protein kinase B,p-Akt)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白[phosphorylated manmmalian target of sirolimus(Rapamycin)，p-mTOR]信號(hào)通路的關(guān)系，探索小檗堿改善AD的臨床癥狀并分析其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象30只雄性的三轉(zhuǎn)基因AD小鼠購(gòu)自美國(guó)Jax動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，它能穩(wěn)定性表達(dá)人源突變基因APPswe、TauP30IL以及鼠源突變基因的PS1M146V，體重(30.32±2.50)g，在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。該8月齡的三轉(zhuǎn)基因AD小鼠具有認(rèn)知功能下降、老年斑沉積、神經(jīng)突觸丟失等特征。

1.2實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑、材料小檗堿購(gòu)自武漢福鑫化工有限公司；即用型免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自深圳賽百科生物技術(shù)有限公司；蔗糖、多聚甲醛、戊二醛、鹽酸、磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、水合氯醛、甲醇、乙醇、鹽酸、PBS等均購(gòu)自深圳生物化學(xué)試劑公司；一抗：PSD95、GAPDH購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)以及Akt、mTOR、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)購(gòu)自CST公司。二抗：兔抗鼠DL488熒光二抗購(gòu)自南京森貝伽生物有限公司，鼠二抗、鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3方法

1.3.1分組及給藥處理將30只雄性8月齡的三轉(zhuǎn)基因AD小鼠隨機(jī)分為3組，即AD對(duì)照組、AD+20 mgBBR組和AD+50 mgBBR組，每組各10只，給藥劑量方式分別為小檗堿25 mg·kg-1·d-1、小檗堿50 mg·kg-1·d-1，AD對(duì)照組給予等容量生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)3個(gè)月。

1.3.2行為學(xué)檢測(cè)小檗堿灌胃3月后對(duì)各組AD小鼠進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行及空間探索兩部分。其中定位航行經(jīng)歷5 d，空間探索為2 d。定位航行第1 d為試練期：把小鼠置于平臺(tái)停留10 s，隨后把小鼠從4個(gè)不同象限的對(duì)應(yīng)位置面壁放入池內(nèi)，小鼠登上平臺(tái)且停留2 s后終止記錄，最長(zhǎng)記錄時(shí)間為60 s，若AD小鼠在60 s內(nèi)仍不能上臺(tái)，將其引致平臺(tái)停留10 s，以便適應(yīng)平臺(tái)；上述行為學(xué)檢測(cè)循環(huán)4個(gè)象限，訓(xùn)練定位航行；定位航行第2～5 d為檢測(cè)期。空間探索實(shí)驗(yàn)：在第7 d將平臺(tái)撤走并把各組的三轉(zhuǎn)基因AD小鼠從一處放入水中，同時(shí)觀察60 s內(nèi)小鼠通過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間百分比[6]。通過(guò)水迷宮跟蹤系統(tǒng)得出數(shù)據(jù)，利用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理作圖分析。

1.3.3免疫熒光實(shí)驗(yàn)測(cè)試PSD95陽(yáng)性表達(dá)水平將培養(yǎng)7 d后的各組原代細(xì)胞培養(yǎng)基移去，將PBS洗滌3次后將40 g/L多聚甲醛放置培養(yǎng)皿上固定1 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、43 ℃水浴展片、撈片、37 ℃烘箱烤片，脫蠟，采用SABC方法進(jìn)行免疫組化染色。將PSD95(1∶400比例)抗體稀釋作為一抗， 二抗室溫孵育1 h，熒光抗淬滅封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，以鏡下觀察PSD95陽(yáng)性表達(dá)水平。

1.3.4Western blotting檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平小檗堿藥物處理3個(gè)月后各組取4只小鼠斷頭取腦，在無(wú)菌條件下在顯微鏡下剝離血管膜和取出完整的海馬組織放入無(wú)菌EP管中，按照質(zhì)量比例加入蛋白提取試劑盒。超聲破碎組織、離心，取上清即為可溶性蛋白(TBS-soluble),分裝凍存至-80 ℃冰箱；采用BCA法對(duì)樣品進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；80 mV電泳120 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，加PSD95(1∶3000)、LC3-Ⅱ(1∶3000)、p-Akt(1∶5000)、p-mTOR(1∶5000)，4 ℃過(guò)夜；TBST 漂洗次3 次；加入1:5000兔二抗、鼠二抗室溫孵育2 h；TBST 漂洗3 次，10 min/次；ECL發(fā)光液顯影。利用Quantity One凝膠定量軟件進(jìn)行吸光度值分析，利用Prism5軟件作圖片分析。

2　結(jié)　果

2.1檢測(cè)行為學(xué)的實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮試驗(yàn)顯示AD+25 mgBBR和AD+50 mgBBR組的逃避潛伏期較AD對(duì)照組均減少(P<0.05，P<0.01)，而50 mgBBR組的每天逃避潛伏期較AD+25 mgBBR組較減少(P<0.05)；同時(shí)各組小鼠的游泳速度沒(méi)有明顯差異(P>0.05)?？臻g探索：AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的所在象限停留時(shí)間及跨越原平臺(tái)的次數(shù)較AD對(duì)照組均增加(P<0.05,P<0.01)，且AD+50 mgBBR組更為明顯(圖1)。

2.2免疫熒光檢測(cè)PSD95陽(yáng)性表達(dá)水平AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的三轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中CA1區(qū)的免疫陽(yáng)性反應(yīng)呈綠色熒光散點(diǎn)，AD+25mgBBR組呈細(xì)小點(diǎn)狀連接成片，個(gè)別細(xì)胞有散在綠色熒光包圍，AD+50 mgBBR組的綠色熒光顆粒染色較多、較深，多個(gè)細(xì)胞有綠色熒光包圍；AD對(duì)照組三轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中CA1區(qū)的免疫陽(yáng)性反應(yīng)呈淺綠色，散在細(xì)點(diǎn)、稀疏(圖2)。

圖1　A為各組小鼠逃避潛伏期、游泳速度；B為各組小鼠通過(guò)平臺(tái)的次數(shù)、原平臺(tái)所停留的時(shí)間百分比(%)；與AD對(duì)照組?P<0．05，??P<0．01，#P<0．05(n=10)

圖2　PSD95在各組小鼠海馬組織CA1區(qū)的表達(dá)情況(DAB×400倍與AD對(duì)照組比較，??P<0．01，n=4)

2.3Western blotting實(shí)驗(yàn)與AD對(duì)照組比較,AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的PSD95突觸蛋白水平均升高(P<0.01)(圖3)；AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的自噬水平LC3-Ⅱ較AD對(duì)照組升高(P<0.05)(圖3)；AD+25 mgBBR組和AD+50 mgBBR組的p-Akt、p-mTOR的表達(dá)水平較AD對(duì)照組均明顯升高(P<0.05)(圖3)。

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)選取可過(guò)表達(dá)人源突變基因APP/Tau/PS1的三轉(zhuǎn)基因AD小鼠可較好地作為AD病理模型。該三轉(zhuǎn)基因AD小鼠[7]從4月齡漸開(kāi)始出現(xiàn)AD的初期病理表現(xiàn)如老年斑Aβ的沉積、tau蛋白過(guò)度磷酸化、神經(jīng)異常凋亡、神經(jīng)突觸丟失及突觸結(jié)構(gòu)的破壞，該8月齡AD小鼠逐漸表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶受損、易激怒等行為學(xué)上的改變。小檗堿[8]是一種天然的生物堿，有抗炎、抗凋亡、降脂等多種藥理作用。最近研究表明小檗堿能改善AD的病理如減少老年斑Aβ沉積、減少tua蛋白過(guò)度磷酸化等，目前作為神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防用藥備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)予小檗堿兩種不同的劑量，分別是25 mg、50 mg干預(yù)該8月齡的三轉(zhuǎn)基因AD小鼠，Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)提示小檗堿組的逃避潛伏期及停留原平臺(tái)所占的時(shí)間較AD對(duì)照組均縮短，提示小檗堿能改善三轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間探索能力。

突觸后致密蛋白(PSD)[9]是特定的突觸連接細(xì)胞骨架，是突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的重要組成部分；PSD95是PSD基本結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為95kDa，能在N-甲基D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)和突觸膜表面蛋白之間起誘導(dǎo)作用，對(duì)神經(jīng)突觸傳來(lái)的興奮性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能快速進(jìn)行整合[10]。PSD95能增強(qiáng)突觸可塑性、突觸的完整性，且在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中起關(guān)鍵作用。對(duì)抑制PSD95表達(dá)的小鼠會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力障礙、突觸數(shù)量丟失及完整性缺失[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三轉(zhuǎn)基因AD小鼠給予小檗堿干預(yù)后其腦部的海馬組織中PSD95蛋白表達(dá)水平增高，同時(shí)能增強(qiáng)其學(xué)習(xí)記憶、空間探索能力。

LC3-Ⅱ是自噬過(guò)程中產(chǎn)生的自噬膜結(jié)構(gòu)，是反映自噬水平主要標(biāo)志物[12]，自噬主要是清除異常蛋白物質(zhì)(如Aβ)、過(guò)度磷酸化纖維纏結(jié)及受損細(xì)胞器的過(guò)程，在AD病程中發(fā)現(xiàn)自噬水平卻呈下降趨勢(shì)，而病理的Aβ沉積毒性、神經(jīng)纖維纏結(jié)的沉積加重了AD病理進(jìn)程；本實(shí)驗(yàn)提示小檗堿干預(yù)后的三轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦部海馬的LC3-Ⅱ水平呈升高趨勢(shì)，提示小檗堿能升高其自噬水平，提高清除、吞噬Aβ、受損細(xì)胞器等異常物質(zhì)的能力。有研究還表明通過(guò)自噬水平[13]誘導(dǎo)激活雷帕霉素和Akt/mTOR信號(hào)能抵抗淀粉樣蛋白-β沉積及抗氧化應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)突觸(PSD95)可塑性、增加其神經(jīng)傳遞功能。mTOR是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄、翻譯生長(zhǎng)因子、胰島素整合及腦源性營(yíng)養(yǎng)因子的蛋白合成[14]，Akt[15]信號(hào)是其上游因子，促進(jìn)mTOR信號(hào)激活，增加PSD95等蛋白表達(dá)。mTOR[16]還具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)因子的作用，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)因子的起始通路是Akt/mTOR，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小檗堿干預(yù)AD小鼠后使Akt/mTOR信號(hào)通路表達(dá)增加，提示小檗堿具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)因子的作用，同時(shí)上調(diào)mTOR表達(dá)水平能增加PSD95的表達(dá)[17]，同時(shí)能保護(hù)神經(jīng)突觸的完整性、提高其可塑性。

圖3　各組小鼠WB檢測(cè)　1為AD對(duì)照組；2為AD+25mgBBR組；3為AD+50mgBBR組(n=4)；A為各組小鼠的PSD95表達(dá)水平；B為各組小鼠的自噬LC3?Ⅱ水平；C為各組小鼠的p?Akt、p?mTOR蛋白表達(dá)水平；與AD對(duì)照組比較，?P<0．05，??P<0．01

綜上所述，應(yīng)用50 mg劑量的小檗堿能有效改善三轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間探索能力，增加突觸后致密蛋白PSD95表達(dá)，其可能機(jī)制是小檗

堿通過(guò)增加自噬水平來(lái)上調(diào)Akt/mTOR信號(hào)通路保護(hù)神經(jīng)元突觸的可塑性、結(jié)構(gòu)的完整性，但調(diào)控突觸蛋白表達(dá)的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

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