陳明霞，鄭計瑞，李和陽

(1.華僑大學化工學院，福建廈門 361021；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005)

弧菌作為近海、河口環(huán)境中微生物區(qū)系的主要成員，廣泛分布于自然水域及漁業(yè)生物中，是引發(fā)人類細菌性疾病的主要病原之一。人們通過飲用不潔水，食用未加工或未加工熟的帶有致病弧菌的食物，特別是海產(chǎn)品而感染發(fā)病[1-4]。近年來，海水養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，加快了海水生境的破壞，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，使養(yǎng)殖動物病害不斷發(fā)生?；【?Vibriosis) 主要是由弧菌屬(Vibrio)細菌引起的一類細菌性疾病，也是海水養(yǎng)殖動物主要的細菌病害之一。已知海水養(yǎng)殖動物弧菌病病原菌超過20種，危害到魚類、貝類及甲殼類中各種養(yǎng)殖動物，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[5]，而且導致野生海水動物大量死亡，進而導致食用人員腸道疾病或食物中毒?；【∠嚓P病原的研究已經(jīng)成為養(yǎng)殖病害及養(yǎng)殖環(huán)境治理的主要研究領域之一。

福建省漳州龍海市東北部的紫泥鎮(zhèn)，地處福建省第二大河九龍江出?？冢瑢儆谙痰粎R處，水質(zhì)較好，水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)達。紫泥圍墾區(qū)是其中重要的海水養(yǎng)殖區(qū)域，同樣存在著養(yǎng)殖環(huán)境惡化及水產(chǎn)致病菌嚴重等問題。筆者采用傳統(tǒng)的TCBS培養(yǎng)基分離篩選菌株及分子鑒定方法，對該養(yǎng)殖區(qū)域的弧菌類群進行分析，探討該養(yǎng)殖區(qū)潛在的弧菌病病原菌種類及其可能的風險。

1 材料與方法

1.1樣品采集海水樣品采集點位于福建漳州龍海紫泥圍墾區(qū)養(yǎng)殖區(qū)域的01站位(117.908 916°E，24.448 861°N)，03站位(117.906 578°E，24.449 108°N)和06站位(117.907 878°E，24.446 680°N)，樣品采集時間為2011年2月。

1.2培養(yǎng)基2216E和TCBS培養(yǎng)基(Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose)參考文獻[6]中描述。

1.3弧菌的分離培養(yǎng)將01、03、06這3個站位的海水樣品進行梯度稀釋，得到100、10-1、10-2共3個樣品梯度，每個梯度分別取200 μL于TCBS瓊脂平板上，涂布均勻，于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每個梯度做2個重復。隨機挑取分離良好的48個菌落接種于2216E 瓊脂平板上，盡可能保證挑取到所有的菌落類型。對所分離的菌株在2216E 平板上進行3次以上純化，以保證得到純培養(yǎng)物。

1.4弧菌的鑒定對所分離得到的TCBS菌株進行16S rRNA基因-RFLP酶切譜型分析，挑選各RFLP譜型代表菌，通過16S rRNA基因序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析進行菌種分子鑒定，16S rRNA 基因的PCR擴增及酶切分析方法參考文獻[7-8]中描述。菌株16S rRNA基因序列由南京金斯特生物技術有限公司測定，所得序列校正后在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對分析并獲取相近菌種的16S rRNA基因序列。利用DNAman(version 5.1，Lynnon BioSoft)軟件進行序列同源性分析及構建16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1弧菌16SrRNA基因-RFLP分析不同樣品在TCBS培養(yǎng)基上生長的菌落皆屬于典型的黃色或綠色，隨機挑取48個菌落(盡可能包括所有不同菌落類型)，純化后，使用細菌通用引物27F和1492R對所分離的48個菌株進行16S rRNA基因-PCR擴增(圖1)，用AfaI和MspI限制性內(nèi)切酶對48個菌株16S rRNA基因擴增片段進行雙酶切并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(RFLP分析)。結果表明，48個菌株可分為6種不同的RFLP分子譜型(Ⅰ～Ⅵ)，每種RFLP譜型挑出1個代表菌株進行16S rRNA基因的序列及系統(tǒng)發(fā)育學分析。

注：M.DL 2000;1～15.紫泥圍墾區(qū)06站位菌株編號Note:M.DL2000;1～15.Strains numbers of station 06 of Zini marine aquaculture area圖1 部分弧菌菌株16S rRNA基因PCR擴增結果Fig.1 16S rRNA gene PCR amplification results of some Vibrio strains

2.2弧菌16SrRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育學分析對6個代表菌株進行16S rRNA基因的序列比對鑒定(表1)及系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)，6個菌株屬于4種弧菌。Ⅰ型代表菌株JR-5和Ⅱ型代表菌株JR-12屬于同一個物種(group 1)，與V.crassostreaeLGP7T(大黃魚弧菌)、V.celticusRd 8.15T(凱爾特人弧菌)、V.gigantisCAIM 25T(牡蠣弧菌)的16S rRNA基因序列相似度皆為100.00%，無法區(qū)分，但從系統(tǒng)發(fā)育樹上明顯可見菌株JR-5、JR-12與V.crassostreaeLGP7T距離更為接近，處在一個小分支上；Ⅲ型代表菌株JR-10和Ⅳ型代表菌株JR-19屬于同一個物種(group 2)，與V.atlanticusVb 11.11T(大西洋弧菌)、V.tasmaniensisLMG 21574T(塔斯馬尼亞弧菌)皆有99%以上的同源性，但系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示菌株JR-10、JR-19與V.atlanticusVb 11.11T具有更近的親緣關系；Ⅴ型代表菌株JR-15與V.splendidusATCC 33125T(燦爛弧菌)有99.85%的同源性，為group 3；VI型代表菌株JR-20與V.lentus4OM4T(緩慢弧菌) 有98.60%的同源性，為group 4。不同弧菌類群所占比例不同，group 2 占有58.3%，具有絕對的優(yōu)勢，其他3類比例相當：group 1和4各占14.6%、group 3占12.5%。

3 討論

紫泥圍墾區(qū)屬于海水養(yǎng)殖區(qū)域，鹽度相對較高，以TCBS培養(yǎng)基分離獲取的菌株100%為弧菌，不包含有其他非弧菌TCBS類群，該結果與陳明霞等[6]、李和陽等[9]研究結果相符，TCBS培養(yǎng)類群中弧菌所占的比例與鹽度息息相關。

表1 不同RFLP譜型代表菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)關系分析結果

注：結點處數(shù)字表示Bootstrap 1 000 次重復檢驗的自舉值(僅顯示高于50%的數(shù)值；括號中為每個16S rRNA基因序列的登錄號；比例尺代表每100 bp 5個堿基替換數(shù)Note:The bootstrap values above 50% from 1 000 replicates are shown.The accession number of each 16S rRNA gene sequence is given in parenthesis.The scale bar represents 5 substitutions per 100 bp圖2 根據(jù)16S rRNA基因序列構建的紫泥圍墾區(qū)海水弧菌代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of representative Vibrio strains from Zini marine aquaculture area based on bacterial 16S rRNA gene

根據(jù)Drancourt 等[10-11]提出16S rRNA基因序列同源性鑒定規(guī)則及相關的系統(tǒng)進化樹分析，紫泥圍墾區(qū)主要的弧菌類群有4類，分別為group 1-V.crassostreae；group 2-V.atlanticus；group 3-V.splendidus和group 4-V.lentus。其中V.crassostreae和V.atlanticus至少含有2種類型的16S rRNA基因拷貝，因此具有2個的RFLP譜型。這4類弧菌都屬于專性需鹽細菌，是海水或咸水養(yǎng)殖水體的重要弧菌成員。

弧菌屬包含100多個不同物種，分屬于14個進化分支[12]，紫泥圍墾區(qū)的4種弧菌類群皆屬于V.splendidus進化分支[13-15]。V.splendidus可引起魚類、對蝦和牡蠣的疾病[5]；V.crassostreae于2004年分離自生病的長牡蠣(Crassostreagigas)血淋巴[13]，是長牡蠣的條件致病菌[16]；V.atlanticus最早分離自海灣扇貝(Ruditapesphilippinarum)[15]，目前并無實例證明該菌屬于致病菌[12]，但其近似種V.tasmaniensis卻被報道可以引起柳珊瑚疾病[17]；V.lentus可引起野生章魚(Octopusvulgaris)疾病[18]，其對養(yǎng)殖生物同樣具有嚴重威脅。

據(jù)調(diào)查，許多養(yǎng)殖戶會自購現(xiàn)成的TCBS培養(yǎng)基平板進行弧菌的分離培養(yǎng)，并通過觀察菌落的顏色和數(shù)量以判斷可能潛在的副溶血弧菌(V.parahemolyticus)病害危機，這顯然并不科學而且經(jīng)常會背道而馳。該研究明確了特定時間段內(nèi)紫泥圍墾區(qū)弧菌的類群組成，即該區(qū)域的弧菌主要為V.splendidus相關種類，對于針對性地防控這些弧菌引起的養(yǎng)殖動物疾病具有一定的指導價值。

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