巢時(shí)斌 吳成亮 張杰 蘇占營(yíng) 辜敏

[摘要] 目的 研究卵子激活能否改善凍融睪丸精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）時(shí)的受精率和胚胎發(fā)育。 方法 選擇2015年1月～2017年6月我院收治的42例行凍融睪丸精子ICSI助孕治療的患者作為研究對(duì)象，按照患者ICSI后是否進(jìn)行人工卵子激活（AOA）隨機(jī)分為（普通凍融睪丸精子）對(duì)照組（n=23）和卵子激活組（n=19），對(duì)兩組受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，可利用胚胎數(shù)和臨床妊娠率進(jìn)行比較。 結(jié)果 與對(duì)照組相比，卵子激活組有更高的受精率（53.21% vs 71.65%，P<0.05），更多的平均優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（1.96 vs 4.13，P<0.05），更多的平均可利用胚胎（2.58 vs 5.58，P<0.05），更高的臨床妊娠率但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（56.25% vs 66.67%，P>0.05）。 結(jié)論 卵子激活提高凍融睪丸精子行ICSI效率。

[關(guān)鍵詞] 卵子激活；卵胞漿內(nèi)單精子注射；體外受精與胚胎移植；受精機(jī)制；凍融睪丸精子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R714；R698 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）06-0028-03

[Abstract] Objective To investigate whether the activation of ovums can improve the fertilization rate and embryo development in intracytoplasmic sperm injection（ICSI） of frozen-thawed testis sperm. Methods Forty-two patients undergoing ICSI assisted pregnancy with frozen-thawed testis in Jiujiang Maternal and Child Health Care Hospital from January 2015 to June 2017 were enrolled in this study. Patients were randomly divided into（normal frozen-thawed testis sperm） control group（n=23） and oocyte activation ovum-activated group（n=19） according to whether artificial ovum activation（AOA） was carried out， the number of fertile embryos and the number of high-quality embryos， the number of available embryos and the clinical pregnancy rate of the two groups were compared. Results Compared with the control group， the ovum-activated group had higher fertilization rate（53.21% vs 71.65%， P<0.05）， more average high-quality embryos（1.96 vs 4.13， P<0.05）， more average available embryos（2.58 vs 5.58， P<0.05）. The higher clinical pregnancy rate was not statistically significant（56.25% vs 66.67%， P>0.05）. Conclusion Ovum activation enhances the ICSI efficiency of frozen-thawed testicular sperm.

[Key words] Ovum activation；Intracytoplasmic sperm injection；In vitro fertilization and embryo transplantation；Mechanism of fertilization；Freeze-thaw testicular sperm

卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperminjection，ICSI）技術(shù)的應(yīng)用是輔助生殖技術(shù)的又一個(gè)里程碑[1]。ICSI是把單個(gè)精子通過(guò)顯微操作注射到卵子內(nèi)完成受精，是目前治療男性嚴(yán)重少弱精子癥的最有效的輔助生殖技術(shù)，對(duì)無(wú)精子癥患者采用顯微外科睪丸精子抽取術(shù)（testicularspiration，TESA）獲得的極少量的精子也可以取得滿意的臨床結(jié)局，已經(jīng)成為試管嬰兒的常規(guī)技術(shù)之一。睪丸精子抽取術(shù)是有創(chuàng)手術(shù)，給無(wú)精子癥患者生理和心理創(chuàng)傷，且睪丸精子的有無(wú)和活力的好壞和穿刺部位有相關(guān)性。因此，進(jìn)行診斷性睪丸抽取術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)有活動(dòng)精子時(shí)會(huì)及時(shí)把精子冷凍。冷凍睪丸精子復(fù)蘇后用于ICSI，可以減少反復(fù)穿刺帶來(lái)的并發(fā)癥，但由于睪丸精子本身活動(dòng)力低，凍融后進(jìn)一步降低睪丸精子的活動(dòng)力，因此受精率、胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局均不如新鮮睪丸精子[2]。雖然有部分研究如何從不活動(dòng)的精子中篩選活精子的方法，但效果不一[3]。卵子激活技術(shù)能有效提高精子激活卵子不足導(dǎo)致的受精障礙[4，5]。本研究比較了卵子激活技術(shù)對(duì)凍融睪丸精子的受精和胚胎發(fā)育，臨床結(jié)局的影響，旨在為臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年9月～2017年9月因男方無(wú)精癥在九江市婦幼保健院輔助生殖科接受使用凍融睪丸精子行ICSI不孕癥患者為研究對(duì)象。其中，應(yīng)用卵子激活技術(shù)的凍融睪丸精子19個(gè)周期（卵子激活組），未應(yīng)用卵子激活技術(shù)的凍融睪丸精子23個(gè)周期（對(duì)照組）。

1.2 方法

1.2.1 睪丸精子的獲得和冷凍與復(fù)蘇 診斷性睪丸活檢，患者于局麻下行TESE術(shù)，繃緊陰囊皮膚，在睪丸中部，用輸精管分離尖鉗垂直陰囊皮膚穿刺，當(dāng)有明顯突破感時(shí)稍微張開(kāi)鉗子，夾取少量睪丸組織并放入培養(yǎng)液中，于顯微鏡直視下將睪丸組織撕碎，并觀察有無(wú)活動(dòng)精子。睪丸組織的冷凍：按體積比1∶1加入精子冷凍保護(hù)劑（美國(guó)Quinns產(chǎn)品），冷凍管內(nèi)靜置5 min，待睪丸組織與保護(hù)劑充分混勻，液氮中懸吊15 min后投入液氮冷凍保存。冷凍睪丸組織的復(fù)蘇：女方取卵當(dāng)日，從液氮中取出冷凍管迅速投入37℃水浴10 min，融解后先用1 mL注射器分開(kāi)曲細(xì)精管，清洗2遍，盡量多地去除紅細(xì)胞，然后用兩只折彎角度為90°的1 mL注射器針頭將精子從曲細(xì)精管中擠出至0.5 mL培養(yǎng)液中，取出反復(fù)擠壓過(guò)的曲細(xì)精管，置于37℃、6%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h，若有活動(dòng)精子，挑選活動(dòng)精子行ICSI，若無(wú)活動(dòng)精子，則選擇尾部彎曲柔軟精子行ICSI。

1.2.2 促排卵、取卵、受精及胚胎移植 控制性刺激排卵方案采取短效長(zhǎng)方案，降調(diào)超過(guò)14 d時(shí)對(duì)女方激素水平、竇狀卵泡直徑及子宮內(nèi)膜厚度進(jìn)行測(cè)定，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后應(yīng)用促性腺激素100～250 U啟動(dòng)控制下卵巢刺激周期，并對(duì)患者血清雌二醇和促黃體生成素水平及卵泡情況進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果合理調(diào)整促卵泡激素用量。當(dāng)直徑達(dá)到18 mm的主導(dǎo)卵泡超過(guò)3個(gè)時(shí)肌內(nèi)注射5000～10 000 U人絨毛膜促性腺激素，36 h后經(jīng)B超引導(dǎo)取出卵細(xì)胞。取出卵冠丘復(fù)合物立即放入培養(yǎng)液，HCG 38～40 h后選取MⅡ卵子行ICSI。以雙原核（2PN）卵子作為正常受精卵。第3天選擇1～3個(gè)Ⅱ級(jí)胚胎進(jìn)行移植。

1.2.3 卵子激活 對(duì)于卵子激活組，ICSI后，立即將卵子移入含有10 μM鈣離子載體A23187（Sigma），20 min后用培養(yǎng)液充分洗滌后轉(zhuǎn)移到37°C 和 6% CO2培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

兩組的卵子數(shù)，MⅡ（成熟卵）率、受精率、正常受精率（2PN）、平均可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)等被納入觀察指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]或（n/n）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較

卵子激活組與對(duì)照組兩組患者的女方年齡、不孕年限、BMI指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、LH、竇卵泡數(shù)等均無(wú)顯著性差異（P>0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

2.2兩組受精和胚胎發(fā)育情況

兩組治療受精、正常受精（2PN）、胚胎發(fā)育、妊娠結(jié)局：兩組的MⅡ（成熟卵）率無(wú)顯著性差異；受精率、正常受精率（2PN）、平均可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)具有顯著性差異（P<0.05），臨床妊娠率卵子激活組略高，但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

ICSI是將單個(gè)精子直接注入卵子胞質(zhì)內(nèi)激活卵子完成受精和胚胎發(fā)育，對(duì)男性不育患者，如梗阻性無(wú)精癥、重度少弱畸精子癥等，和常規(guī)的體外受精胚胎移植可以達(dá)到相同的臨床結(jié)局[6]。ICSI不僅能使用射出精子，還能采用附睪、睪丸中的精子并且均能使卵子完成受精和胚胎發(fā)育，取得和常規(guī)體外受精胚胎移植一樣的臨床結(jié)局[7]。由于睪丸活檢手術(shù)對(duì)男性的生理和心理均造成一定創(chuàng)傷，并且由于對(duì)曲細(xì)精管穿刺部位的差異，很可能導(dǎo)致取卵當(dāng)日穿刺取精的失敗[8]。因此，在行診斷性睪丸活檢時(shí)發(fā)現(xiàn)有活動(dòng)精子時(shí)進(jìn)行微量的睪丸精子冷凍，之后在取卵當(dāng)日使用凍融睪丸精子行ICSI。和射出精液中的精子相比，睪丸精子成熟度和活動(dòng)能力有一定程度的下降。睪丸精子經(jīng)過(guò)冷凍復(fù)蘇，活動(dòng)能力和受精能力進(jìn)一步的下降，推測(cè)是由于精子激活卵子的能力下降引起。

卵子的受精機(jī)制迄今尚未完全闡明，受精是精子和卵子之間相互作用的多步驟、多分子參與的復(fù)雜過(guò)程。一般認(rèn)為，其至少包括精子獲能、頂體反應(yīng)、精子穿過(guò)卵子透明帶、精子和卵子質(zhì)膜融合、卵子皮質(zhì)反應(yīng)、卵子激活、雌雄原核形成等過(guò)程。精子進(jìn)入到卵子后，釋放精子起源的可溶性卵子激活因子（SOAF）誘發(fā)卵子細(xì)胞內(nèi)鈣離子有規(guī)律的波動(dòng)稱(chēng)為鈣震蕩，鈣離子濃度的改變導(dǎo)致相關(guān)的離子通道開(kāi)放，從而激活卵子[9，10]。最近許多證據(jù)表面，位于精子頭部的PLC§可能是這種卵子激活因子[11]。ICSI受精方式繞過(guò)了精子獲能、頂體反應(yīng)、穿過(guò)透明帶等步驟，直接把制動(dòng)后精子注入卵子胞漿內(nèi)。制動(dòng)精子時(shí)通過(guò)注射針的機(jī)械應(yīng)力劃破精子尾部質(zhì)膜，有利于釋放精子中的卵子激活因子，因此與常規(guī)的體外受精方式受精失敗達(dá)到10%左右相比，ICSI的受精方式更加有保障。盡管如此，ICSI仍有1%～2%患者面臨受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)[12]。研究顯示，ICSI受精失敗多是由于精子缺乏卵子激活因子引起[13，14]。因此，采用人工卵子激活的方法模擬自然狀態(tài)下精子釋放卵子激活因子引發(fā)鈣離子震蕩可以挽救ICSI受精失敗[5]，人工激活的方法包括物理和化學(xué)方法，如使用離子霉素、鈣離子載體A23187[15，16]。為改善凍融精子行ICSI受精率和胚胎發(fā)育，本研究中采用鈣離子載體A23187進(jìn)行卵子激活。卵子激活后明顯提高了卵子的2PN受精率，更多的優(yōu)質(zhì)胚胎和可利用胚胎（P<0.05）（表2）。盡管單次的移植成功率沒(méi)有顯著差異，但顯然提高了實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)妊娠率。

盡管卵子激活的適應(yīng)癥隨著臨床的成功運(yùn)用越來(lái)越廣泛，已經(jīng)成功的運(yùn)用于前次ICSI完全受精失敗和受精率低下的患者，取得了很好的臨床效果，目前出生的嬰兒越來(lái)越多，子代安全性研究也未發(fā)現(xiàn)和自然受孕出生嬰兒有差異。但是仍需要更進(jìn)一步的觀察和多中心大樣本的研究。

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（收稿日期：2017-11-12）