郭娜娜，劉學軍，杜毓峰，郝小燕，張帆，林白陽，郭慧

（1.山西醫(yī)科大學，山西 太原 030000；2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院老年病科，山西 太原 030001）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，呈現年輕化趨勢[1]，且出現消化道癥狀及營養(yǎng)不良，因此肺與腸的關系成為該研究的切入點。中醫(yī)理論贊同肺腸具有相同的黏膜免疫機制，近年對腸屏障損傷的研究多在休克、燒傷、嚴重創(chuàng)傷以及多器官功能障礙綜合征等急性重癥中進行，并多將損害歸因于局部腸黏膜缺血、缺氧和腸內營養(yǎng)底物缺乏。但有關肺癌對腸黏膜屏障影響的規(guī)律和機制研究卻少見報道。目前自由基與肺癌的關系成為研究熱點[2]，為了解肺癌合并腸黏膜屏障功能障礙是否與自由基有關，設計小鼠肺癌模型試驗，通過測定血清MDA水平，光鏡下觀察小鼠小腸組織的病理形態(tài)，分析腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Occluden-1的表達，綜合分析肺癌對腸黏膜屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

1.1.1 實驗動物 健康C57BL/6雄性小鼠（6周齡）16只（北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量20～25 g，動物協(xié)議由實驗動物倫理委員會進行審查和批準，飼養(yǎng)于溫度穩(wěn)定在18～20℃，12小時明暗周期的塑料籠中，自由攝食飲水）。

1.1.2 主要材料及試劑 Lewis肺癌細胞（LLC）從上海細胞生物學研究所（上海，中國）購得；10%胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基；0.25%胰酶、血清試劑盒由南京建成生物公司提供；一抗：多克隆兔抗Occludin抗體，多克隆兔抗ZO1抗體購于武漢博士德公司；二抗：辣根酶標記山羊抗兔IgG購于北京諾博萊德科技有限公司、SABC免疫組化染色試劑盒購于中杉金橋公司；實驗中所用的是Scanscope數字病理掃描系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 將實驗動物適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為2組:A組為正常對照組（8只），B組為實驗肺癌模型組（8只）。在小鼠模型制備之前（約2 d），為避免局部傷口感染，給予肌注青霉素2萬單位和鏈霉素50 mg/（只·d）。

1.2.2 肺癌模型制備

（1）LLC細胞培養(yǎng) 用DMEM培養(yǎng)基（加10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素）于5%CO2、37℃無菌培養(yǎng)箱中按1:2分瓶傳代培養(yǎng)，取對數生長期的細胞培養(yǎng)作為實驗后續(xù)使用。

（2）造模 通過查閱文獻發(fā)現皮下接種成瘤率高，因此本實驗將離心（1 000 rpm,5 min）收集的LLC細胞經PBS洗滌調整細胞濃度后，使用1 ml注射器抽取約1 ml（1×106個/只）細胞懸液逐個注入以乙醚麻醉的B組小鼠的右前肢腋下，接種后7 d可捫及小結節(jié)，于14 d、21 d可見腫瘤明顯增大，平均長徑約2 cm，最大長徑為2.7 cm，腫瘤質地韌，光鏡下觀察肺組織HE染色病理結果，確定造模成功。

1.3 取材 取造模成功小鼠即肺癌模型組的心臟血、肺、回盲部上端10 cm小腸組織，將血樣離心后，提取血清儲存于-80℃冰箱，將肺、小腸經10%福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋。

1.4 指標測定

1.4.1 小鼠體態(tài)變化 觀察小鼠活動狀態(tài)、皮毛光澤。

1.4.2 小鼠肺功能檢測 選取成瘤小鼠，在處死取材之前進行游泳實驗，記錄小鼠置于水桶至頭低于水面以下的時間，可間接反映肺癌小鼠的肺功能變化。

1.4.3 肺組織形態(tài)學觀察 將石蠟包埋的肺組織切片行HE染色，光鏡下觀察各組肺組織變化。

1.4.4 血清測定 測定血清中MDA：MDA是機體發(fā)生炎癥反應時細胞釋放大量自由基，進而發(fā)生脂質過氧化的產物；當腸黏膜通透性增加，MDA可釋放入血，作為間接反映腸黏膜屏障功能受損程度及通透性的生化指標[3]。

1.4.5 小腸黏膜形態(tài)學指標 HE染色：腸道的石蠟組織包埋后切片，分別嚴格按照標準操作流程及試劑說明書進行小腸組織切片HE染色。光鏡下觀察小腸組織形態(tài)學改變。

1.4.6 免疫組化染色 ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白是細胞間重要的緊密連接蛋白，可反映腸道黏膜屏障上皮細胞緊密連接的完整性[4]。檢測小腸組織中ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白的表達水平，采用SABC法，按試劑盒說明書操作，抗體孵育后DAB顯色，陽性結果為棕黃色，應用病理圖像分析系統(tǒng)采集并分析圖像。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對所收集的數據進行整理分析。數據用“”表示,組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義標準。

2 結果

2.1 小鼠體態(tài)變化 A組正常對照組小鼠毛發(fā)光亮、一般情況較前無差異；B組實驗肺癌模型組小鼠毛發(fā)暗沉、身材消瘦、活動明顯減少、呼吸淺快。

2.2 小鼠肺功能檢測 測定小鼠游泳實驗中持續(xù)時間，間接反映小鼠肺功能變化，B組小鼠游泳持續(xù)時間明顯低于A組，提示B組小鼠的肺功能差于A組，可知肺癌對小鼠的肺功能有明顯影響，見表1。

表1 兩組小鼠游泳時間比較（）Table 1 Two groups of mice swimming time comparison()

表1 兩組小鼠游泳時間比較（）Table 1 Two groups of mice swimming time comparison()

游泳時間20.42±1.27 9.76±0.55＜0.05組別A組B組P值數量8 8

2.3 各組小鼠肺組織HE染色形態(tài)學觀察情況的比較 A組光鏡下未見癌組織，B組光鏡下可見癌組織，表現為核異型性明顯，核裂解，細胞體積增大及形狀不規(guī)則，排列紊亂。提示造模成功，見圖1，圖2。

圖1,2 分別為A組、B組小鼠肺組織HE染色（×200）Figure1,2 groupA,group B mouse lung tissue HE staining(×200)

2.4 血清測定MDA的結果見表2。

表2 兩組小鼠血清測定MDA的結果比較（）Table 2 Two groups of mice serum MDAresults compared()

表2 兩組小鼠血清測定MDA的結果比較（）Table 2 Two groups of mice serum MDAresults compared()

MDA 60.56±2.04 51.64±1.77＜0.05組別A組B組P值例數8 8

2.5 小腸黏膜HE染色形態(tài)學 A組腸黏膜連續(xù)、完好；B組腸微絨毛紊亂、黏膜下固有層間隙膠原纖維增生、隱窩增生。提示肺癌小鼠存在腸黏膜損傷，見圖3，圖4。

圖3,4 分別為A組、B組小鼠小腸組織HE染色（×100）Figure 3,4 HE staining of small intestine tissue of group Aand group B(×100)

2.6 兩組小腸組織中ZO-1蛋白、Occluden-1蛋白表達水平 A組ZO-1蛋白在小腸上皮組織胞漿大量表達呈棕褐色，B組胞漿染色范圍較分散及染色程度較弱，見圖5，圖6。

2.7 兩組小鼠小腸組織Occluden-1蛋白表達情況 A組Occluden-1蛋白在小腸上皮細胞大量表達呈棕褐色；B組Occluden-1蛋白在小腸上皮細胞染色較弱，見圖7，圖8。

圖5,6 分別為A組、B組小鼠腸道免疫組化ZO-1蛋白表達（×100）Figure5,6 show the expression of ZO-1 protein in intestinal tract of mice in groupAand group B respectively(×100)

圖7,8 為A組、B組小鼠小腸組織Occluden-1蛋白表達情況（×100）Figure 7,8 show the expression of Occluden-1 protein in small intestine of mice in groupAand group B(×100)

3 討論

隨著環(huán)境污染、社會老齡化、生活習慣等多種因素的影響，肺部疾病發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢，導致原發(fā)疾病急性加重的主要原因是感染，因而導致患者感染的病因機制逐漸成為研究突破點。O’Dwyer等[5]在《Nature》上最新發(fā)表的《肺微生物，免疫和慢性肺病的發(fā)病機制》中闡述了慢性肺部疾病加重時宿主的防御調節(jié)以及腸-肺軸的證據和影響，認為腸的細菌生物量與肺中的相對質量相差很小，肺部疾病進程和易感性受腸道微生物群組成變化的影響。此外，在沒有正常的腸道生物群的情況下，宿主對肺部感染更容易感染[6]；呼吸道和胃腸道具有共同黏膜免疫系統(tǒng)的組成部分，蛋白酶調控、免疫細胞在呼吸道、腸道中均發(fā)揮重要作用。本實驗通過制備小鼠肺癌模型，證實肺癌對腸黏膜屏障的損傷機制，進一步驗證關于腸-肺的黏膜免疫學說，為今后肺部疾病患者的預后及防治提出新的思路。

上皮屏障功能的維持是維持呼吸道和胃腸道黏膜健康狀態(tài)的關鍵。這是因為上皮屏障將黏膜間質和底層組織與黏膜腔中抗原物質的環(huán)境隔開。因此，由于黏膜炎癥而導致的屏障功能喪失導致了這些疾病的慢性發(fā)展，尚不清楚功能喪失是否是疾病的致病因素或后果[7]。肺部疾病常伴有消化道癥狀，有研究認為肺部疾病患者機體長期缺氧誘導一系列炎癥反應，釋放氧自由基、炎性因子等加劇腸黏膜的損傷[8-9]；機體處于低氧狀態(tài)，而腸道因特殊的解剖結構對缺氧最敏感，使腸道黏膜通透性增加，導致腸道細菌移位通過腸腔入血[10]。本實驗通過檢測血清中MDA的含量、腸黏膜厚度以及通過觀察小腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occluden-1的表達水平證實了肺癌小鼠存在腸黏膜損傷，探究了腸黏膜損傷的機制。

本實驗的研究存在一些局限性：①肺癌腸黏膜的改變可能涉及多種因素，目前對肺癌引起的腸黏膜損傷的研究尚無，本實驗設計思路源于臨床觀察發(fā)現肺癌患者常伴有消化道癥狀；②本實驗僅研究了腸黏膜損傷的其中一個機制，即缺血、缺氧對腸黏膜屏障的影響，且僅涉及了機械屏障的改變，尚未對腸黏膜屏障的免疫屏障、生物屏障等進行探索；③腸黏膜受損與腸道微生物分布及數量具有相關性，本實驗未進一步探索這一點；④本實驗僅通過游泳試驗間接反映肺癌小鼠肺功能的改變，未能準確評估小鼠缺氧程度，需進一步評估不同缺氧程度對腸黏膜損傷情況。綜上，腸黏膜屏障的損傷受多種因素影響，其損傷機制也不同，并且肺部疾病與腸道密切相關，因此肺部疾病對腸黏膜屏障的影響將成為今后研究熱點。

[1] Pruitt SL,Laccetti AL,Lei X,et al.Revisiting a longstanding clinical trial exclusion criterion:impact of prior cancer in early-stage lung cancer[J].British Journal of Cancer,2017,116(6):717-772.

[2] Ostrandrosenberg S,Sinha P.Myeloid-Derived Suppressor Cells:Linking Inflammation and Cancer[J].Journal of Immunology,2009,182(8):4499.

[3] Bosco G,Yang ZJ,Nandi J,et al.Effects of hyperbaric oxygen on glucose,lactate,glycerol and antioxidant enzymes in the skeletal muscle of rats during ischaemia and reperfusion[J].Clinical&Experimental Pharmacology&Physiology,2007,34(1-2):70.

[4] Lu Z,Ding L,Lu Q,et al.Claudins in intestines:,Distribution and functional significance in health and diseases[J].Tissue Barriers,2013,1(3):e24978.

[5] O'Dwyer DN,Dickson RP,Moore BB.The Lung Microbiome,Immunity,and the Pathogenesis of Chronic Lung Disease[J]. Journal of Immunology, 2016,196(12):4839.

[6] Fagundes CT,Amaral FA,Vieira AT,et al.Transient TLRactivationrestoresinflammatoryresponseand ability to control pulmonary bacterial infection in germfree mice[J].J Immunol,2012,188:1411-1420.

[7] Simon K,Talley NJ,Hansbro PM.Pulmonary-intestinal cross-talk in mucosal inflammatory disease[J].Mucosal Immunology,2012,5(1):7.

[8] Chen M,Yang T,Meng X,et al.Azithromycin attenuates cigarette smoke extract-induced oxidative stress injury in human alveolar epithelial cells[J].Molecular Medicine Reports,2015,11(5):3414-3422.

[9] Kelly D,Wischmeyer PE.Role of L-glutamine in criticalillness:newinsights[J].CurrentOpinionin Clinical Nutrition&Metabolic Care,2003,6(2):217-222.

[10]Dong L,Zhong X,Zhang L,et al.Impaired intestinal mucosal immunity is associated with the imbalance of T lymphocyte sub-populations in intrauterine growth-restricted neonatal piglets[J].Immunobiology,2015,220(6):775-781.