李秀平，任 由，崔天宇，鐘文英，岳婉晴

微流控芯片技術(shù)是近20年發(fā)展起來的新技術(shù)，具有集成度高、反應(yīng)速度快和流體易控制等特點(diǎn)，在生命分析領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)勢(shì)[1]。2008年，Whitesides[2]研究團(tuán)隊(duì)首次提出了微流控紙芯片（μPAD）這一概念。紙芯片是指在一些性能上優(yōu)于傳統(tǒng)的玻璃、硅、聚二甲基硅氧烷（poly(dimeylsiloxane)，PDMS）等材料上加工的微流控芯片，常見的紙芯片制作材料有色譜紙、硝酸纖維素膜、尼龍紙等。微流控紙芯片有著易于制造、成本低廉、使用方便和后處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為當(dāng)下一種可靠和低成本的分析手段，有望在臨床邊檢測(cè)（Point-of-Care Testing，POCT）[3]、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。

μPAD的制作方法有很多，如蠟印[4]、噴墨打印[5]、噴墨溶劑刻蝕[6]、等離子體處理[7]、光刻[8]、激光處理[9]、柔印技術(shù)[10]和手繪[11]等。制作原理是采用能固化的疏水材料如SU8光刻膠、蠟、聚苯乙稀、PDMS、聚甲基丙稀酸甲酰胺（PoNBMA）和烷基烯酮二聚體（AKD）等形成親水性和疏水性交替的通道，來引導(dǎo)流體的流向[1]。每種技術(shù)都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和局限性。如光刻技術(shù)具有較高的分辨率，但需要昂貴的光刻設(shè)備；噴墨打印技術(shù)操作簡(jiǎn)單、試劑廉價(jià)、可實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)，但通常需要具有強(qiáng)溶解力的有機(jī)溶劑，而這可能損壞墨盒和打印機(jī)；等離子體處理技術(shù)試劑廉價(jià)，成本較低，但需要制作不同形狀的金屬掩模[12]。所以這就需要科學(xué)工作者不斷優(yōu)化紙芯片的制作過程，來實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)。同時(shí)對(duì)紙芯片上流體驅(qū)動(dòng)機(jī)理的研究、更精準(zhǔn)的流體驅(qū)動(dòng)控制、與多種檢測(cè)方法結(jié)合、提高檢測(cè)的重現(xiàn)性和檢出限等，也需要研究者們不斷地思考[1]。

本研究采用了紫外光刻技術(shù)制作微流控紙芯片，并將得到的紙芯片用于人尿中總蛋白的檢測(cè)，開發(fā)了一種快速便捷易操作的人尿總蛋白檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)正常尿液和蛋白質(zhì)超標(biāo)尿液的檢測(cè)，有望用于臨床邊檢測(cè)中腎病的早期檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑和材料

環(huán)戊酮（CP，上海阿拉丁試劑有限公司），異丙醇和氯化鈉（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），溴酚藍(lán)（溴酚藍(lán)）（Alfa aesar, #ALFA-032641-5G）和尿素（Sigma）均為分析純。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（0.3 mg /mL）購(gòu)自Sigma公司，1號(hào)色譜紙購(gòu)自GE公司，SU8 2050光刻膠和SU8顯影劑購(gòu)自MicroChem Inc，Newton MA。

1.1.2 儀器

紫外線曝光機(jī)（KVD-30，臺(tái)灣金電子有限公司），LED數(shù)顯加熱型磁力攪拌器（MS-H280-Pro，Scilogex），倒置顯微鏡（TS2-S-SM，NiKon）。

1.2 微流控紙芯片的制作

首先，用環(huán)戊酮稀釋SU8光刻膠，環(huán)戊酮與SU8的質(zhì)量比為4∶1。室溫下將色譜紙浸入2 mL稀釋過的SU8光刻膠中靜置30 s，之后在95 ℃電熱板上預(yù)烘5 min，使光刻膠中的溶劑蒸發(fā)，然后室溫冷卻。光掩模用600 dpi激光打印機(jī)打印在透明菲林膜上。將設(shè)計(jì)好通道形狀的掩膜與色譜紙重疊放置，在405 nm紫外線下照射60～80 s，再將色譜紙放置在95 ℃的電熱板上后烘5 min。待室溫冷卻后將色譜紙浸在SU8顯影劑中，不斷攪拌5 min。顯影完全的色譜紙用異丙醇清洗，再用紙巾吸去色譜紙上的異丙醇，自然風(fēng)干1 h。

1.3 總蛋白的快速檢測(cè)

將0.05 g溴酚藍(lán)粉末溶解在1 mL 95%的乙醇中，制備濃度為50 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，用去離子水將其稀釋至5、8和10 mg/mL等系列質(zhì)量濃度。再用含9.3 g/L尿素的0.9% NaCl溶液將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.02，0.05，0.10，0.15和0.20 mg/mL系列質(zhì)量濃度。將0.2 μL不同質(zhì)量濃度的溴酚藍(lán)溶液預(yù)先點(diǎn)樣到紙芯片上的試劑區(qū)，將紙芯片空氣干燥10 min，用倒置顯微鏡拍攝圖像。之后在樣品區(qū)域添加10 μL不同質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，5 min后拍攝紙芯片的圖像并進(jìn)行后續(xù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 微流控紙芯片的設(shè)計(jì)和制作

設(shè)計(jì)的紙芯片由中間的加樣區(qū)和周圍的不同檢測(cè)區(qū)組成。這樣的設(shè)計(jì)可以在一塊芯片上進(jìn)行樣品的平行檢測(cè)，確保了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。微流控紙芯片的制作過程如圖1所示。首先將親水性的紙用疏水性的光刻膠浸泡，之后預(yù)烘，使光刻膠中的溶劑蒸發(fā)。將設(shè)計(jì)好通道形狀的掩膜與感光紙重疊放置，經(jīng)紫外光（ultraviolet，UV）曝光處理，然后顯影除去未交聯(lián)的光刻膠。這里用到的是環(huán)氧基負(fù)性SU8光刻膠，未曝光的區(qū)域?qū)⒃陲@影過程中被洗去。

為了節(jié)約時(shí)間和成本，我們并沒有使用高分辨率打印機(jī)設(shè)計(jì)光掩模，而是利用辦公室中的激光打印機(jī)以600 dpi的分辨率打印，得到的掩膜上點(diǎn)的理論最小直徑值約為42.3 μm。對(duì)于大多數(shù)用于檢測(cè)的微流控紙芯片，其通道的設(shè)計(jì)尺寸通常在毫米范圍內(nèi)。因此，較低分辨率的辦公打印機(jī)不會(huì)影響紙芯片的質(zhì)量。結(jié)果表明，兩種光掩模制作的微流控紙芯片都可以成功地用于總蛋白含量分析。

2.2 加樣量和加樣方法優(yōu)化

由于色譜紙是親水性的，而光刻膠是疏水性的，在UV曝光和顯影之后，我們首先進(jìn)行了親水性測(cè)試。在實(shí)驗(yàn)中必須確保紙仍然是親水性的，并且在沒有圖案的區(qū)域上無殘留的光刻膠。實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化了檢測(cè)區(qū)上探針液體的用量，使其僅留存在確定的區(qū)域上，不會(huì)擴(kuò)散到加樣區(qū)，以避免與被測(cè)物混合。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)紙芯片檢測(cè)區(qū)域上探針液體用量為0.2 μL時(shí)，沒有觀察到染料的混合。

根據(jù)不同的需求，我們?cè)O(shè)計(jì)了蘸取和滴加兩種加樣方法（見圖2）。蘸取是用紙芯片蘸取樣品液滴，樣品溶液由于毛細(xì)作用而被吸在芯片上。滴加則是將一滴樣品溶液滴加到芯片的中心。蘸取方法的優(yōu)點(diǎn)是無需對(duì)液體進(jìn)行精確的體積控制，容易為大眾所使用。然而，在芯片圖案設(shè)計(jì)和制作時(shí)，需確保紙芯片的邊界是疏水性的，否則被測(cè)樣品將泄漏出檢測(cè)區(qū)域。

圖1 微流控紙芯片制作過程示意

圖2 在紙芯片上的兩種加樣方法（分別加入5 μL，10 μL樣品）

我們?cè)谛酒戏謩e加入5 μL和10 μL的染料來探究合適的加樣量，如圖2所示。當(dāng)加樣量為10 μL時(shí)，樣品可覆蓋到所有檢測(cè)區(qū)域，而5 μL的加樣量卻達(dá)不到這樣的效果。雖然不同紙芯片設(shè)計(jì)的尺寸可能略有不同，但選擇10 μL加樣量可確保樣品被有效檢測(cè)。

2.3 緩沖液的選擇

緩沖液的選擇對(duì)準(zhǔn)確分析復(fù)雜生物樣品中的總蛋白非常重要。我們?cè)谝幌盗胁煌瑵舛蠕宸铀{(lán)點(diǎn)樣的紙芯片上加不同類別的緩沖液來進(jìn)行篩選，如圖3所示。加入pH=6.2和pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）后，紙芯片顏色從黃色變?yōu)樗{(lán)色，這意味著當(dāng)使用PBS作為空白和稀釋溶液時(shí)，檢測(cè)的背景影響將很高。而0.9%的氯化鈉溶液顯示出較好的降低背景效果。通過測(cè)量加入緩沖液前后斑點(diǎn)的灰度變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溴酚藍(lán)濃度高于5 mg/mL時(shí)，0.9%NaCl緩沖液灰度變化低于15，顯示最小背景。所以對(duì)于下一步實(shí)驗(yàn)，我們使用了0.9%的氯化鈉溶液作為空白和稀釋蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。

2.4 探針濃度的優(yōu)化

為了使蛋白質(zhì)分析的結(jié)果便于肉眼觀察，我們進(jìn)一步優(yōu)化了探針溶液的濃度。溴酚藍(lán)在水中的溶解度小于1 mg/mL，但在乙醇中溶解度較高。因此，選用為95%的乙醇制備質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，再用去離子水稀釋。本次實(shí)驗(yàn)首先在紙芯片上分別滴加0.2 μL質(zhì)量濃度范圍為0.1～50 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，空氣干燥斑點(diǎn)10 min。然后在每個(gè)斑點(diǎn)上加入10 μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，干燥5 min。

在紙上滴加溴酚藍(lán)溶液并干燥后，顏色由淺藍(lán)色變?yōu)辄S色，最后顯示橙色。再加入質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品后，質(zhì)量濃度為5，8和10 mg/mL的溴酚藍(lán)斑點(diǎn)顯示由黃色到藍(lán)色的顏色變化比較明顯。在較高質(zhì)量濃度溴酚藍(lán)（25和50 mg/mL）存在下，斑點(diǎn)由黃色到藍(lán)色的顏色變化不像低質(zhì)量濃度溴酚藍(lán)那樣明顯。當(dāng)溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度過低（如0.1和1 mg/mL）時(shí)，顏色變化無法通過肉眼來識(shí)別。與無蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的空白溶液的灰度比較，低質(zhì)量濃度溴酚藍(lán)下斑點(diǎn)的灰度變化不太明顯，但在溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度范圍為5～10 mg/mL時(shí)灰度顯著增加，隨著溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高時(shí)又開始降低。因此，選質(zhì)量濃度范圍為5～10 mg/mL的溴酚藍(lán)可進(jìn)一步優(yōu)化紙芯片上總蛋白質(zhì)的分析。

圖3 系列不同質(zhì)量濃度溴酚藍(lán)點(diǎn)樣的紙芯片上添加不同緩沖液后斑點(diǎn)的灰度變化

如圖4a所示，紙芯片用0.2 μL質(zhì)量濃度為5，8和10 mg/mL的溴酚藍(lán)預(yù)先點(diǎn)樣，用0.9%NaCl緩沖液配制質(zhì)量濃度為0，2，5，10，15，20 mg /dL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，用芯片蘸取10 μL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品使其反應(yīng)。

紙芯片用質(zhì)量濃度為5，8和10 mg/mL 的溴酚藍(lán)預(yù)先點(diǎn)樣，然后分別與10 μL質(zhì)量濃度為0，2，5，10，15和20 mg/dL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)，用倒置顯微鏡CCD拍攝圖像。從圖4a可以看出，這3種溴酚藍(lán)質(zhì)量濃度都可以區(qū)分2～10 mg/dL的蛋白質(zhì)，而在質(zhì)量濃度為15和20 mg/dL的蛋白質(zhì)在5mg/mL和8 mg/mL溴酚藍(lán)存在下的顏色變化難以通過肉眼來鑒別。因此，選擇10 mg/mL溴酚藍(lán)作為檢測(cè)濃度范圍與尿液中蛋白質(zhì)水平相關(guān)的總蛋白的最佳濃度。

2.5 檢測(cè)限

確定了使用溴酚藍(lán)的最佳濃度，我們進(jìn)一步評(píng)估了紙芯片的檢測(cè)限。從圖4a可以看出，2～20 mg/dL蛋白質(zhì)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)可被10 mg/mL的溴酚藍(lán)鑒別，其顏色從橙色變?yōu)樗{(lán)色，蛋白質(zhì)的濃度越高，檢測(cè)區(qū)的藍(lán)色區(qū)域越多。我們接著又做了在10 mg/mL溴酚藍(lán)點(diǎn)樣的紙芯片上加入不同濃度蛋白質(zhì)后的RGB強(qiáng)度圖，如圖4b所示。根據(jù)線性擬合結(jié)果，檢測(cè)限和定量限分別為0.21和0.69 mg/dL。

2.6 模擬尿液中總蛋白質(zhì)

我們用制得的紙芯片對(duì)尿液中總蛋白含量進(jìn)行分析。將1.373 5 g NaCl，0.038 2 g KCl，0.257 3 g MgCl2，0.073 g CaCl2·2H2O和1.7 g尿素在100 mL去離子水中溶解來制備模擬尿液。使用標(biāo)準(zhǔn)加入法在模擬尿液中分別添加6和12 mg/mL蛋白質(zhì)。使用無蛋白質(zhì)的模擬尿液作為對(duì)照，以評(píng)估存在于尿液中的離子的干擾。結(jié)果表明，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Cl-和尿素的存在不影響蛋白質(zhì)分析。

實(shí)際測(cè)量的蛋白質(zhì)濃度將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。重復(fù)最佳擬合曲線和溴酚藍(lán)濃度來評(píng)估回收率。結(jié)果表明，從RGB通道測(cè)得的平均蛋白濃度，如表1所示，得到的回收率在96.78%～103.82%。

表1 通過標(biāo)準(zhǔn)添加法計(jì)算蛋白質(zhì)濃度和回收率

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將紙芯片放置在暗室中，通過在幾個(gè)紙芯片上點(diǎn)樣質(zhì)量濃度為10 mg /mL的溴酚藍(lán)來進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。在制備之后的第0，1，5，8，12，15，19，22，26，30，34，42，48，62，68，71，76和83天拍攝紙芯片圖像。每天的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)使用3個(gè)紙芯片：一個(gè)做空白對(duì)照，另外兩個(gè)加10 mg/dL的蛋白質(zhì)。空白和添加蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品前后紙芯片的灰度級(jí)，由ImageJ軟件來定量。

通過繪制每個(gè)條帶中的藍(lán)色通道的灰度與時(shí)間的關(guān)系，我們可以繪制如圖5a所示的穩(wěn)定性曲線。室溫下在暗室中儲(chǔ)存的條紋灰度在前40天保持在20～40的范圍內(nèi)，在第83天后略微增加到大約60。在9.3 g/L尿素和0.9%NaCl存在時(shí)，信號(hào)也保持在與測(cè)試前相同的范圍內(nèi)。當(dāng)添加10 mg/dL蛋白質(zhì)時(shí)，藍(lán)色通道中的灰度增加到70，并且信號(hào)相對(duì)于新鮮制備的條帶和存儲(chǔ)48天的條帶來說比較穩(wěn)定，但在83天后稍微增加到大約90。然而，減去背景信號(hào)后顯示灰度變化在83天內(nèi)保持穩(wěn)定（見圖5b），這表明得到的紙芯片具有良好的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。

圖4 在10 mg/mL溴酚藍(lán)點(diǎn)樣的紙芯片上加入不同濃度蛋白質(zhì)后的RGB強(qiáng)度

圖5 室溫下在暗室中儲(chǔ)存的紙芯片上檢測(cè)區(qū)的灰度總結(jié)（評(píng)估期為83天）

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)于尿中總蛋白質(zhì)含量的分析，我們構(gòu)建了基于微流控紙芯片的快速檢測(cè)法，并且優(yōu)化了指示劑的加載量和濃度、加樣方法和加樣量以及緩沖液的選擇等參數(shù)。每個(gè)檢測(cè)試驗(yàn)的指示劑用量為0.2 μL，樣品量為10 μL。采用浸漬和滴加兩種加樣方法，原理都是利用毛細(xì)作用將樣品吸收到檢測(cè)區(qū)。檢測(cè)過程在5 min內(nèi)可用肉眼觀察。可以通過量化由顯微鏡或手機(jī)拍攝的芯片圖像的灰度來執(zhí)行半定量。檢測(cè)限為0.21 mg/dL，定量限為0.69 mg/dL。結(jié)果表明，使用微流控紙芯片進(jìn)行尿液中總蛋白質(zhì)分析時(shí)，尿樣中的尿素不會(huì)干擾結(jié)果。模擬尿液中總蛋白質(zhì)分析，回收率為96.78%～103.82%。在3個(gè)月內(nèi)評(píng)估的紙芯片測(cè)定法有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，表明該測(cè)定潛在地可以在完整的生物樣品中進(jìn)行。

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