岳孝亭，劉 燊，楊承忠，呂敏芝，郭金彪，張綺瓊，劉潔珠，林樹(shù)茂

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山528231)

骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程涉及多信號(hào)途徑、多基因表達(dá)及網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控，其過(guò)程很復(fù)雜。包括骨骼肌的細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程，受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控。在不同的發(fā)育階段，相關(guān)基因互相影響，借助于復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控通路方式，共同維持肌肉的生長(zhǎng)與分化。目前對(duì)骨骼肌發(fā)育的研究主要集中在蛋白編碼基因，其中包含MADS同源盒蛋白、鋅指蛋白和Wnt家族成員、基于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)蛋白質(zhì)家族的Myf5、MyoD、Mrf4和Myogenin等生肌調(diào)節(jié)因子(Myogenic Regulatory Factors，MRFs)或肌源性分化因子(Myogenic Differentiation Factors，MDFs)等基因，這些基因的表達(dá)對(duì)肌細(xì)胞的構(gòu)成、分化和肌組織形態(tài)的構(gòu)建起著特殊的作用[1-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 nt(18～25 nt)的非編碼單鏈小分子RNA，在動(dòng)物體內(nèi)普遍存在并且參與其生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、凋亡等生命過(guò)程。miRNA通過(guò)與靶基因mRNA的3'UTR相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平引起靶基因mRNA的降解或抑制其蛋白質(zhì)合成，從而來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。

從19世紀(jì)末，Lee等[5]在秀麗新小桿線蟲(chóng)(c.elegans)中發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)控胚胎后期發(fā)育的第一個(gè)miRNA-lin4后，有越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)。本世紀(jì)初，有人在線蟲(chóng)中初次發(fā)現(xiàn) let-7，現(xiàn)已成為目前研究最為普遍的miRNA家族之一[6]。let-7具有高度時(shí)空表達(dá)性、組織特異性、保守性等特點(diǎn)，普遍參加細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和癌細(xì)胞的浸潤(rùn)。先期研究發(fā)現(xiàn)，let-7b作為let-7家族的重要成員之一，對(duì)雞的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮重要作用[7]。通過(guò)采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IGF2BP3是let-7b的候選靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP3(Insulin-like Growth Factor 2 mRNA-Binding Protein 3)，又名IMP3(IGF2 mRNA-Binding Protein 3)、KOC(KH-domain containing Protein overexpressed in cancer)和L523S，屬于VICKZ家族(Vgl，RBP/Vera，IMP-l，2，3，CRD-BP，KOC，ZBP-l)，是胰島素樣生長(zhǎng)因子RNA結(jié)合蛋白家族(RNA-binding proteins，RBPs)中的重要成員，具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的作用。研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP3(IMP3)能夠高度特異地與編碼IGF2的mRNA相結(jié)合，是一種可以與胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)相結(jié)合的分泌性蛋白，參與IGF2 mRNA的定位、穩(wěn)定性、反轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)，對(duì)RNA的運(yùn)輸、穩(wěn)定、細(xì)胞的增殖和遷移具有非常重要的作用[8]。為此，本研究以let-7b過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染雞成肌細(xì)胞，通過(guò)觀察成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及IGF2BP3等相關(guān)基因的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探討let-7b對(duì)雞骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

根據(jù)let-7b 前體序列設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)，在其兩端各保留約200 bp，從雞基因組中PCR 擴(kuò)增獲得約541bp片段，通過(guò)酶切位點(diǎn)NotI與ApaI將其連入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，構(gòu)建let-7b過(guò)表達(dá)載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b。根據(jù)預(yù)測(cè)的IGF2BP3 3′UTR 與let-7b結(jié)合的靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，在其兩端各保留約200bp，從雞基因組中PCR 擴(kuò)增獲得約453bp片段，通過(guò)酶切位點(diǎn)SacI與XbaI將其連入靶基因報(bào)告載體pMIR-REPORT，構(gòu)建IGF2BP3報(bào)告載體pmirGLO-let-7b-IGF2BP3 3'UTR。根據(jù)種子區(qū)設(shè)計(jì)突變引物，與IGF2BP3 3′UTR 引物進(jìn)行重疊PCR對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行突變，將突變產(chǎn)物連入pMIR-REPORT，構(gòu)建IGF2BP3靶位點(diǎn)突變報(bào)告載體pMIR-mIGF2BP3(表2)。

1.2 雙熒光素酶檢測(cè)

本試驗(yàn)采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行靶標(biāo)驗(yàn)證。首先將let-7b的候選靶基因IGF2BP3 3'UTR靶序列插入到螢火蟲(chóng)熒光素酶基因下游。然后進(jìn)行共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。試驗(yàn)分為3個(gè)組：(1)let-7b過(guò)表達(dá)載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b與其靶基因IGF2BP3 驗(yàn)證載體pmirGLO-let-7b-IGF2BP3 3'UTR共轉(zhuǎn)染到DF-1細(xì)胞(let-7b組)；(2)let-7b過(guò)表達(dá)載體與靶基因IGF2BP3種子序列點(diǎn)突變載體共轉(zhuǎn)染組(let-7b-mut組)；(3)let-7b過(guò)表達(dá)載體與空質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染對(duì)照組(NC組)。

具體方法為：在24孔板中，對(duì)于每孔細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pmirGLO-miR-基因3'UTR(或突變質(zhì)粒)200 ng、pcDNA-EGFP-pre-miRNA 600 ng及陰性對(duì)照30 pM。50 μL OPTI-MEMI培養(yǎng)基稀釋2 μL Lipofectamine 2000試劑后孵育5 min；混合需轉(zhuǎn)染的DNA和稀釋的Lipofectamine 2000，室溫孵育20 min后直接將復(fù)合物加到含0.4 mL OPTI-MEMI培養(yǎng)基的細(xì)胞中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻；在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后換0.5 mL含10%FBS，不含抗生素的正常DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞。

表1 pre-let-7b及其側(cè)翼序列的擴(kuò)增引物Table 1 Primer for pre-let-7b

注：下劃線部分為保護(hù)堿基序列，斜體部分為酶切位點(diǎn)(NotI與ApaI)。下同。

Note：The underlined part is protective base，the italicized part is restriction site. (NotIandApaI).The same below.

表2 let-7b靶基因IGF2BP3 3'UTR序列擴(kuò)增引物Table 2 Primer for predicted target gene IGF2BP3 3'UTR of let-7b

熒光素酶檢測(cè)按照Dual Luciferase Reporter Gene AssayKit(Promega公司)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)報(bào)告基因的強(qiáng)度。

1.3 成肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

參照成肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的步驟進(jìn)行[9]。將孵化至E11 的胚蛋，用75%乙醇消毒蛋殼，無(wú)菌操作取出胚胎，分離肌肉置于預(yù)先加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)的培養(yǎng)皿中。將肌肉組織剪碎，加入DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含15%胎牛血清)；將組織液移入50 mL離心管中，在旋渦振蕩器上高速混合40 s，吸取上清液，用雙層200 目尼龍膜過(guò)濾。反復(fù)震蕩過(guò)濾3 次，收集全部濾液1 000 r/min轉(zhuǎn)離心5 min，棄上清。用新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移至培養(yǎng)皿中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)40 min；如此反復(fù)差貼3次，以消除成纖維細(xì)胞。

1.4 功能驗(yàn)證

將let-7b過(guò)表達(dá)載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b轉(zhuǎn)染至成肌細(xì)胞，并同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒對(duì)照。具體方法為：50 μL OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋600ng let-7b過(guò)表達(dá)載體，輕柔混勻室溫孵育5 min；50 μL OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋2 μL Lipofectamine 2000試劑后輕柔混勻室溫孵育5 min；將上述兩樣品混合，室溫孵育20 min后直接將復(fù)合物加到含0.4 mL OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基的細(xì)胞中，來(lái)回?fù)u動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻；于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后換0.5 mL含10%FBS，不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，不同時(shí)間組分別設(shè)3個(gè)重復(fù)。

用MTT法測(cè)定OD值[10]。轉(zhuǎn)染后，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)平行樣品。每孔加入MTT (5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸盡培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO 振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上讀取OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm。取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)平行樣品的平均值，根據(jù)OD值繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

qPCR檢測(cè)基因表達(dá)量：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法檢測(cè)let-7b 、IGF2BP3、IGF2、IGF2R、IGF1和IGF1R的表達(dá)，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]，引物信息見(jiàn)表3。

表3 qRT-PCR引物的信息Table 3 Sequences of primers used for qRT-PCR

采用Western blot測(cè)定其靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)量。ELISA檢測(cè)，依照蛋白質(zhì)種類(lèi)的不同依照所購(gòu)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果采用2-ΔCt分析IGF2BP3、IGF2、IGF1等基因相對(duì)于GAPDH基因、let-7b相對(duì)于18S的表達(dá)。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果采用螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性比進(jìn)行分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，組間比較采用SPSS12.0 軟件的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA let-7b與靶基因IGF2BP3 3'UTR的雙熒光素酶驗(yàn)證

共轉(zhuǎn)染IGF2BP3 3'UTR熒光素酶報(bào)告與let-7b過(guò)表達(dá)載體到DF-1細(xì)胞，雙熒光素酶驗(yàn)證結(jié)果顯示，let-7b過(guò)表達(dá)載體與IGF2BP3 驗(yàn)證載體共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對(duì)活性明顯下降，表明let-7b能夠抑制IGF2BP3 的 3'UTR熒光素酶報(bào)告基因的活性；而當(dāng)結(jié)合let-7b的位點(diǎn)突變后，這種抑制作用大大降低，表明let-7b與靶基因IGF2BP3有確切的靶標(biāo)關(guān)系(圖1)。

圖1 let-7b與靶基因IGF2BP3 3'UTR靶標(biāo)螢火蟲(chóng)/海腎雙熒光素酶驗(yàn)證Fig.1 Validation of luc2/hRluc-neo between let-7b and IGF2BP3

2.2 miRNA let-7b對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響

將let-7b過(guò)表達(dá)載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b轉(zhuǎn)染到成肌細(xì)胞，并同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒對(duì)照。在細(xì)胞培育0h、24h、48h、72h后，采用MTT檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，let-7b過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后，與空質(zhì)粒組相比，細(xì)胞增殖受到一定程度的影響，細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。

2.3 miRNA let-7b對(duì)靶基因IGF2BP3與相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量的影響

將let-7b過(guò)表達(dá)載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空質(zhì)粒對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)36h后，分別收集細(xì)胞并提取總RNA，并同時(shí)進(jìn)行熒光定量分析(見(jiàn)圖3)。從圖3中可見(jiàn)，let-7b過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后，let-7b的表達(dá)量為空質(zhì)粒對(duì)照組的3.09倍，差異極顯著(P<0.01)，其靶基因 IGF2BP3的mRNA表達(dá)量則下調(diào)了2.33倍，差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明let-7b對(duì)IGF2BP3基因有負(fù)向調(diào)控作用。而IGF2、IGF1的mRNA表達(dá)量有一定程度的變化，但差異不顯著(P>0.05)。

圖2 miRNA let-7b對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of miRNA let-7b on myoblast proliferation

2.4 miRNA let-7b對(duì)靶基因IGF2BP3的蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

把let-7b過(guò)表達(dá)載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞，并且設(shè)置空質(zhì)粒對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，對(duì)成肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行western blotting和ELISA分析，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

從圖4可知，let-7b轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞36 h后，IGF2BP3的蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯減少，這與上述let-7b過(guò)表達(dá)可使IGF2BP3基因mRNA表達(dá)量下調(diào)2.33倍的結(jié)果相一致。

圖3 miRNA let-7b對(duì)靶基因IGF2BP3及相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of miRNA let-7b on mRNA expression of target gene IGF2BP3 and related genes

圖4 miRNA let-7b對(duì)成肌細(xì)胞IGF2BP3蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of miRNA let-7b on the expression of IGF2BP3 protein in myoblasts

圖5 let-7b對(duì)成肌細(xì)胞IGF2、IGF1表達(dá)量的影響Fig. 5 Effects of let-7b on the expression of IGF2 and IGF1 in myoblasts

從圖5可知，根據(jù)ELISA分析，let-7b轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞24 h，IGF2的蛋白質(zhì)表達(dá)量與空質(zhì)粒對(duì)照組比較，下降了57.1%，差異顯著(P<0.05)，但在轉(zhuǎn)染后36 h，IGF2的蛋白質(zhì)表達(dá)量與空質(zhì)粒對(duì)照組接近，差別不顯著(P>0.05)，說(shuō)明let-7b對(duì)IGF2的蛋白質(zhì)表達(dá)的影響隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減弱(見(jiàn)圖5A)。從ELISA分析結(jié)果來(lái)看，把let-7b轉(zhuǎn)染到成肌細(xì)胞24h后，IGF1的蛋白質(zhì)表達(dá)量與空質(zhì)粒對(duì)照組相比下降了8.4%，差異不顯著(P>0.05)，但在轉(zhuǎn)染后36h，IGF1的蛋白質(zhì)表達(dá)量與空質(zhì)粒對(duì)照組相比較，下降了24.5%，差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明let-7b對(duì)IGF1的蛋白質(zhì)表達(dá)的影響隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)(見(jiàn)圖5B)。

3 討 論

骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程涉及多基因調(diào)控，受許多細(xì)胞因子的調(diào)理，過(guò)程非常繁瑣。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼小分子單鏈 RNA，在動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在并參與調(diào)節(jié)動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育等一系列生命過(guò)程。miRNA經(jīng)過(guò)與靶基因mRNA相結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄程度上導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或翻譯的抑制，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

IGF2BP3作為一種轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控因子，主要參與胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生而受到廣泛重視[11]。對(duì)IGF2BP3的研究主要集中在動(dòng)物癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制方面，大量研究表明，IGF2BP3對(duì)促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖具有重要作用[12-13]。有關(guān)IGF2BP3參與調(diào)控雞生長(zhǎng)發(fā)育的研究報(bào)道很少。本研究在前期靶基因預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，通過(guò)let-7b過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶靶標(biāo)驗(yàn)證，證明miRNA let-7b對(duì)IGF2BP3基因具有靶向調(diào)控作用。為了進(jìn)一步觀察miRNA let-7b對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用，將let-7b過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7b對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生了明顯影響。從mRNA的表達(dá)情況來(lái)看，與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因中，只有l(wèi)et-7b的靶基因IGF2BP3明顯下調(diào)，而IGF2、IGF1的mRNA表達(dá)量則變動(dòng)不大。與此同時(shí)，western blotting分析發(fā)現(xiàn)，IGF2BP3的蛋白質(zhì)表達(dá)量也同步下降。ELISA分析發(fā)現(xiàn)，let-7b轉(zhuǎn)染24 h時(shí)IGF2的蛋白質(zhì)含量明顯下調(diào)，36 h后恢復(fù)正常水平，推測(cè)let-7b可使IGF2BP3表達(dá)量下降，但對(duì)IGF2 mRNA的表達(dá)影響不大，它的影響主要是使IGF2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率降低，而且其影響會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降；let-7b轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞24 h后IGF1的表達(dá)量受到一定影響，36 h后則明顯下調(diào)，但其作用機(jī)理尚不清楚。

研究表明，IGF2BP3是胰島素樣生長(zhǎng)因子RNA結(jié)合蛋白家族中的一個(gè)重要成員，可以高度特異地與編碼IGF2的mRNA結(jié)合，是一種能夠與胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)相結(jié)合的分泌性蛋白，參加RNA的運(yùn)輸、穩(wěn)定、細(xì)胞的增殖和遷移[14-15]。IGF2BP3與IGFs結(jié)合能夠調(diào)控IGFs與IGF2受體間的互相作用，改變其促有絲分裂效應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、黏附和運(yùn)動(dòng)[16]。IGF2(insulin-like growth factor 2)基因又稱(chēng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素A(somatomedin A)，是動(dòng)物生長(zhǎng)軸上重要的因子，也是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在細(xì)胞的分化、增殖，胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育以及腫瘤細(xì)胞中具有重要的作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子通過(guò)自分泌/旁分泌機(jī)制在禽類(lèi)胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[17]。

綜上可見(jiàn)，miRNA let-7b對(duì)雞成肌細(xì)胞增殖效果的影響，主要是通過(guò)靶向調(diào)控IGF2BP3的mRNA表達(dá)，進(jìn)而影響其蛋白質(zhì)表水平。而IGF2BP3表達(dá)水平的下降，又進(jìn)一步影響到IGF2的運(yùn)輸、穩(wěn)定和遷移功能，從而影響成肌細(xì)胞的增殖。

4 結(jié) 論

通過(guò)let-7b過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶靶標(biāo)驗(yàn)證，證明miRNA let-7b對(duì)IGF2BP3基因具有靶向調(diào)控作用。進(jìn)一步分析表明，miRNA let-7b主要是通過(guò)靶向調(diào)控IGF2BP3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，并進(jìn)一步影響IGF2的運(yùn)輸、穩(wěn)定和遷移功能而影響成肌細(xì)胞的增殖。

[1] ZHAO Yong, SAMAL E, SRIVASTAVA D. Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis[J]. Nature, 2005, 436(748): 214-220.

[2] CHEN Jian-fu, MANDEL E M, THOMSON J M, et al. The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation[J]. Nature Genetics, 2006, 38(2): 228-233.

[3] RAO P K, KUMAR R M, FARKHONDEH M, et al. Myogenic factors that regulate expression of muscle-specific microRNAs[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(23): 8 721-8 726.

[4] BARTEL D P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

[5] LEE R C, FEINBAUM R L, AMBROS V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854.

[6] REINHART B J, SIACK F J, BASSON M, et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J].Nature, 2000,403(6772):901-906.

[7] LIN Shumao, LI Hongmei, MU Heping, et al. Let-7b regulates the expression of the growth hormone receptor gene in deletion-type dwarf chickens[J]. BMC Genomics, 2012,13:306.

[8] NIELSEN F C, NIELSEN J, KRISTENSEN M A, et al. Cytoplasmic trafficking of IGF-II mRNA-binding protein by conserved KH domains[J]. Journal of Cell Science, 2002, 115(10): 2 087-2 097.

[9] 張麗. 雞GHR 基因天然反義鏈轉(zhuǎn)錄本功能研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[10] 曾四平．MTT法測(cè)定 mir-129對(duì)腎癌細(xì)胞 SN12-PM6生長(zhǎng)曲線影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]．齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014(20)：2 965-2 966．

[11] DEFORZH E, VARGAS T R, KROPP J, et al. IMP-3 protects the mRNAs of cyclins D1 and D3 from GW182/AGO2-dependent translational repression[J]. International Journal of Oncology, 2016, 49(6): 2 578-2 588.

[12] ZHOU Yuhang, HUANG Tingting, SIU H L, et al. IGF2BP3 functions as a potential oncogene and is a crucial target of miR-34a in gastric carcinogenesis[J]. Molecular Cancer, 2017, 16(1): 77.

[13] JOHNSON B, KHALIL M, BLANSFIELD J, et al. Investigating the prognostic value of KOC (K homology domain containing protein overexpressed in cancer) overexpression after curative intent resection of pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Journal of Gastrointestinal Oncology, 2016, 7(6):113-117.

[14] NIELSEN J, CHRISTIANSEN J, LYKKE-ANDERSEN J, et al. A family of insulin-like growth factor II mRNA-binding proteins represses translation in late development[J]. Molecular and Cellular Biology, 1999, 19(2): 1 262-1 270.

[15] NIELSEN F C, NIELSEN J, CHRISTIANSEN J. A family of IGF-II mRNA binding proteins (IMP) involved in RNA trafficking[J]. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. Supplementum, 2001, 234: 93-99.

[16] BELL J L, WACHTER K, MUHLECK B, et al. Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins (IGF2BPs): post-transcriptional drivers of cancer progression?[J]. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS, 2013, 70(15):2 657-2 675.

[17] LIU Yanli, GUO Wei, PU Zhenyu, et al. Developmental changes of Insulin-like growth factors in the liver and muscle of chick embryos[J]. Poultry Science, 2016, 95(6): 1 396-1 402.