劉文貴， 戴國梁， 司海鵬， 汪有錦， 馬 坤， 沈湘蕾， 汪 維

介入治療肝臟惡性腫瘤中無論是經肝動脈給藥首過效應，還是穿刺瘤體直接注射藥物，均旨在增加腫瘤局部藥物濃度，減少全身不良反應［1-5］。有些藥物如氟尿嘧啶脫氧核苷經肝動脈灌注后除了首過效應，還由于肝臟對此類藥物代謝特點而產生首過清除效應。經肝動脈灌注氟尿嘧啶脫氧核苷后94%～99%滯留肝內，使正常肝細胞及腫瘤細胞內藥物濃度分別相當于外周靜脈同等量給藥后相應細胞藥物濃度的15倍和近400倍［2-4］。雷替曲塞是一種喹唑啉葉酸鹽類似物，經還原葉酸鹽載體系統(tǒng)攝入細胞，在葉酸多聚谷氨酸合成酶作用下迅速代謝為一系列多聚谷氨?；衔?，作用于胸苷酸合成酶（TS）靶點葉酸結合部位，特異性地抑制TS活性而發(fā)揮抗腫瘤作用［6-7］；其抑制作用是二氫葉酸還原酶的100倍，上市以來主要被推薦應用于不耐受或不適用5-氟尿嘧啶聯用亞葉酸鈣的晚期結直腸癌治療，在肝癌治療領域研究甚少［8-9］，僅見少量關于介入途徑給藥治療肝臟腫瘤的回顧性研究［10-12］。尚未見經多種介入途徑給予雷替曲塞對肝臟功能、肝臟組織學及藥代動力學（藥動學）影響的對照實驗研究。臨床等效劑量雷替曲塞通過介入放射學方法給藥的效應及安全性如何，經靜脈、動脈或直接穿刺注射各有哪些應用優(yōu)勢，本研究就這些問題進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

取飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學實驗動物中心普通清潔級新西蘭大白兔25只（購自南京安立默科技公司，合格證號：SCXK蘇-2010-0002），雌雄不限，體質量2.7～3.1 kg。實驗兔符合國家有關實驗動物保護規(guī)范和管理條例，動物實驗研究符合赫爾辛基宣言。實驗器材包括自制木質手術臺3張、靜脈留置針、常規(guī)開腹手術器械、精細手術器械（精細鑷子、手術剪、玻璃分針等）、介入穿刺套件、2.7 F Progret微導管套件等（日本Terumo公司）、GE128排螺旋CT機（美國通用公司）、平板DSA機（日本島津公司）、RM2235型切片機、ST 5020型自動染色機、CV5030型封片機（德國Leica公司）、高效液相色譜儀等。實驗藥物為2%戊巴比妥鈉溶液 （現場配制）、肝素（12 500 U/mL）、碘佛醇 300（江蘇恒瑞醫(yī)藥公司）、雷替曲塞注射液（南京正大天晴制藥公司）、青霉素G鈉80萬U/支、4%甲醛、0.9%NaCl溶液等。

1.2 實驗方法

分組給藥：所有操作均在介入DSA室或CT室進行。將25只實驗兔隨機分為外周靜脈注射組（A組）、肝動脈灌注組（B組）、肝動脈碘化油栓塞組（C組）、肝動脈明膠海綿顆粒栓塞組（D組）及肝臟直接穿刺注射組（E組），每組5只。實驗前所有實驗兔禁食、禁水12 h。實驗時予一側耳緣靜脈留置針（22 G），抽取1 mL血液用于檢測給藥前肝功能。以2%戊巴比妥鈉溶液經留置針推注麻醉實驗兔，并給予適量補液。A組經此留置針注射雷替曲塞；B、C、D組肝動脈插管采用股動脈入路［13］（圖1），微導管到位后根據實驗設計要求分別行經動脈灌注雷替曲塞、雷替曲塞+碘化油乳劑栓塞、雷替曲塞+明膠海綿顆粒栓塞；E組CT定位下肝臟穿刺（圖2），穿刺針到位后直接注射雷替曲塞。每只兔均經不同途徑或方式在約6 min內［14］接受臨床等效劑量雷替曲塞注射液（0.17 mg/kg體質量）。

血液及組織學取材：經實驗兔頸靜脈［13］抽取給藥后 5、15、30、60、120、180 min 靜脈血 1 mL，離心后取上清液用于檢測血藥濃度；給藥后6 h，抽取實驗兔1 mL靜脈血用于肝功能檢測，然后以空氣栓塞法處死每組2只實驗兔，摘取其肝臟制作組織學標本。剩下實驗兔送動物房飼養(yǎng)，1周后以同樣方法檢測肝功能及制作肝臟組織學標本。

圖1 經股動脈途徑行肝動脈插管造影

圖2 CT掃描定位行肝臟穿刺

血藥濃度檢測由本院臨床藥理基地具有多年工作經驗的藥理研究員（D.G.L）完成；所有組織學取材及分析均由同一位病理科副主任醫(yī)師（S.H.P）完成：將肝臟組織用4%甲醛溶液充分固定后，切開組織，目視下切取感興趣區(qū)組織塊（大小約2 cm×1.5 cm），經脫水、透明、浸蠟、包埋后切片（厚度3 μm），放入自動染色機完成染色、封片，光鏡下觀察組織學變化。

1.3 統(tǒng)計學處理

將實驗數據錄入Excel工作表，對其中連續(xù)性變量進行均數±標準差（±s）描述性統(tǒng)計分析，對分類數據以百分數表達。采用SPSS軟件包對數據進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

組間實驗兔在性別、體質量等方面差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。B組1只實驗兔在動脈插管過程中行補充麻醉后意外死亡；C組1只兔術后第2日死亡，無其它兔死亡。

2.2 給藥前后肝功能變化

給藥前后肝功能變化見表1，C、D、E組實驗兔給藥后6 h血清天冬氨酸轉氨酶（AST）、谷氨酸轉氨酶（ALT）與給藥前相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），以C組為著，給藥后1周時這些指標大部分恢復接近正常；A組或B組實驗兔相應指標與給藥前相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 實驗兔給藥前后血清肝功能變化 U/L

2.3 藥動學變化

給藥后 5、15、30、60、120、180 min 時實驗兔外周血藥濃度（μg/mL）在 A 組分別為 0.91、0.46、0.33、0、0、0，B 組分別為 1.73、1.27、0.86、0.62、0.53、0.37，C 組分別 為 0.82、0.48、0.37、0.24、0.10、0.08，D 組分別為 0.94、0.49、0.36、0.18、0.15、0.08，E 組分別為0.39、0.25、0.18、0.13、0、0。 各組實驗兔給藥后外周血藥濃度變化趨勢見圖3。實驗兔肝臟組織學變化顯示，給藥6 h后A組肝細胞在光鏡下表現為輕度水腫變性（圖4②），1周后鏡下見匯管區(qū)小膽管輕度增生，伴少量炎性細胞浸潤，而肝細胞形態(tài)已恢復正常；B組肝臟可見少量灶性壞死，肝細胞明顯水腫（圖4③），1周后鏡下見匯管區(qū)小膽管增生及炎性細胞浸潤程度也明顯強于外周靜脈組，但肝細胞形態(tài)已基本恢復正常；C組肝組織呈多灶、小片狀凝固性壞死，肝細胞明顯水腫（圖4④），1周后小膽管增生及炎性細胞浸潤明顯強于B組，并出現脂肪變性，肝細胞水腫已消退，但仍見壞死灶（圖4⑦）；D組肝細胞急性水腫及壞死程度輕于C組（圖4⑤），1周后匯管區(qū)小膽管增生、炎性細胞浸潤及脂肪變性程度也弱于C組，栓塞區(qū)仍見片狀凝固性壞死區(qū)（圖4⑧）；E組肝組織呈大片狀凝固性壞死，肝細胞呈氣球樣水腫 （圖4⑥），1周后匯管區(qū)小膽管增生、炎性細胞浸潤及脂肪變性弱于C、D組，肝細胞水腫與凝固性壞死并存（圖4⑨）。

3 討論

圖3 給藥后實驗兔血藥動學變化（頸靜脈取血）

經肝動脈灌注化療是利用肝臟對某些藥物的首過效應或首過清除效應［2-5］。經導管動脈化療栓塞術（TACE）已成為治療不可切除肝臟惡性腫瘤的標準方法，術中常用碘化油除作為栓塞劑栓塞腫瘤血管，還作為化療藥物載體起到靶向、緩釋化療的作用［2-5］。藥物洗脫微球（DEM）TACE同樣是通過對富血供病灶超選擇插管和栓塞，使微球攜帶藥物緩釋后顯著延長與病變接觸時間，減少全身藥物總劑量［1-4，14-15］。 然而對乏血供、無法行超選擇插管的腫瘤，介入法局部穿刺注射給藥不失為一種理想手段［3-5，15］。

圖4 給藥后實驗兔肝臟組織學變化

雷替曲塞療效與藥物濃度呈正相關。該藥通過細胞膜還原型葉酸/甲氨蝶呤載體被細胞主動攝取后，在細胞內被葉酸基聚谷氨酸合成酶代謝為一系列多聚谷氨酸類化合物，并能在細胞內潴留，特異性地抑制TS活性并具有超長作用時間（半衰期長達 198 h）［6-7，10-12］。如果雷替曲塞和氟尿嘧啶脫氧核苷一樣經肝動脈灌注后具有顯著的首過效應和首過清除效應，將是治療肝臟腫瘤的理想藥物，但也不得不關注其對正常肝組織的損傷。本研究發(fā)現雷替曲塞經靜脈注射5 min后已分布全身循環(huán)，全身細胞主動攝取后頸靜脈血藥濃度迅速降低（本研究檢測血中雷替曲塞原藥，非細胞內代謝后成分），而經肝動脈灌注同等劑量雷替曲塞5 min后頸靜脈內血藥濃度約為靜脈注射的2倍，說明肝臟對此藥無首過清除效應，但由于藥物首過效應，肝區(qū)藥物不斷隨循環(huán)到達頸靜脈，3 h后血藥濃度仍與靜脈給藥后30 min藥物濃度相當。碘化油或明膠海綿顆?；旌侠滋媲笏ㄈ?，顯示有明顯緩釋效應，給藥后5 min時血藥濃度僅為肝動脈灌注組50%，且給藥后3 h仍可檢測到緩釋藥物。肝臟直接穿刺注射藥物則明顯提高了局部藥物濃度，因為藥物滲入血液循環(huán)很慢，60 min后同樣也難以檢測藥物濃度。

肝功能和肝臟組織學變化同樣可反映經不同途徑給予雷替曲塞后對肝臟產生的效應。動脈灌注無明顯首過清除效應，肝臟內首過效應帶來藥物濃度增加，主要以導致肝細胞炎性水腫為主，肝細胞壞死少見，因此肝酶譜升高不顯著，但碘化油或明膠海綿栓塞肝臟血管，導致肝細胞缺血，加上其緩釋作用導致局部持續(xù)高濃度藥物，使大量肝細胞凝固性壞死，肝酶譜升高。局部穿刺注射藥物僅在肝臟局部滲透，導致局部藥物濃度很高，肝細胞水腫壞死顯著，但損傷范圍較局限，因此釋放入循環(huán)的轉氨酶不多。

需要特別提出的是，碘化油為末梢性永久栓塞劑，其栓塞有效管徑為50 μm，而明膠海綿顆粒粒徑多在350～800 μm，因此C組實驗兔肝細胞壞死程度要比D組嚴重。此外，本實驗為非荷瘤預實驗，考慮到實驗兔需要存活、肝動脈超選擇插管困難等因素，均將微導管選擇性插至肝固有動脈，對肝臟行彌漫性栓塞，因此栓塞劑劑量比臨床治療腫瘤超選擇插管后所用劑量保守得多。人體血管相對兔血管，超選擇插管栓塞要容易得多，且通常追求致密栓塞，使腫瘤壞死效應更加顯著。但如果臨床治療過程中不能超選擇插管，將等劑量藥物灌注或栓塞至較小肝區(qū)，由于首過效應，肝細胞得以較長時間主動攝取雷替曲塞并在細胞內大量蓄積，加上其超長半衰期，對正常肝組織損傷效應值得關注。本研究通過肝功能、組織學及藥動學變化檢測已能提示這種效應。本研究認為，可根據插管程度及腫瘤大小適當調整雷替曲塞及栓塞劑用量，尤其以雷替曲塞總劑量小于靜脈給藥推薦量為宜。

本研究不足之處：①未用其它藥物作對照實驗。實驗初期已設計雷替曲塞與欖香烯脂質體平行對照，但研究經費等原因，實驗被分拆進行，有待今后在荷瘤動物實驗中對照進行。②樣本量不足、未行超選擇插管、未行致密栓塞，使得肝功能和組織學變化間不匹配、未設立單純碘化油及明膠海綿栓塞組、未設計正常肝組織對雷替曲塞濃度耐受梯度等。

綜上所述，經動脈灌注臨床等效劑量雷替曲塞顯示有明顯的首過效應。臨床上經肝動脈或直接穿刺注射雷替曲塞，應根據插管程度及腫瘤大小調整應用劑量。

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