許 瓊，李文靜△，田芯瑗，徐紅星，吳冬生，許華英

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院本部檢驗科 215168;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)專業(yè)，江蘇蘇州 215000)

人乳頭瘤病毒(HPV)是乳多空病毒科的一組DNA病毒，目前已鑒定出140多種HPV基因型[1]。人類是HPV唯一宿主，男女老少皆可被感染。除低危亞型(LR-HPV)主要感染手、足皮膚，口腔黏膜和泌尿生殖道上皮細(xì)胞等引起疣變外，高危亞型(HR-HPV)致癌性較強，可引起包括宮頸癌、口咽部和口腔舌鱗狀細(xì)胞癌[2]、外陰癌[3]、頭頸癌等在內(nèi)的惡性病變[4]。因此，HPV基因分型檢測對于高危人群疾病的預(yù)防、早期診斷、治療方案制訂和疫苗的開發(fā)應(yīng)用等具有重要指導(dǎo)意義。

HPV-DNA的提取是各種基于核酸技術(shù)進行HPV分型的基礎(chǔ)，其提取效率的高低直接影響檢測結(jié)果和臨床診療。本研究采用成熟的流式熒光雜交技術(shù)進行多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)后續(xù)的雜交分型[5-6]，借助臨床常規(guī)宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本及棉拭子標(biāo)本，體外模擬溶血環(huán)境進行了基于手工提取的煮沸法和基于Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)的磁珠法在核酸提取中的比較，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 標(biāo)本來源于南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院婦科、宮頸門診、皮膚性病科、泌尿及生殖科門診患者。收集96份常規(guī)宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本、30份皮膚及男性生殖道拭子標(biāo)本進行試驗。采集血紅蛋白(Hb)水平為136 g/L的患者血常規(guī)標(biāo)本，用未采樣脫落細(xì)胞保存液分別稀釋至68.00、34.00、17.00、8.50、4.25、2.13、1.06及0.53 g/L備用。

1.2儀器與試劑 磁珠法核酸提取試劑來自上海浩源生物科技有限公司；煮沸法HPV核酸提取試劑、HPV核酸擴增試劑、流式熒光雜交法HPV分型試劑盒及宮頸脫落細(xì)胞保存液來自上海透景生命科技有限公司；酚抽提法試劑盒來自江蘇泰州碩世生物科技有限公司。儀器主要有Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)(美國Perkin Elmer公司)、Verriti 96孔梯度PCR儀(美國ABI公司)、Luminex200流式熒光點陣儀(上海透景生命科技有限公司)、Bioer恒溫金屬浴等。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 所有標(biāo)本采集均經(jīng)醫(yī)師征得患者同意并承諾保護患者隱私。宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本：先用棉拭子輕輕拭去宮頸口分泌物，再用專用采樣刷插入宮頸內(nèi)1～2 cm，緊貼宮頸口，稍用力轉(zhuǎn)動3圈，將采樣刷放入標(biāo)本保存液中，輕搖洗滌數(shù)次，以便得到盡可能多的宮頸脫落細(xì)胞；皮膚脫落細(xì)胞采用無菌棉拭子，反復(fù)擦拭病變部位獲得；泌尿生殖系統(tǒng)標(biāo)本采用無菌棉拭子插入陰莖內(nèi)1～2 cm，輕輕旋轉(zhuǎn)2圈停留1～2 min以獲得足夠多的分泌物。

1.3.2HPV-DNA提取 (1)磁珠法：將標(biāo)本充分混勻，轉(zhuǎn)移500 μL至標(biāo)本管，置于Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)標(biāo)本架(標(biāo)本需要量300 μL，一次可檢測96份標(biāo)本)。標(biāo)本首先經(jīng)過抽提液的裂解釋放HPV-DNA，再在磁珠的吸附作用和電磁場作用下，經(jīng)過2次洗滌充分去除雜質(zhì)，最后經(jīng)洗脫液使HPV-DNA與磁珠分離，含有HPV-DNA的洗脫液用于PCR擴增。(2)煮沸法：將標(biāo)本充分混勻，取300 μL至EP管，13 000 r/min離心5 min吸棄上清液，加核酸提取液200 μL充分振蕩混勻，100 ℃裂解10 min，13 000 r/min離心5 min，上清液用于PCR擴增。(3)酚抽提法：將標(biāo)本充分混勻，取300 μL至EP管，13 000 r/min離心5 min吸棄上清液，加400 μL裂解液反復(fù)抽打，利用吸附柱2次洗滌去除雜質(zhì)，換新收集管，加50 μL洗脫液洗脫吸附柱上的DNA用于PCR擴增。

1.3.3HPV-DNA擴增 取5 μL HPV-DNA模板加入分裝好的擴增試劑，總體系20 μL，按下列條件進行多重PCR擴增：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s 5個循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s 30個循環(huán)。

1.3.4雜交與檢測 將擴增后的DNA產(chǎn)物與探針進行雜交，不同型別的HPV結(jié)合到不同的探針上去，待測的DNA產(chǎn)物再與熒光物質(zhì)藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-PE)結(jié)合，進行流式分析檢測。通過判斷何種編碼微球及熒光強度，得到數(shù)字化結(jié)果，通過專用軟件分析確定HPV型別。條件：取擴增產(chǎn)物3 μL，加入22 μL微球雜交液95 ℃ 5 min，48 ℃ 30 min；加入SA-PE 75 μL，48 ℃孵育15 min。Globin信號值低于150表示試驗失敗，信號值為150～<300為弱陽性，信號值≥300為陽性。

1.3.5抗Hb干擾試驗 將4份無Hb污染的HPV-58型陽性患者標(biāo)本混合并分裝成18管(磁珠法與煮沸法各9管，每管300 μL)，13 000 r/min離心5 min吸棄上清液后分別加入上述9種不同水平的Hb保存液300 μL，-20 ℃反復(fù)凍融后進行HPV-DNA提取。

2 結(jié) 果

2.1兩種核酸提取方法結(jié)果比較 將96份臨床標(biāo)本混勻后各取300 μL用磁珠法和煮沸法進行核酸提取。兩種核酸提取方法檢測結(jié)果一致率為91.7%(88/96)，8份標(biāo)本檢測不一致，采用酚抽提法進行驗證，結(jié)果與磁珠法一致，均為弱陽性(信號值為150～<300)。磁珠法內(nèi)參Globin及陽性標(biāo)本HPV亞型信號值均顯著高于煮沸法(t=8.807、4.676，P<0.05)。見表1。

表1 兩種核酸提取方法檢測結(jié)果比較(n)

2.2抗Hb干擾試驗 體外模擬不同Hb水平的血性標(biāo)本，采用兩種方法進行核酸提取，檢測結(jié)果及信號值見表2，當(dāng)Hb水平大于17 g/L時，煮沸法HPV-58分型失?。欢胖榉ú皇蹾b干擾。

表2 不同Hb水平下兩種核酸提取方法的檢測結(jié)果(信號值)

2.330份棉拭子標(biāo)本檢測結(jié)果 將30份棉拭子浸泡在700 μL生理鹽水中10 min充分洗脫細(xì)胞，混勻后各取300 μL進行檢測。兩種方法均成功檢出內(nèi)參Globin 24份標(biāo)本(80.0%)，5份標(biāo)本均檢測失敗。另外，磁珠法HPV陽性率為54.2%，而煮沸法為41.7%(P=0.564)。見表3。

表3 30份棉拭子標(biāo)本檢測結(jié)果(n)

3 討 論

隨著人們健康意識的增強，HPV篩查項目得到普及，檢查量與日俱增。迄今為止，HPV篩查不僅應(yīng)用于女性婦科疾病[7]、皮膚性病檢查[8]，還廣泛應(yīng)用于男性泌尿及生殖系統(tǒng)疾病檢查[9]。多重PCR-流式熒光雜交技術(shù)檢測HPV-DNA分型在臨床中已廣泛應(yīng)用[5-6]，但在實際工作中，影響因素較多，如實驗室條件、實驗人員技術(shù)、標(biāo)本狀態(tài)等。日常工作中發(fā)現(xiàn)，雖然嚴(yán)格遵循采樣操作程序或避開經(jīng)期取樣，相當(dāng)部分患者的脫落細(xì)胞標(biāo)本仍帶有明顯血性，這可能是采樣不慎，或更多由于采樣部位發(fā)生病變所致。而皮膚科患者及男性患者所采集的棉拭子標(biāo)本通常細(xì)胞含量較少。血性標(biāo)本、細(xì)胞量少的標(biāo)本可通過影響核酸提取的質(zhì)和量導(dǎo)致檢測失敗，因此采用純度好、效率高的核酸提取技術(shù)至關(guān)重要。為此，本研究對基于手工提取的煮沸法和基于Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)的磁珠法的核酸提取效率進行了比較，旨在解決檢驗工作中的實際問題，更好地服務(wù)臨床。

D′SOUZA等[10]指出，盡管是來源于同一份HPV標(biāo)本，前處理方法的不同也會導(dǎo)致HPV分型的差異。為使結(jié)果具有可比性，本研究在試驗設(shè)計上除核酸提取過程不同外，其余操作包括標(biāo)本量、模板上樣量、擴增試劑、擴增程序及結(jié)果讀取均相同。對比試驗顯示，兩種方法結(jié)果一致性為91.7%，說明兩種核酸提取方法具有可比性；而8份結(jié)果不一致的標(biāo)本，經(jīng)酚抽提法驗證，其結(jié)果與磁珠法一致，均為弱陽性，說明磁珠法對于病毒表達量低的標(biāo)本更敏感。磁珠法內(nèi)參Globin及HPV亞型信號值均顯著高于煮沸法也支持上述觀點。

通過體外模擬不同程度溶血環(huán)境發(fā)現(xiàn)，Hb對以煮沸變性為原理的核酸檢測技術(shù)存在干擾，而對以磁珠法為提取原理的檢測則無干擾，并且各種Hb水平下的信號值相差不大。研究表明，標(biāo)本中的紅細(xì)胞可通過血紅素的卟啉環(huán)與Taq酶產(chǎn)生不可逆結(jié)合而抑制Taq酶的活性，導(dǎo)致PCR反應(yīng)受到抑制。溶血血清和非溶血血清其乙型肝炎病毒(HBV)-DNA熒光定量PCR檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[11]。而謝秋華等[12]研究得出，HPV-DNA擴增檢測結(jié)果不受溶血標(biāo)本影響，可能與其實驗的最高Hb水平僅為10 g/L有關(guān)。

本課題組認(rèn)為，溶血會抑制PCR反應(yīng)毋庸置疑，不同學(xué)者得出的不同結(jié)論主要取決于所用核酸提取方法是否能有效去除各種抑制物。本研究中的煮沸法操作簡便，但提取過程無純化步驟，黏蛋白、免疫球蛋白、蛋白酶和多糖等內(nèi)源性PCR抑制物無法去除，通過干擾核酸提取過程的細(xì)胞裂解或者通過抑制DNA聚合酶活性而干擾PCR反應(yīng)[13]。而磁珠法首先將游離的核酸分子特異地吸附到磁性顆粒表面，與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離，在磁場作用下經(jīng)過2次洗滌，血紅素中的卟啉環(huán)和黏蛋白等干擾物均能被有效去除，從而保證核酸提取的高純度。酚抽提法則是以吸附柱為純化介質(zhì)，其亦能有效去除雜質(zhì)，檢測結(jié)果支持磁珠法。

對于棉拭子標(biāo)本，實際工作中檢測失敗的概率較高，本研究中30份標(biāo)本有5份標(biāo)本采用兩種方法均檢測失敗，說明采樣失敗的可能性極大，結(jié)果報告為內(nèi)對照信號低。而成功檢測的24份標(biāo)本中，磁珠法的陽性率高于煮沸法，雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，仍可說明在細(xì)胞含量較少的情況下，磁珠法能夠更加充分地提取標(biāo)本核酸，從而提高檢測的敏感度和結(jié)果準(zhǔn)確度。

美國Perkin Elmer公司生產(chǎn)的Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)，是由美國Janus全自動加樣平臺和德國Chemgic磁珠提取技術(shù)綜合而成，一次性可處理96份標(biāo)本，實現(xiàn)了磁珠法提取的全自動化，順應(yīng)了實驗室檢測自動化的發(fā)展趨勢。該平臺還可進行血清DNA的提取用于HBV-DNA定量檢測[14]，用途廣泛。

與煮沸法相比，磁珠法提取的核酸純度更高，提取效率更高，能夠提高下游檢測敏感度，在臨床常見血性標(biāo)本和皮膚、泌尿生殖道棉拭子標(biāo)本HPV的核酸檢測中具有明顯優(yōu)勢。全自動平臺的使用能減少人力、物力成本，避免人為失誤，提高工作效率。綜上所述，基于Pre-NAT全自動核酸提取系統(tǒng)的磁珠法操作簡便、規(guī)范，檢測通量高，抗干擾能力強，更適應(yīng)于臨床。

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